Name: Induction transurétrale dinfection des voies urinaires souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Découvrez l'induction transurétrale d'infection des voies urinaires chez la souris. Cette méthode permet d'inoculer des souches bactériennes et de quantifier l'infection à partir d'échantillons d'urine et de tissus.

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Les auteurs tiennent à remercier Shelly Xie et Jennifer Payne pour leur assistance technique d&#39;experts. Ce travail a été rendu possible grâce à des subventions de la Société d&#39;urologie pédiatrique et le Fonds de recherche de Stanford en pédiatrie.

I. Préparation de sonde urétrale <ol><li> Pour chaque vessie et du rein de souris à échantillonner, placez 5-6 billes en acier inoxydable (vessie, 1,6 mm ou de 0,9 à 2,0 la taille mélange mm) ou des billes d'oxyde de zirconium (rein, 0,5 mm taille) dans un tube cryovial, respectivement. Autoclaver les tubes de perles contenant. </li><li> Après les tubes refroidir à température ambiante, ajouter 200 microlitres de PBS stérile à chaque acier billes contenant le tube inox et 400 microlitres de PBS stérile à chaque oxyde de perles tube contenant du zirconium. </li><li> Nous préparons sonde urétrale décrite par Hung et Hultgren 13. Autoclave une paire propre de tête plate pinces et de ciseaux fins (iris ou de type similaire) et permettre les instruments à refroidir à température ambiante. Essuyez les surfaces d'une hotte à flux laminaire avec de l'éthanol à 70%. Dans la hotte, couper un 30 cm (approximative) du segment de tuyau en polyéthylène. Aseptiquement place une aiguille de calibre 30 stériles (1 / 2 pouces longue aiguille) sur une seringue stérile de 3 cc. Ramassez une extrémité du tuyau de polyéthylène coupés avec des pinces à l'autoclave et faites glisser le tube sur l'aiguille jusqu'à ce qu'il rencontre le moyeu. Couper le tube de telle sorte que d'environ 2 cm s'étend au-delà de la pointe de l'aiguille. Retirer le cathéter de la seringue et le placer dans une boîte de Pétri stérile. </li><li> Pour réduire la probabilité de contamination croisée, nous faisons un cathéter pour chaque souris. Après tous les cathéters sont faites, les stériliser par une exposition dans un plat de Pétri découverts à une irradiation UV pendant au moins 30 minutes. Ne pas regarder directement les lampes UV ou exposer toute partie du corps dans la hotte tandis que les lampes sont activées. Après exposition aux UV, les cathéters peuvent être stockées à long terme dans la boîte de Pétri. Nous vous recommandons de sceller le plat avec du parafilm pour aider à maintenir la stérilité. </li></ol> II. Inoculation à l'animal <ol><li> Souris doivent arriver au moins une semaine avant la manipulation expérimentale, afin d'éviter le stress induit par des facteurs confondants. Des souris femelles sont utilisées car l'urètre souris mâle est extrêmement difficile à cathétériser. CBA / J est une couramment utilisées, l'UTI sensibles souche de souris consanguines. Souris devrait être utilisé entre 8 et 12 semaines d'âge, puisque c'est la fenêtre de la maturité immunologique avant la sénescence. Le premier jour de l'expérience, tremper le bout d'une anse stérile inoculation dans un flacon de stock bactériennes congelées. Racler un petit inoculum et hors série sur une plaque de gélose appropriée. Généralement uropathogènes, E. coli (UPEC) et d'autres souches peuvent être cultivées pendant une nuit sur ​​le milieu de Luria-Bertani (LB) d'agar à 37 ° C dans l'air ambiant. UPEC souches poussent aussi solide, blanc-jaunâtre colonies translucides sur gélose LB. Remettre immédiatement le stock bactérienne au congélateur. Souches uropathogènes bactérienne peut devenir moins virulent dans le temps avec répétées, les cultures de série. Par conséquent, nous recommandons de stries sur une gélose fraîche pour chaque expérience. </li><li> Le jour 2 de l'expérience, après avoir confirmé la morphologie des colonies bon, ramasser des colonies isolées à partir de plaques d'agar et le lieu dans au moins 5 cc de bouillon de culture pendant la nuit. Bouillon LB peut être utilisé pour la plupart des souches bactériennes uropathogènes (37 ° C, 200 rpm dans l'air ambiant). Gardez les bouchons en vrac sur les tubes de bouillon de culture pour permettre l'aération. </li><li> Au jour 3 de l'expérience, de prendre 10% du bouillon de culture première et culture dans un bouillon à nouveau pendant la nuit (généralement 37 ° C et 200 rpm), pour améliorer l'expression de type I pili. Cultures de bouillon de série permet d'optimiser uropathogenicity bactérienne, car les pili de type I a été démontré pour être un facteur de virulence essentiel pour uropathogènes in vivo 1. Gardez les bouchons en vrac sur les tubes de bouillon de culture pour permettre l'aération. </li><li> Au jour 4, de l'expérience, mesurer la DO 600 de la culture en bouillon du jour 3. S'il n'est pas déjà connu pour la souche bactérienne testée, effectuez dix fois plaquage de dilution en série sur au moins 7 logs (dilutions effectuées avec du PBS, les cultures effectuées sur gélose LB, 37 ° C une nuit d'incubation) pour déterminer la relation entre la DO 600 et CFU / ml. En règle générale, une DO 600 de 0,4-0,5 correspond généralement à la 1-2x10 7 cfu par 50 microlitres. Une fois la relation entre l'OD 600 et UFC / ml a été déterminée, on peut ajuster le bouillon de culture à la DO 600 correspondant à l'ufc désiré par souris dans 50 microlitres de PBS. Certains travaux ont suggéré que l'inoculation de 10 microlitres, plutôt que 50, conduit à moins de reflux dans l'kidneys6. Cependant, la plupart des publications ont rapporté l'utilisation de 50 microlitres par souris. Généralement, les gammes ufc souhaitée entre 10 6 et 108 ufc / souris, mais chaque combinaison souche bactérienne / souris doit être empiriquement testée in vivo. </li><li> Pour aider à s'assurer que les inoculums ne sont pas annulés immédiatement après l'instillation, les souris doivent être privés d'eau pendant au moins 30 minutes avant l'induction de l'anesthésie générale. Une autre manoeuvre clé est d'induire la miction avant l'induction de l'anesthésie par gommante souris et en appuyant doucement la partie inférieure Abdomfr. Deux à 2,5% d'isoflurane est une dose d'induction sûre pour les 8-12 semaines vieilles souris CBA féminine, suivie par l'anesthésie de maintenance avec 1,8 à 2% d'isoflurane. </li><li> Une fois l'anesthésie est réalisée, les souris sont placées en position couchée avec leur tête inséré dans une coiffe connecté à l'isoflurane contenant de l'oxygène. Le bas-ventre est massé pour évacuer l'urine de la vessie. Si la vessie est relativement vide, cette manoeuvre peut ne pas donner l'urine. Le bas de l'abdomen et du périnée est imbibé d'éthanol à 70%. </li><li> Une seringue de 1 cc stérile sans aiguille est utilisée pour établir l'inoculum désiré bactérienne. Ensuite, un cathéter stérile urétrale est aseptiquement placés sur la seringue. L'excès de tube est coupé le cathéter avec une paire de ciseaux de telle sorte que seulement 1-2 millimètres de tubes restent en aval de la pointe de l'aiguille. Ensuite, la seringue est taraudé et le piston enfoncé avec la seringue verticale pour enlever toutes les bulles. Une cuillerée de gelée de lubrification bactériostatique est aspergé sur une boîte de Pétri stérile ou à l'intérieur de l'enveloppe seringue stérile. L'extrémité du cathéter (avec une seringue jointe) est plongé dans la gelée. Si plusieurs souches bactériennes sont actuellement testés dans la même expérience, faites attention à ne pas utiliser la même goutte de gelée pour lubrifier les cathéters contenant des souches différentes. </li><li> En utilisant un microscope stéréo (0,8 x au zoom 5x) pour l'agrandissement, le capuchon du clitoris de la souris anesthésiée est doucement saisi dans la main non dominante avec une paire de pinces à dents fines et soulevé céphalique pour exposer le rose profond méat urétral ( Figure 1). La seringue (avec cathéter attaché) est saisi dans la main dominante avec un grip crayon et l'extrémité du cathéter est engagé dans le méat urétral à un angle de 45 degrés. Le capuchon du clitoris est tendu dans l'axe de la seringue, de manière efficace "chargement" de l'urètre sur le cathéter. Cette manœuvre est essentielle puisque l'urètre de la souris est redondante. Le cathéter doit glisser facilement dans la vessie (jusqu'à la plate-forme, la figure 2), et peut être doucement tournoyé pour aider à naviguer dans les plis redondants de l'urètre. Une fois le cathéter S'articulant, la seringue peut être abaissé jusqu'à ce qu'il soit parallèle à l'axe longitudinal de la souris. La main non dominante peut descendre la pince pour aider à stabiliser la position du cathéter et la seringue que la main dominante est utilisée pour injecter lentement l'inoculum (au moins 5 secondes). Si le fluide est considéré coule autour du cathéter pendant l'injection, soit la vessie est pleine ou le cathéter est dans le vagin (juste caudale de l'urètre). L'injection doit être immédiatement arrêté et la position du cathéter soigneusement examinée. Si le cathéter a été dans l'urètre, la souris étant donné devraient pas être inclus dans l'expérience. D'autre part, un cathéter égaré dans le vagin peuvent être repositionnées et l'injection ré-essayé. Après l'injection, le cathéter et la seringue est lentement retiré de la souris. </li><li> Pour réduire la probabilité du début de la miction post-inoculation, ce qui peut évacuer les bactéries administrés et ainsi conduire à des niveaux d'infection variable, certains chercheurs maintiennent souris sous anesthésie pendant 30 minutes après inoculation10 transurétrale. Après la chirurgie, les souris doivent récupérer sur une couverture chauffante nettoyer avec une observation continue pour confirmer le retour des modèles de respiration et d'activité normale. Une fois que les animaux ont complètement récupéré la capacité de ramper, ils peuvent être retournés à la literie contenant des cages. </li></ol> III. UFC mesure dans les tissus infectés <ol><li> Diverses publications de souris UTI ont rapporté les résultats de culture de 6 heures à une semaine ou plus après l'inoculation. Les points de temps optimal doivent être déterminées empiriquement pour chaque combinaison de souche / souris bactérienne. Urine émise est obtenue pour la culture en gommante souris sur une boîte de Pétri stérile. Urines collectées doivent être conservés sur la glace en tout temps. De multiples tentatives pour obtenir l'urine annulés pendant plusieurs heures peut être nécessaire, puisque la souris est mictions fréquentes, de faible volume (30-100 microlitres par void), et le stress-dépendante. </li><li> Après l'obtention d'échantillons d'urine annulée, nous sacrifions les souris par dislocation cervicale et de l'isoflurane. L'abdomen est ouvert de façon aseptique. Si un échantillon d'urine a été annulée pas réussi à obtenir plus tôt, une petite quantité d'urine peut souvent être aspiré à travers la paroi de la vessie à l'aide d'une aiguille de calibre 30 et une seringue. </li><li> Un ou deux reins sont retirés, émincées dans au moins 4 pièces (chaque pièce doit être inférieure à 50 microgrammes) sur une boîte de Pétri stérile, et placés dans le zirconium billes / PBS contenant cryotubes sur la glace. La vessie est enlevée, hachée en au moins quatre morceaux, et placés dans des billes d'acier inoxydable / PBS contenant cryotubes sur la glace. Le tissu / perle / PBS contenant cryotubes sont placés dans un homogénéisateur Bullet Blender et les tissus sont homogénéisés à l'aide du "8" réglage de la vitesse pendant une minute. Il est fréquent que certains fragments de tissus de rester après homogénéisation. Aussi longtemps que 50-100 microlitres d'homogénat liquide peut être pipeté, fragments solidesne sont pas nécessairement un problème. Si le temps d'homogénéisation est augmenté pour certains échantillons, il est essentiel de le faire pour tous les tissus afin de maintenir la cohérence de l'homogénéisation. Nous utilisons un Bullet Blender homogénéisateur car il évite la possibilité de contamination croisée, est plus rapide que le traitement des échantillons individuels, un par un en utilisant un homogénéisateur standard, et ne modifie pas significativement la chaleur les échantillons étant homogénéisé. </li><li> Au moins deux ou trois à dix dilutions d'urine recueillis et homogénats de tissus devrait être réalisé dans une plaque de microtitration. Pour les expériences préliminaires, il peut être prudent de faire au moins sept à dix dilutions. Culture jusqu'à 100 microlitres d'urine, la vessie et / ou des homogénats de rein sur gélose appropriée. Depuis les échantillons d'urine peuvent être à volume limité, il peut être nécessaire d'apporter leurs volumes à 100 microlitres avant d'effectuer dix dilutions. Si cela est nécessaire, la dilution initiale (avant dix-dilution) devront être pris en compte dans les calculs définitifs des rendements bactérienne. Nous préférons UPEC culture sur l'éosine-bleu de méthylène ou gélose de MacConkey (une nuit d'incubation à 37 ° C), car ces médias sont sélectifs pour les germes à Gram négatif. UPEC souches poussent sur gélose de MacConkey que centralement ombiliquées, rouge-rose colonies en raison de leur capacité à fermenter le lactose. </li><li> Après une nuit de culture, compter le ufc pour chaque plaque. Pour les échantillons dilués en série, la dilution plaque contenant 50-100 colonies est considéré comme le résultat le plus précis. "Retour" calculer ufc par les tissus, par milligramme de tissu, ou par ml. </li></ol> IV. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Méat urétral (sombre tissu rose) exposées par la levée capuchon du clitoris céphalique avec une pince (au-delà haut de la photo) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Cathétérisés urètre. Le clitoris bifide peut être vu juste au-dessus du cathéter. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Vessie Figure 3. Ufc compte 2 jours après l'infection transurétrale de 8 semaines vieilles femelles souris CBA / J avec uropathogènes E. coli. Vessies ont été homogénéisés et ufc / ml déterminée par dilution et étalement sur gélose MacConkey série. Diamants indiquent ufc / ml pour chaque souris, la barre horizontale indique médiane ufc / ml.

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L&#39;induction d&#39;infection des voies urinaires de la souris par inoculation transurétrale de bactéries est une procédure établie de longue date, mais techniquement exigeante 11. Hung et Hultgren récemment publié une excellente analyse des techniques d&#39;infection des voies transurétrale de souris urinaires 13. Dans ce papier, nous tentons d&#39;illustrer davantage les subtilités de cette approche expérimentale. Les novices peuvent pratiquer leur technique en réal...

<table><tbody><tr><td>Tubes cryogéniques, 2,0 ml en polypropylène (sans bouchons)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons pour tubes cryogéniques, avec joint torique &amp;rsquo;O&amp;rsquo;</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Perles d'oxyde de zirconium (0,5 mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Perles en acier inoxydable (1,6 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de perles en acier inoxydable (0,9-2,0 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Souris CBA/J femelles, âgées de 8 à 12 semaines</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4,3 mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1,4 mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>Agar LB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bouillon LB</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Platines d'inoculation</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>Poudre d'agar éosine-méthylène bleu (EMB)</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>Poudre d'agar MacConkey</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>Poudre d'agar LB</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Tubulure en polyéthylène non radiopaque Intramedic, PE10 [diamètre intérieur 0,28 mm (0,011 pouce) ; diamètre extérieur 0,61 mm (0,024 pouce)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles 30 gauge, 1/2 pouce</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Seringue tuberculinique de 1 ml à embout Slip-Tip</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer-Lock de 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

induction transurétrale d&#39;infection des voies urinaires souris

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Souches uropathogènes bactériennes d&#39;intérêt sont cultivés sur gélose. Généralement, uropathogènes<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) et d&#39;autres souches peuvent être cultivées pendant une nuit sur le milieu de Luria-Bertani (LB) d&#39;agar à 37 ° C dans l&#39;air ambiant. Souches UPEC grandir comme blanc-jaunâtre colonies translucides sur gélose LB. Après confirmation de la morphologie des colonies échéant, des colonies isolées sont ensuite repris pour être cultivées dans le bouillon. Bouillon LB peut être utilisé pour la plupart des souches bactériennes uropathogènes. Deux ports série, la nuit cultures de bouillon LB peut être employé pour amplifier l&#39;expression de type I pili, un facteur de virulence bien définis pour les bactéries uropathogènes. Les cultures en bouillon sont diluées à la concentration voulue en tampon phosphate salin (PBS). Huit à 12 semaines vieilles souris femelles sont placées sous anesthésie à l&#39;isoflurane et transurethrally inoculés avec des bactéries à l&#39;aide de polyéthylène recouvert de tubes de 30 seringues de calibre. Inoculums typiques, qui doit être déterminé empiriquement pour chaque combinaison de souche / souris bactérienne, sont de 10<sup&gt; 6</sup&gt; À 10<sup&gt; 8</sup&gt; UFC par souris dans 10 à 50 microlitres de PBS. Après la période d&#39;infection désiré (une journée à plusieurs semaines), les échantillons d&#39;urine et de la vessie et les deux reins sont récoltés. Chaque organe est hachée, placé dans du PBS, et homogénéisé dans un homogénéisateur Bullet Bleu. Homogénats d&#39;urine et les tissus sont dilués en série dans du PBS et cultivées sur gélose appropriée. Le jour suivant, les unités formant colonies sont comptées.

Cette vidéo va montrer des méthodes pour induire des infections de souris transurethrally des voies urinaires et de quantifier l&#39;ampleur des infections résultant.

Induction transurétrale d&#39;infection des voies urinaires souris

Les souches bactériennes uropathogènes d'intérêt sont cultivées sur gélose. En général, les souches d'E. coli uropathogènes (UPEC) et d'autres souches peuvent être cultivées pendant une nuit sur ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire une infection des voies urinaires chez la souris par voie transurétrale. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant les souches bactériennes d'intérêt et en diluant les cultures à la concentration souhaitée. La deuxième étape de la procédure consiste à inoculer la vessie de la souris par voie transurétrale avec les souches bactériennes d'intérêt.La troisième étape de la procédure consiste à prélever des échantillons d'urine et à récolter les reins et les vessies. La dernière étape de la procédure est l'inoculation de plaques à vis avec les échantillons d'urine ainsi que des reins et des vessies homogénéisés. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant une infection réussie du tractus urinaire en fonction de la présence de colonies bactériennes dans les échantillons ensemencés.Bonjour, je suis Michael Shea et bienvenue dans mon laboratoire du service d'urologie de la faculté de médecine de l'université Stanford. Je suis Annu ti, également du laboratoire de Shea. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de cathétérisme transurétral chez la souris.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'induction d'une infection des voies urinaires chez la souris. Commençons donc. Dans une hotte à flux laminaire, couper un morceau de tubulure en polyéthylène de 30 centimètres de longueur, puis fixer une aiguille de calibre 30 sur une seringue stérile de trois centimètres cubes.Utilisez des pinces stériles pour saisir une extrémité du tube coupé et faites-le glisser sur l'aiguille jusqu'à ce qu'il atteigne le berceau. Coupez le tube de manière à ce qu'environ deux centimètres dépassent de l'extrémité de l'aiguille. Cela permet de prévenir les blessures chez les souris lors de la cathétérisation.Retirer le cathéter de la seringue et le placer dans une boîte de Pétri stérile. Préparer un cathéter pour chaque souris à infecter. Stériliser les cathéters par irradiation ultraviolette pendant au moins 30 minutes.Sceller une boîte avec du parafilm afin de maintenir le cathéter stérile pendant un stockage à long terme. Étaler sur une boîte d'agar appropriée un inoculum provenant d'une souche bactérienne congelée. Ici, un inoculum d'Escherichia coli uropathogène ou UPEC est étalé pour une croissance nocturne à 37 degrés Celsius.Prélevez des colonies isolées présentant la morphologie appropriée, qui, dans le cas de l'UPEC, sont des colonies solides, jaunâtres et translucides sur gélose LB, et déposez-les dans au moins cinq millilitres de bouillon liquide pour une culture nocturne à 37 degrés Celsius avec agitation à 200 tours par minute. Ajoutez 10 % de la première culture en bouillon à un milieu frais, et faites croître pendant la nuit. Encore une fois, afin d'améliorer l'expression des pili de type 1, associée à la pathogénicité in vivo des souches uropathogènes, mesurez l'OD 600 de la culture pour déterminer le nombre d'unités formant colonies.UFC abrégées par millilitre de culture. Diluer la culture avec du PBS stérile de façon à obtenir une concentration finale comprise entre 10⁶ et 10⁸ UFC dans 10 à 50 microlitres, afin de s'assurer que les inoculats ne soient pas évacués immédiatement. Après l'installation, priver les souris d'eau pendant 30 minutes avant l'anesthésie, saisir la souris par la nuque et appuyer doucement sur l'abdomen inférieur pour favoriser la miction.Placer la souris anesthésiée sur le dos, la tête insérée dans un cône nasal relié à de l'oxygène contenant de l'isoflurane. Masser l'abdomen pour évacuer toute urine résiduelle de la vessie. Utiliser un flacon pulvérisateur pour imbiber d'éthanol à 70 % l'abdomen inférieur et le périnée.Ensuite, utilisez une seringue stérile d'un millilitre pour prélever l'inoculum bactérien. Fixez un cathéter stérile préparé sur la seringue. Utilisez des ciseaux pour couper le tube de manière à ce qu'il dépasse d'un à deux millimètres seulement de l'extrémité de l'aiguille.Cela permet de prévenir les blessures chez les souris pendant la cathétérisation. Tapez sur la seringue et abaissez le piston. Pour éliminer les bulles d'air, lubrifiez le cathéter en le trempant dans une petite quantité de gel lubrifiant bactériostatique. Veillez à utiliser une quantité différente de gel pour chaque souche bactérienne qui sera testée sous un microscope stéréo de dissection.Utilisez une pince à dents fins dans la main non dominante pour saisir délicatement le capuchon clitoridien et le soulever afin d'exposer l'ATU urétrale rose foncé dans la main dominante. Saisissez la seringue munie du cathéter. Avec une prise au stylet, insérez l'extrémité du cathéter dans l'ATU urétrale selon un angle de 45 degrés par rapport à l'abdomen de la souris.Dans le plan sagittal médian. Étirer le capuchon clitoridien le long de l'axe longitudinal de la seringue. Charger efficacement l'urètre sur le cathéter.Le cathéter doit glisser facilement dans la vessie si nécessaire. Faites tourner doucement le cathéter pour aider à franchir les plis redondants de l'urètre. Lorsque le cathéter est en place jusqu'au raccord, abaissez la seringue parallèlement à l'abdomen de la souris.Lâchez la pince et utilisez la main non dominante pour stabiliser le cathéter et la seringue. Injectez lentement l'inoculum pendant au moins cinq secondes. Si un liquide est observé s'écoulant autour du cathéter pendant l'injection, la vessie est pleine ou le cathéter se trouve dans le vagin.Arrêtez l'injection et examinez la position du cathéter. Repositionnez le cathéter dans l'urètre si nécessaire. Après l'injection, retirez lentement le cathéter.Conserver la souris sous anesthésie pendant une demi-heure après l'inoculation. Pour réduire le risque de miction après la chirurgie, laisser la souris se rétablir sur une couverture chauffante propre, sous observation continue afin de confirmer le retour à des rythmes respiratoires normaux et à une activité habituelle. Une fois qu'elle est complètement rétablie et capable de ramper, remettre la souris dans une cage contenant de la litière.En fonction de la combinaison de souches bactériennes et de souris, une infection complète peut prendre entre six heures et une semaine. Pour la mise en œuvre, placez une boîte de Petri stérile sur de la glace pour chaque souris infectée pendant plusieurs heures. Saisissez la souris par la peau du cou au-dessus de la boîte afin de recueillir l'urine pour la culture.50 microlitres d'urine devraient être suffisants. Prélevez l'urine à l'aide d'une pipette et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse, refermez-le et conservez l'urine sur de la glace. Sous le microscope stéréo, placez une souris euthanasiée sur le dos sur un plateau de dissection.Pulvérisez l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux pour pratiquer une incision de trois à quatre centimètres dans la peau et la paroi abdominale sous-jacente. Si nécessaire, utilisez des épingles pour rétracter la paroi abdominale loin des contenus abdominaux.Si les tentatives antérieures de collecte d'urine ont échoué, utilisez une aiguille de calibre 30 et une seringue pour aspirer directement l'urine à travers la paroi de la vessie. Utilisez une pince et des ciseaux pour retirer les reins. Transférez-les dans une boîte de Pétri stérile et hachez chacun en au moins quatre morceaux, d'environ deux à trois millimètres de taille chacun.Transférez chaque fragment de rein dans un tube cryogénique contenant cinq à six billes stériles en oxyde de zirconium de 0,5 millimètre et 400 microlitres de PBS stérile. Conservez les échantillons de rein sur de la glace. Utilisez une pince et des ciseaux pour retirer la vessie.Hacher la vessie en utilisant la même méthode que pour les reins. Transférer chaque fragment de vessie dans un tube cryogénique contenant des billes d'acier inoxydable de 1,6 millimètre et 200 microlitres de PBS stérile, et maintenir les tubes sur de la glace. Placer les tubes dans un homogénéisateur à balles, puis homogénéiser le tissu à la vitesse huit pendant au moins une minute.Il est courant que certains fragments de tissu persistent après l'homogénéisation. Tous les échantillons doivent être homogénéisés pendant la même durée dans une plaque de microtitration. Effectuez des dilutions sériées dix fois avec l'urine recueillie et l'homogénat de tissu sur glace.Étendre du PBS froid. Terminer la dilution. Ensemencer sur des boîtes appropriées et faire croître toute la nuit à 37 degrés Celsius.Les UFC par organe, par milligramme de tissu ou par millilitre d'urine peuvent être recalculées à partir du nombre de colonies sur chaque plaque. Nous utilisons ces techniques pour étudier comment des mutations dans les réponses bactériennes au stress influencent la capacité de l'UPEC à provoquer une infection urinaire in vivo, ainsi que sa résistance aux antibiotiques administrés à des souris infectées. Ce tableau montre la capacité de l'UPEC de type sauvage à infecter la vessie de souris après une inoculation transurétrale.Nous venons de vous montrer comment induire transversalement des infections urinaires chez la souris. Lors de cette procédure, il est important de cathétériser délicatement les souris. Une technique adéquate permet une cathétérisation facile, mais peut nécessiter de la pratique.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Source : Conover, M. S., et al., J. Établissement et caractérisation des infections urinaires et de la maladie des urines dans un modèle murin. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la procédure pour assembler et implanter un cathéter transurétral chez une souris femelle, suivie d’une inoculation bactérienne pour établir une infection urinaire associée au cathéter et étudier les interactions hôte-pathogène médiées par biofilm.

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Source : Conover, M. S. et al., Établissement et caractérisation des infections urinaires et de la CAUTI dans un modèle murin. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la détection de communautés bactériennes intracellulaires (IBC) dans le tissu vésique de souris infecté par Escherichia coli exprimant β-galactosidase. Après fixation tissulaire, perméabilisation et coloration avec X-gal, les CCI apparaissent sous forme de points bleus sous un microscope disséquant, confirmant l’invasion bactérienne...

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