Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré

L’étude de la réponse cellulaire en temps réel à la stimulation mécanique est réalisée en cultivant d’abord des cellules exprimant des protéines de fusion GFP sur des plats à fond de verre pendant 24 heures. La deuxième étape consiste à enduire l’embout A FM de fibronectine biotinylée. Ensuite, l’extrémité FM fonctionnalisée est mise en contact avec la surface cellulaire pour permettre la formation d’une forte adhésion focale autour de l’extrémité A FM, permettant une manipulation directe du cytosquelette d’acte par le biais d’une liaison entre l’extrémité enrobée de fibronectine et la cellule.

La dernière étape consiste à stimuler mécaniquement la cellule vivante par un mouvement contrôlé vers le haut de la pointe A FM, de sorte que la force verticale soit appliquée au point de contact de la cellule sans rompre la forte adhérence focale. En fin de compte, les résultats montrent que les cellules répondent à la stimulation mécanique en renforçant leur attachement au substrat et en induisant la réorganisation du cytosquelette d’actine telle qu’enregistrée avec l’imagerie optique de fluorescence en temps réel. Bonjour, je suis Andrea Trake, professeure adjointe au Département de biologie des systèmes et de médecine translationnelle au Texas a and m Health Science Center.

Bonjour, je m’appelle Sum Lim. Je suis boursier postdoctoral au Département de biologie des systèmes et de médecine translationnelle au Texas a and m Health Science Center. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour étudier le remodelage cellulaire adaptatif à la stimulation mécanique.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le remodelage cytosquelettique en temps réel dans les cellules musculaires lisses vasculaires vivantes. Alors, commençons. Pour ces études, un microscope Olympus IX 81 inversé avec une fluorescence à réflexion interne totale ou une fixation sur gazon combiné à une tête de balayage CSU 22 Yokogawa est utilisé.

Un microscope à force atomique Bioscope SZ est monté sur le microscope optique inversé. L’ensemble du système est monté sur une table optique de qualité recherche et a déjà été décrit en détail. Ce microscope intégré utilise deux appareils à couplage de charge multiplicateur d’électrons quantitatifs EM ou des caméras E-M-C-C-D.

L’un est destiné à l’imagerie du gazon et l’autre à l’imagerie confocale. L’ensemble confocal, qui est composé de la roue à filtres externe du scanner à disque rotatif et d’une caméra E-M-C-C-D, est monté sur une plaque de base en aluminium placée sur un tampon en silicone nécessaire à l’amortissement des vibrations. L’ensemble confocal est relié au microscope par une bride avec un collier fileté.

Ainsi, l’ensemble peut être découplé du microscope lors d’une microscopie à force atomique ou d’une mesure FM pour éviter les vibrations du scanner à disque rotatif. Un laser krypton à l’argon est utilisé comme source d’excitation pour les modes d’imagerie sur gazon et confocale. Le laser peut être couplé à l’une des deux fibres optiques, qui acheminent le laser vers la fixation du gazon ou la tête de balayage confocale.

Deuxièmement, les ordinateurs contrôlent le système. L’un utilise un logiciel de diaporamas, qui contrôle l’imagerie optique, et l’autre un logiciel de nanoscope, qui contrôle l’A FM 24 heures avant l’expérience de stimulation mécanique, a placé des cellules vivantes exprimant des constructions GFP ciblées contre des protéines spécifiques dans une boîte de culture cellulaire à fond de verre. Le jour de l’expérience, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu sans rouge de phénol.

Étant donné que l’expérience FM est très sensible au bruit, évitez de parler ou de toucher la table optique ou le microscope pendant l’expérience afin de minimiser le bruit. Dans les mesures a FM, découplez le disque rotatif confocal du microscope. L’expérience commence par le montage de la parabole de culture cellulaire sur une platine FM à l’aide d’un collier magnétique pour fixer la parabole à la platine du microscope magnétique.

Le porte-à-faux en forme de V de la sonde A FM est personnalisé avec la bille de verre biotinylée de deux microns. Le cantilever peut être facilement vu à l’aide du microscope. Le cordon est collé à l’extrémité du cantilever, et c’est là que la solution de revêtement doit être appliquée goutte à goutte.

Pour préparer une sonde FM pour l’expérience, montez d’abord l’embout dans le support de verre, puis placez le support de verre sur le support de table pour enrober l’embout. Lavez l’embout en faisant couler soigneusement 10 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate docos ou DPBS à l’extrémité de l’embout, puis utilisez une lingette kim pour sécher l’embout. Répétez cette procédure cinq fois après le lavage avec DPBS à raison d’un milligramme par millilitre.

Avide de solution. Dropwise sur la pointe. Laissez la pointe incuber pendant cinq minutes après l’enrobage d’avadon.

Lavez la pointe cinq fois de plus avec du DPBS. Ensuite, réticulez la fibronectine biotinylée sur l’avadon en ajoutant une solution d’un milligramme par millilitre. Déposer sur la pointe et laisser incuber pendant cinq minutes.

Enfin, lavez à nouveau la pointe cinq fois avec du DPBS en laissant la dernière goutte sur la pointe. Une fois l’embout préparé, montez-le sur un scanner FM. Après avoir monté l’embout FM, placez une jupe de protection en silicone autour du support.

Installez ensuite le microscope de visualisation vidéo. Ensuite, alignez l’embout FM au centre du champ de vision. Réglez le levier optique en plaçant le faisceau laser à l’extrémité du porte-à-faux.

Changez ensuite l’objectif pour l’objectif à fort grossissement approprié pour l’imagerie de cellule unique. Amenez ensuite la cellule, qui sera stimulée mécaniquement, dans le champ de vision et choisissez un endroit où la pointe A FM doit atterrir sur la surface de la cellule. Enfin, abaissez l’embout FM jusqu’à ce qu’il touche cette cellule spécifique.

Après avoir mis l’embout en contact avec la cellule, attendez environ 20 minutes. Cela permet à une forte adhérence focale de se former au point de contact FM à la surface de la cellule. Après la période d’attente, la procédure de stimulation mécanique peut commencer pour se préparer à l’expérience de stimulation mécanique.

Passez d’une caméra vidéo à une caméra E-M-C-C-D pour permettre de visualiser les cellules fluorescentes pour l’imagerie. Acquérez ensuite une première image de la cellule au repos. Utilisez la microscopie à disque rotatif et la microscopie vocale pour visualiser l’acte dans le cytosquelette dans tout le corps cellulaire.

À l’inverse, utilisez le gazon pour visualiser les adhérences focales afin de stimuler la cellule. Utilisez le porte-à-faux pour appliquer un mouvement ascendant contrôlé par pas discrets toutes les trois à cinq minutes. Lors de l’acquisition des données A FM, il est important que l’opérateur surveille en permanence la tension de la position Z piso afin de déterminer le bon moment pour le pôle vertical.

Simultanément à l’acquisition de données FM, enregistrez une image confocale ou gazon de la cellule après chaque traction verticale à l’aide du logiciel de diaporamas. Enfin, retirez l’embout FM de la cellule à la fin de l’expérience de stimulation. Un transfect de cellules musculaires lisses vasculaires avec l’actine MRFP et vcul.

La GFP a été imagée à l’aide d’une FM à la surface de la cellule apicale. La même cellule a été imagée à l’aide de gazon à la surface de la cellule basale. Ici, les deux images se chevauchent.

Une image de la même cellule a également été acquise à l’aide d’un disque rotatif confocal dans tout le corps cellulaire et est représentée comme une projection maximale d’un empilement 3D. De bons chevauchements entre les images confocales A FM et disque rotatif sont montrés. Sa cellule musculaire lisse vasculaire transfectée avec de l’actine MRFP a été stimulée mécaniquement par l’A FM et imagée par microscopie confocale à disque rotatif.

Les erreurs indiquent des fibres agissant qui montrent une restructuration remarquable lors d’une stimulation FM. Certaines fibres agissent polymériser tandis que d’autres se dépolymérisent en raison de la stimulation mécanique, d’autres fibres agissant se regroupent. En raison de la restructuration d’acte, nous venons de vous montrer comment stimuler mécaniquement une culture de vente de vie à l’aide de l’EFM tout en enregistrant simultanément le réarrangement CY à l’aide de méthodes d’imagerie optique.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que l’expérience FM est extrêmement bruyante et sensible. Donc c’est tout. Merci de nous avoir regardés et bonne chance pour vos déclarations.