Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré

L'étude de la réponse cellulaire en temps réel à une stimulation mécanique est réalisée en faisant d'abord croître des cellules exprimant des protéines de fusion GFP dans des boîtes à fond en verre pendant 24 heures. La deuxième étape consiste à recouvrir la pointe A FM de fibronectine biotinylée. Ensuite, la pointe A FM fonctionnalisée est mise en contact avec la surface cellulaire afin qu'une adhésion focale solide se forme autour de la pointe A FM, permettant ainsi une manipulation directe du cytosquelette d'actine grâce à une liaison matrice-intégrine-actine entre la pointe revêtue de fibronectine et la cellule.

La dernière étape consiste à stimuler mécaniquement la cellule vivante par un déplacement vertical ascendant contrôlé de la pointe de microscopie à force atomique (AFM), de sorte que la force verticale soit appliquée au point de contact avec la cellule sans rompre l'adhésion focale forte. En fin de compte, les résultats montrent que les cellules répondent à la stimulation mécanique en renforçant leur attachement au substrat et en induisant une réorganisation du cytosquelette d'actine, comme enregistré par imagerie optique fluorescente en temps réel. Bonjour, je suis Andrea Trake, professeure adjointe au Département de biologie des systèmes et de médecine translationnelle du Texas A&M Health Science Center.

Bonjour, je suis Sum Lim. Je suis chercheur postdoctoral au Département de biologie des systèmes et de médecine translationnelle du Texas A&M Health Science Center. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'étudier la réorganisation cellulaire adaptative en réponse à une stimulation mécanique.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier en temps réel le remodelage du cytosquelette dans des cellules musculaires lisses vasculaires vivantes. Commençons donc. Pour ces études, on utilise un microscope inversé Olympus IX 81 équipé d’un dispositif de fluorescence par réflexion totale interne, ou TIRF, associé à une tête de balayage CSU 22 de Yokogawa.

Un microscope à force atomique de type bio scope SZ est monté au-dessus d'un microscope optique inversé. L'ensemble du système est installé sur une table optique de recherche et a déjà été décrit en détail. Ce microscope intégré utilise deux caméras quant EM à multiplication d'électrons à transfert de charge, ou E-M-C-C-D.

L'un est destiné à l'imagerie en champ large et l'autre à l'imagerie confocale. L'ensemble confocal, composé du scanner à disque tournant, d'une roue à filtres externe et d'une caméra E-M-C-C-D, est monté sur une plaque de base en aluminium placée au-dessus d'un tampon en silicone nécessaire à l'absorption des vibrations. L'ensemble confocal se fixe au microscope par un flasque muni d'un collier fileté.

Ainsi, l'assemblage peut être dissocié du microscope pendant la microscopie à force atomique ou des mesures FM afin d'éviter les vibrations provenant du scanner à disque rotatif. Un laser argon-krypton est utilisé comme source d'excitation pour les modes d'imagerie TURF et confocale. Le laser peut être couplé à l'une des deux fibres optiques, qui acheminent le laser vers l'accessoire TURF ou vers la tête de balayage confocale.

Deux ordinateurs contrôlent le système. L'un utilise un logiciel de type « slide book », qui gère l'imagerie optique, et l'autre un logiciel de nanoscope, qui contrôle l'AFM. Vingt-quatre heures avant l'expérience de stimulation mécanique, placez des cellules vivantes exprimant des constructions GFP dirigées contre des protéines spécifiques dans une boîte de culture cellulaire à fond en verre. Le jour de l'expérience, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu sans rouge de phénol.

Étant donné qu'une expérience de MF est très sensible au bruit, évitez de parler ou de toucher la table optique ou le microscope pendant l'expérience afin de minimiser les perturbations. Lors des mesures de MF, découplez le module confocal à disque tournant du microscope. L'expérience commence par le montage de la boîte de culture cellulaire sur la platine de MF à l'aide d'un collier magnétique permettant de fixer la boîte à la platine magnétique du microscope.

Le levier en forme de V sur la sonde AFM est personnalisé avec une microbille en verre biotinylée. Le levier peut facilement être observé à l’aide du microscope. La bille est collée à l’extrémité même du levier, et c’est à cet endroit que la solution de revêtement doit être appliquée goutte à goutte.

Pour préparer une sonde FM pour l'expérience, fixez d'abord la pointe dans le support en verre, puis placez le support en verre sur le support de table afin de recouvrir la pointe. Rincez la pointe en déposant soigneusement 10 microlitres de solution saline tamponnée au docos ou DPBS à l'extrémité même de la pointe, puis utilisez un essuie-tout Kim pour sécher la pointe. Répétez cette procédure cinq fois après avoir rincé avec la DPBS à une concentration de un milligramme par millilitre.

Avid dans la solution. Ajouter goutte à goutte sur l'extrémité. Laisser l'extrémité incuber cinq minutes après le revêtement par avadon.

Lavez la pointe cinq fois supplémentaires avec du DPBS. Ensuite, réticulez la fibronectine biotinylée sur l'avadon en ajoutant une solution de un milligramme par millilitre, goutte à goutte sur la pointe, et incubez pendant cinq minutes.

Enfin, rincez à nouveau la pointe cinq fois avec du DPBS en laissant la dernière goutte sur la pointe. Une fois la pointe préparée, fixez-la sur un scanner FM. Après avoir monté la pointe FM, placez une jupe protectrice en silicone autour du support.

Ensuite, configurez le microscope pour la visualisation vidéo. Puis, alignez une pointe FM au centre du champ de vision. Réglez le levier optique en plaçant le faisceau laser à l'extrémité même du levier.

Ensuite, changez l'objectif pour l'objectif à fort grossissement approprié pour l'imagerie de cellules individuelles. Amenez ensuite la cellule, qui sera stimulée mécaniquement, dans le champ de vision et choisissez un endroit où la pointe AFM doit atterrir sur la surface de la cellule. Enfin, abaissez la pointe AFM jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec cette cellule spécifique.

Après avoir mis la pointe en contact avec la cellule, attendez environ 20 minutes. Cela permet la formation d'une adhésion focale solide au point de contact de la microscopie à force atomique sur la surface cellulaire. À l'issue de cette période d'attente, la procédure de stimulation mécanique peut commencer afin de préparer l'expérience de stimulation mécanique.

Passer de la caméra vidéo à la caméra E-M-C-C-D afin de visualiser les cellules fluorescentes pour l'acquisition d'images. Ensuite, acquérir une image initiale de la cellule au repos. Utiliser la microscopie à disque tournant et la microscopie vocale pour visualiser l'actine du cytosquelette dans tout le corps cellulaire.

A l'inverse, utilisez le turf pour visualiser les adhésions focales afin de stimuler la cellule. Utilisez le levier pour appliquer un mouvement vertical ascendant contrôlé par étapes discrètes toutes les trois à cinq minutes. Pendant l'acquisition des données de microscopie à force atomique (A FM), il est important que l'opérateur surveille constamment la tension de la position Z piso afin de déterminer le moment approprié pour le déplacement vertical.

Pendant l'acquisition simultanée des données FM, enregistrez une image confocale ou turf de la cellule après chaque traction verticale à l'aide du logiciel Slide Book. Enfin, retirez la pointe FM de la cellule à l'issue de l'expérience de stimulation. Une cellule musculaire lisse vasculaire transfectée avec l'actine MRFP et la vcul.

La GFP a été visualisée à l'aide d'un MF au niveau de la surface apicale de la cellule. La même cellule a été visualisée à l'aide de turf au niveau de la surface basale de la cellule. Ici, les deux images sont superposées.

Une image de la même cellule a également été acquise à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant sur l’ensemble du corps cellulaire et est présentée sous forme d’une projection maximale d’un empilement 3D. De bons recouvrements entre les images de la MFA et celles du microscope confocal à disque tournant sont observés. Cette cellule musculaire lisse vasculaire, transfectée avec de l’actine MRFP, a été stimulée mécaniquement par la MFA et observée par microscopie confocale à disque tournant.

Les erreurs indiquent des fibres d'actine qui présentent un remaniement remarquable suite à une stimulation FM. Certaines fibres d'actine polymérisent tandis que d'autres dépolymérisent en raison de la stimulation mécanique ; d'autres fibres d'actine s'assemblent en faisceaux. En raison du remaniement de l'actine, nous venons de vous montrer comment stimuler mécaniquement une culture cellulaire vivante à l'aide de la MFE tout en enregistrant simultanément le réarrangement du cytosquelette à l'aide de méthodes d'imagerie optique.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'une expérience de FM est extrêmement bruitée et sensible. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos déclarations.