Name: Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez la stimulation mécanique des cellules vivantes par microscopie à force atomique intégrée à l'imagerie optique. Cette méthode permet d'étudier la réorganisation du cytosquelette d'actine en temps réel.

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Plasmidique vinculine-GFP a été un cadeau de Kenneth Yamada, National Institutes of Health, Institut national de recherche dentaire et craniofaciale, Bethesda, Maryland, et l&#39;actine-MRFP plasmide a été un cadeau de Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, en Floride. Ce travail a été soutenu par la NSF Career Award # 0747334 et AHA-National SDG # 0835205N d&#39;Andreea Trache.

1. Présentation du système de microscope intégré Le système de microscope qui est utilisé pour ces études a été décrite en détail 1. En bref, une inversé Olympus IX-81 microscope TIRF attachement (Olympus, Center Valley, Pennsylvanie) est combiné avec la CSU-22 Yokogawa numérisation tête (Yokogawa Electric Inc, Japon). Un microscope à force atomique Bioscope SZ (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, Californie) est monté sur le dessus du microscope optique inversé, et l'ensemble du système est placé sur le dessus d'une table de qualité optique de recherche (Newport, Irvine, CA). Le montage confocale composé à partir du scanner tourne-disque, roue à filtres externes et sa caméra EMCCD (Roper Scientific-Photometrics, Tucson, AZ) sont solidaires d'une plaque de base en aluminium placée sur un coussin de silicium nécessaire à l'amortissement des vibrations. Le scanner se connecte confocale avec le microscope grâce à une bride avec un collier qui peut être foulé découplé du microscope lors des mesures AFM, telle qu'aucune vibration du scanner tourne-disque aura une incidence sur les mesures AFM. Un laser argon-krypton (Spectra Physics, Mountain View, CA) est utilisé comme source d'excitation pour les deux FRBR et les modes d'imagerie confocale, et peut être couplé alternativement dans deux fibres optiques qui offrent le laser à l'attachement FRBR ou la tête de balayage, respectivement . Deux ordinateurs de contrôle du système: un logiciel de contrôle Slidebook l'imagerie optique et un logiciel de contrôle Nanoscope l'AFM. 2. Culture de cellules Les cellules vivantes exprimant la GFP des constructions ciblées contre des protéines spécifiques doivent être placés dans un plat en verre à fond la culture de cellules 24 heures avant l'expérience de stimulation mécanique. Le jour de l'expérience de remplacer le milieu de culture cellulaire avec du phénol rouge sans moyen. La boîte de culture cellulaire est monté sur la scène AFM avec un collier magnétique. 3. AFM Astuce Préparation et Microscope Set-up La pointe AFM personnalisé avec un micron 2 biotinilés billes de verre seront lavées cinq fois avec du DPBS et ensuite incubées 5 min avec l'avidine (1 mg / ml), lavé à nouveau avec du DPBS cinq fois, puis incubées 5 min à 1 mg / mL biotinilés fibronectine. La pointe sera lavé cinq fois plus à la fin 2, monté sur le scanner AFM, puis la jupe de protection en silicone sera placé autour du support. Régler le microscope pour visionner des vidéos d'aligner la pointe AFM dans le centre du champ de vue. Aligner le levier optique en plaçant le faisceau laser à la fin du cantilever, puis modifier l'objectif d'un objectif à fort grossissement approprié pour l'imagerie cellulaire unique. La constante du ressort de la pointe doit être déterminé avant de commencer l'expérience. Ce paramètre sera mesuré en utilisant la méthode de réglage thermique disponible dans le logiciel Nanoscope. Commutateur de caméra vidéo pour caméra EMCCD pour permettre l'imagerie de fluorescence. Ensuite, choisissez une cellule et amener la pointe AFM en contact avec cette cellule spécifique. Après 20 min de temps d'attente, ce qui est nécessaire pour une forte adhérence focale pour former au point de l'AFM de contact avec la surface des cellules, la procédure de stimulation mécanique va commencer. 4. Stimulation mécanique des cellules vivantes FRBR 3-4 imagerie sera la méthode de choix pour la visualisation et la quantification des adhérences focales, et le filage du disque imagerie confocale 5 sera utilisé pour visualiser le cytosquelette d'actine dans tout le corps cellulaire. L'AFM 6 sera utilisé en imagerie mode de contact sous fluide. Une image TIRF ou confocale de la cellule va être acquis avant de commencer la procédure de stimulation mécanique. La stimulation mécanique sera induite par la sonde AFM fonctionnalisées qui sera déplacé vers le haut par étapes discrètes tous les 3-5 min sur une période de temps (1-1,5 heure). La cellule réactive-réponse sera enregistré en continu dans les logiciels Nanoscope comme une série d'images de hauteur, chaque ligne de l'image représentant une unité de temps de 1 sec. Alors que l'acquisition des données AFM, l'opérateur surveille en tout temps, le z-position de la pointe AFM pour déterminer le moment approprié pour l'attraction suivante. Après chaque stimulation mécanique, il est possible d'acquérir une image TIRF ou confocale de la cellule dans Slidebook logiciels, tout en continuant à acquérir des données de l'AFM. Les images optiques peuvent être traitées hors ligne pour créer des films qui montrent cytosquelette d'actine et la réorganisation focale adhérences. En outre, chaque image peut être traitée afin de déterminer quantitativement surface cellulaire, la zone de protéines spécifiques, et d'analyser la morphologie cellulaire en général. A la fin de l'expérience de la pointe AFM est retirée de la cellule et la sensibilité pointe AFM seront mesurés dans le logiciel Nanoscope. L'expérience est très sensible au bruit! Toute parler ou de microscope toucher pendant l'expérience devrait être évitée. Afin de minimiser le bruit dans les mesures AFM, l'confocale à disque rotatif doit être découplée de la loupe. Le temps d'attente pour former une forte adhésion focale entre la surface des cellules et la pointe de l'AFM peut varier en fonction du type cellulaire utilisé et le revêtement de matrice à la pointe. 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Idem cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) transfectées avec l'actine et RDRF vinculine-GFP a été imagée par: (A) l'AFM à la surface cellulaire apicale; (B) la FRBR à la surface des cellules basales et (C) tourne-disque microscopie confocale partout dans le corps cellulaire. L'image confocale est montré que la projection maximale d'une pile en 3-D. Bonne chevauchements entre l'AFM et de la FRBR ou le filage des images de disque confocale sont présentés dans (D) et (E), respectivement. Taille de l'image est de 64 x 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Un CMLV transfectées avec l'actine-RDRF était mécaniquement stimulées par l'AFM et imagée par disque rotatif microscopie confocale Les flèches indiquent que les fibres d'actine.: (A) polymériser / épaissir, (b) dépolymériser / disparaître, ou (c) bundle ensemble en raison à la restructuration de l'actine. Blanc lignes pointillées représentent la pointe de l'AFM-dessus de la cellule. Taille de l'image 91 x 91 microns.

<ol><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).</li>
<li>Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrache%2C+A+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
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</ol>

Adhérences Cytosquelette 7-10 et 11-16 focale sont des structures dynamiques qui s&#39;assemblent, se dispersent et retournent comme des cellules migrent ou répondre à une force mécanique 17. Ils ont des fonctions importantes dans la régulation de la croissance cellulaire, la survie et l&#39;expression des gènes. Connaissant leur distribution spécifique et de la dynamique permet de mieux comprendre comment les cellules communiquent avec la matrice et entre eux. <p class="jove_content...

<table><tbody><tr><td>Pointe de microscope à force atomique (AFM)</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td></td><td>bille de borosilicate de 2 µm, 0,01 N/m, surface biotinylée</td></tr><tr><td>avidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td>1 mg/mL dans DPBS</td></tr><tr><td>fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-051</td><td></td></tr><tr><td>kit de transfection Amaxa pour cellules musculaires lisses</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>plats MatTek à fond de verre</td><td>MatTek Corp.</td><td>P60G-1.5-30-F</td><td>plats Falcon stériles de 60 mm avec lame de verre au fond, n° 1,5</td></tr></tbody></table>

réponse live cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Pour comprendre le mécanisme par lequel les cellules vivantes sens des forces mécaniques, et comment ils réagissent et s&#39;adaptent à leur environnement, une nouvelle technologie capable de d&#39;étudier le comportement des cellules au niveau sub-cellulaire avec une résolution spatiale et temporelle élevée a été développé. Ainsi, un microscope à force atomique (AFM) a été intégré à la réflexion interne totale de fluorescence (FRBR) microscopie et rotation rapide du disque (DSE) microscopie confocale. Le système intégré est largement applicable dans un large éventail d&#39;études moléculaires dynamiques dans toute cellules adhérentes en direct, permettant d&#39;imagerie optique directe des réponses des cellules à la stimulation mécanique en temps réel. Réarrangement significatif des filaments d&#39;actine et adhésions focales a été montré en raison de la stimulation mécanique locale à la surface cellulaire apicale qui induit des changements dans la structure cellulaire dans le corps cellulaire. Ces techniques innovantes fournira de nouvelles informations pour comprendre la restructuration de cellules vivantes et dynamiques en réponse à une force mécanique. Un protocole détaillé et un ensemble de données représentatives que la réponse cellulaire spectacle à la stimulation mécanique sont présentées.

Ce document vise à instruire le lecteur dans le fonctionnement d&#39;un système intégré à force atomique, microscope optique d&#39;imagerie pour la stimulation mécanique des cellules vivantes en culture. Un protocole étape par étape est présentée. Un ensemble représentatif de données qui montre la réponse de cellules vivantes à la stimulation mécanique est présenté.

Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré

Pour comprendre le mécanisme par lequel les cellules vivantes perçoivent les forces mécaniques, et la manière dont elles répondent et s'adaptent à leur environnement, une nouvelle technologie capable de ...

L'étude de la réponse cellulaire en temps réel à une stimulation mécanique est réalisée en faisant d'abord pousser des cellules exprimant des protéines de fusion GFP dans des boîtes à fond en verre pendant 24 heures. La deuxième étape consiste à recouvrir la pointe A FM de fibronectine biotinylée. Ensuite, la pointe A FM fonctionnalisée est mise en contact avec la surface cellulaire afin qu'une adhésion focale solide se forme autour de la pointe A FM, permettant ainsi une manipulation directe du cytosquelette d'actine grâce à une liaison matrice-intégrine-actine entre la pointe revêtue de fibronectine et la cellule.La dernière étape consiste à stimuler mécaniquement la cellule vivante par un déplacement vertical ascendant contrôlé de la pointe de microscopie à force atomique (AFM), de sorte que la force verticale soit appliquée au point de contact avec la cellule sans rompre l'adhésion focale forte. En fin de compte, les résultats montrent que les cellules réagissent à la stimulation mécanique en renforçant leur attachement au substrat et en induisant une réorganisation du cytosquelette d'actine, comme enregistré par imagerie optique fluorescente en temps réel. Bonjour, je suis Andrea Trake, professeure adjointe au Département de biologie des systèmes et de médecine translationnelle du Texas A&M Health Science Center.Bonjour, je suis Sum Lim. Je suis chercheur postdoctoral au Département de biologie des systèmes et de médecine translationnelle du Texas A&M Health Science Center. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'étudier la réorganisation cellulaire adaptative en réponse à une stimulation mécanique.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier en temps réel le remaniement du cytosquelette dans des cellules musculaires lisses vasculaires vivantes. Commençons donc. Pour ces études, on utilise un microscope inversé Olympus IX 81 équipé d'un dispositif de fluorescence par réflexion totale interne, ou TIRF, combiné à une tête de balayage CSU 22 de Yokogawa.Un microscope à force atomique de type bio scope SZ est monté au-dessus d'un microscope optique inversé. L'ensemble du système est installé sur une table optique de recherche et a déjà été décrit en détail. Ce microscope intégré utilise deux caméras quant EM à multiplication d'électrons à transfert de charge, ou E-M-C-C-D.L'un est destiné à l'imagerie en champ large et l'autre à l'imagerie confocale. L'ensemble confocal, composé du scanner à disque tournant, d'une roue à filtres externe et d'une caméra E-M-C-C-D, est monté sur une plaque de base en aluminium placée au-dessus d'un tampon en silicone nécessaire à l'absorption des vibrations. L'ensemble confocal se fixe au microscope par un flasque muni d'un collier fileté.Ainsi, l'assemblage peut être découplé du microscope pendant la microscopie à force atomique ou des mesures de FM afin d'éviter les vibrations provenant du scanner à disque rotatif. Un laser argon-krypton est utilisé comme source d'excitation pour les modes d'imagerie TURF et confocale. Le laser peut être couplé à l'une ou l'autre des deux fibres optiques, qui acheminent le laser vers l'accessoire TURF ou la tête de balayage confocale.Deux ordinateurs contrôlent le système. L'un utilise un logiciel de type « slide book », qui gère l'imagerie optique, et l'autre un logiciel de nanoscope, qui contrôle l'AFM. Vingt-quatre heures avant l'expérience de stimulation mécanique, placez des cellules vivantes exprimant des constructions GFP dirigées contre des protéines spécifiques dans une boîte de culture cellulaire à fond en verre. Le jour de l'expérience, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu exempt de rouge de phénol.Étant donné qu'une expérience de MF est très sensible au bruit, évitez de parler ou de toucher la table optique ou le microscope pendant l'expérience afin de minimiser les perturbations. Lors des mesures de MF, découplez le module confocal à disque tournant du microscope. L'expérience commence par le montage de la boîte de culture cellulaire sur la platine de MF à l'aide d'un collier magnétique permettant de fixer la boîte à la platine magnétique du microscope.Le levier en forme de V sur la sonde AFM est personnalisé avec une microbille de verre biotinylée. Le levier peut être facilement observé à l'aide du microscope. La bille est collée à l'extrémité même du levier, et c'est à cet endroit que la solution de revêtement doit être appliquée goutte à goutte.Pour préparer une sonde FM pour l'expérience, fixez d'abord la pointe dans le support en verre, puis placez le support en verre sur le support de table pour revêtir la pointe. Rincez la pointe en faisant tomber soigneusement 10 microlitres de solution saline tamponnée au docos ou DPBS à l'extrémité même de la pointe, puis utilisez un essuie-tout pour sécher la pointe. Répétez cette procédure cinq fois après lavage avec la DPBS à une concentration d'un milligramme par millilitre.Avid dans la solution. Ajouter goutte à goutte sur l'extrémité. Laisser l'extrémité incuber cinq minutes après le revêtement par avadon.Lavez la pointe cinq fois supplémentaires avec du DPBS. Ensuite, réticulez la fibronectine biotinylée sur l'avadon en ajoutant une solution de un milligramme par millilitre, goutte à goutte sur la pointe, et incubez pendant cinq minutes.Enfin, rincez à nouveau la pointe cinq fois avec du DPBS en laissant la dernière goutte sur la pointe. Une fois la pointe préparée, montez-la sur un scanner de microscopie à force (FM). Après avoir monté la pointe FM, placez une jupe protectrice en silicone autour du support.Ensuite, configurez le microscope pour la visualisation vidéo. Puis, alignez une pointe FM au centre du champ de vision. Réglez le levier optique en plaçant le faisceau laser à l'extrémité même du levier.Ensuite, changez l'objectif pour l'objectif à fort grossissement approprié pour l'imagerie de cellules individuelles. Amenez ensuite la cellule, qui sera stimulée mécaniquement, dans le champ de vision et choisissez un endroit où la pointe AFM doit atterrir sur la surface de la cellule. Enfin, abaissez la pointe AFM jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec cette cellule spécifique.Après avoir mis la pointe en contact avec la cellule, attendez environ 20 minutes. Cela permet la formation d'une adhésion focale solide au point de contact de la microscopie à force atomique (FM) sur la surface cellulaire. À l'issue de cette période d'attente, la procédure de stimulation mécanique peut commencer afin de préparer l'expérience de stimulation mécanique.Passer de la caméra vidéo à la caméra E-M-C-C-D afin de visualiser les cellules fluorescentes pour l'acquisition d'images. Ensuite, acquérir une image initiale de la cellule au repos. Utiliser la microscopie à disque tournant et la microscopie vocale pour visualiser l'actine du cytosquelette dans tout le corps cellulaire.A l'inverse, utilisez le turf pour visualiser les adhésions focales afin de stimuler la cellule. Utilisez le levier pour appliquer un mouvement ascendant contrôlé en étapes discrètes toutes les trois à cinq minutes. Pendant l'acquisition des données de microscopie à force atomique (A FM), il est important que l'opérateur surveille constamment la tension de la position Z piso afin de déterminer le moment approprié pour le déplacement vertical.Simultanément à l'acquisition de données FM, enregistrez une image confocale ou turf de la cellule après chaque traction verticale à l'aide du logiciel Slide Book. Enfin, retirez la pointe FM de la cellule à l'issue de l'expérience de stimulation. Une cellule musculaire lisse vasculaire transfectée avec l'actine MRFP et la vinculine.La GFP a été visualisée à l'aide d'un microscope à fluorescence (FM) au niveau de la surface cellulaire apicale. La même cellule a été visualisée à l'aide de la technique turf au niveau de la surface cellulaire basale. Ici, les deux images sont superposées.Une image de la même cellule a également été acquise à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif sur l’ensemble du corps cellulaire et est présentée sous forme de projection maximale d’un empilement 3D. De bons recouvrements entre les images de microscopie à force atomique (A FM) et celles du confocal à disque rotatif sont observés. Cette cellule musculaire lisse vasculaire, transfectée avec de l’actine MRFP, a été stimulée mécaniquement par la A FM et imagée par microscopie confocale à disque rotatif.Les erreurs indiquent des fibres d'actine qui présentent un remaniement remarquable suite à une stimulation FM. Certaines fibres d'actine polymérisent tandis que d'autres dépolymérisent en raison de la stimulation mécanique ; d'autres fibres d'actine s'associent en faisceaux. En raison du remaniement de l'actine, nous venons de vous montrer comment stimuler mécaniquement une culture cellulaire vivante à l'aide de la MFE tout en enregistrant simultanément le réarrangement du cytosquelette à l'aide de méthodes d'imagerie optique.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'une expérience de RM est extrêmement bruyante et sensible. Voilà donc. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos énoncés.

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Cet article décrit un protocole de caractérisation mécanique des sphéroïdes vivants au sein d’une matrice 3D à l’aide de la micro-spectroscopie de Brillouin. Cette méthode entièrement optique permet la visualisation des sphéroïdes avec une résolution à l’échelle microscopique et des propriétés mécaniques quantitatives. Cette approche a des implications pour le phénotypage mécanique ; par exemple, déterminer les états pathologiques des sphéroïdes tumoraux dans un microenvironnement 3D.

Cartographie mécanique des sphéroïdes à l’aide de la spectroscopie de Brillouin

Découvrez la stimulation mécanique des cellules vivantes par microscopie à force atomique intégrée à l'imagerie optique. Cette méthode permet d'étudier la réorganisation du cytosquelette d'actine en temps réel.

Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré

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