Ciblage des structures cérébrales profondes avec des microinjections de livraison des médicaments, des vecteurs viraux, ou de cellules

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer des micro-injections très précises dans les structures cérébrales profondes pour l’administration de médicaments, de vecteurs viraux ou de greffes de cellules. Ceci est accompli en produisant d’abord des aiguilles capillaires en verre avec une lumière de 50 micromètres. La deuxième étape de la procédure consiste à remplir 50 % de l’aiguille avec de l’huile minérale par capillaire et à insérer le piston par l’extrémité la plus large du tube.

La troisième étape de la procédure consiste à charger l’aiguille avec la substance ou la suspension cellulaire que vous souhaitez injecter. La dernière étape de la procédure consiste à introduire la pointe de l’aiguille et à injecter la substance à très faible débit dans une structure cérébrale profonde. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent un ciblage très précis des substances dans le cerveau par le biais de micro-injections avec un tube capillaire en verre.

Bonjour, je suis Oscar Gonzalez du Laboratoire de neurosciences de l’École de psychologie de l’Université de Colima, au Mexique. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d’effectuer une micro-injection avec un tube capillaire en verre pour administrer des médicaments dans le cerveau de la souris. Nous utilisons cette procédure dans suffisamment de laboratoire pour étudier les cellules souches neurales adultes.

Alors commençons. L’utilisation d’aiguilles capillaires en verre avec une lumière de 50 micromètres pour les micro-injections dans le cerveau réduit considérablement les lésions cérébrales, minimise la diffusion passive de médicaments et permet un ciblage précis dans le cerveau des rongeurs. Avant que les micro-injections puissent être effectuées, les aiguilles de verre doivent être construites.

Commencez par placer le tube de verre capillaire dans une électrode de traction à haute résistance d’un extracteur de micro-pipette. Allumez ensuite l’électrode de l’extracteur de micro-pipette. Pour chauffer le milieu du tube de verre afin de ramollir localement le tube de verre, étirez le tube de verre le long de son axe longitudinal d’une distance initiale de trois à cinq millimètres, suffisante pour provoquer une réduction du diamètre du tube de verre dans la zone localisée.

Continuez à étirer le tube de verre jusqu’à ce qu’il se brise. Répétez ces étapes pour créer deux aiguilles identiques à canon unique. Placez maintenant les aiguilles de verre dans une micro-forge.

Un angle de 30 degrés suffit pour biseauter la pointe. Enfin, placez les aiguilles sous le microscope et vérifiez qu’elles ont toutes les deux le bon diamètre intérieur. Pour la plupart des médicaments hydrophiles, un diamètre intérieur de 30 à 50 micromètres est idéal avec les aiguilles construites.

Voyons comment les utiliser pour les micro injections. Pour commencer, remplissez l’aiguille construite avec de l’huile minérale par l’extrémité la plus large. Laissez l’huile minérale pénétrer par capillarité jusqu’à ce qu’elle atteigne environ 50 % de la longueur du tube capillaire.

Mettez de la graisse sous vide poussé autour de l’extrémité la plus large de l’aiguille et insérez le piston à travers celle-ci. Pour pousser doucement l’huile minérale jusqu’à ce qu’une petite goutte de scène sorte de la pointe de l’aiguille de verre. Fixez maintenant l’aiguille dans le support du micro-injecteur et commencez à préparer l’animal pour l’injection.

Tout d’abord, placez un coussin chauffant sur le support stéréotaxique de l’animal pour maintenir la température corporelle de l’animal. À 37 degrés Celsius, rasez la tête de la souris anesthésiée, puis placez-la et fixez-la dans l’appareil stéréotaxique. À l’aide de barres d’oreille et d’un porte-dents, utilisez une lame chirurgicale pour inciser la peau des oreilles jusqu’à la ligne du crâne Lambda.

Polissez le crâne avec un coton-tige pour le sécher et retirer la peau du champ opératoire. Ensuite, utilisez la pointe de l’aiguille de verre pour pointer vers le sommet de la suture bgma et réglez la position initiale d’injection à cet endroit. Placez maintenant le point sur le crâne qui doit être percé en déplaçant les axes x et y du dispositif stéréotaxique sur le crâne.

À l’aide d’une micro-perceuse de recherche, percez soigneusement des trous aux coordonnées sélectionnées avec une pince fine. Retirez soigneusement la couche la plus profonde de l’os et brisez la membrane moderne de la dure-mère. Vous verrez du liquide céphalo-rachidien s’échapper.

Pour confirmer que l’aiguille peut passer à travers les trous percés, abaissez lentement l’aiguille de verre à l’aide de l’axe Z de l’appareil stéréotaxique. Maintenant, pipetez un microlitre du médicament à injecter et placez-le sur un petit morceau de parfum. Placez le parfum sur le crâne.

Aspirez le médicament en faisant tourner la roue du micro-injecteur pendant que vous vérifiez au microscope que le liquide monte dans l’aiguille de verre. Retirez le film para et réinitialisez la coordonnée zéro. Déplacez maintenant l’aiguille aux coordonnées sélectionnées et abaissez le support jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille en verre touche doucement la surface du cerveau et réglez la coordonnée Z à zéro.

Introduisez l’aiguille de verre dans le parenchyme cérébral à la profondeur souhaitée. Injectez le médicament lentement à un rythme d’environ un nanolitre par seconde. Lorsque le volume souhaité est injecté, laissez le médicament se diffuser dans le parenchyme pendant deux minutes, puis retirez l’aiguille en douceur et lentement.

Enfin, collez la plaie chirurgicale et retirez l’animal de l’appareil stéréotaxique. Placez l’animal dans une cage d’avant-guerre pour la récupération de l’anesthésie. Nous allons maintenant montrer quelques résultats de micro-injection.

La lysophosphatidylcholine ou lyine a été injectée dans le corps cossum qui produit la démyélinisation des faisceaux de substance blanche pour minimiser les lésions cérébrales produites par l’aiguille de verre. Seulement 20 litres de lyin ont été injectés. La démyélinisation est représentée par l’absence d’expression de la protéine basique de la myéline dans les faisceaux de substance blanche, une injection très précise est obtenue et un tractus d’aiguille très étroit minimise les lésions cérébrales.

Nous venons de vous montrer comment construire des aiguilles de verre pour effectuer des micro-injections dans les structures cérébrales profondes. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir tous les équipements et matériaux prêts à être utilisés dans la salle d’opération. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.