Name: Assay RhoC activation GTPase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez le test de pull down pour quantifier l'activation de RhoC GTPase dans les cellules. Cette méthode fiable permet d'étudier la signalisation cellulaire et les fonctions biologiques de RhoC.

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1. Préparer la TPS protéine de fusion <ol><li> Stocks de glycérol de bactéries compétentes JM109 contenant le premier N-terminale 90 acides aminés du domaine rhotekin Rho contraignant (RBD) sous-cloné dans le vecteur BamH1/EcoR1 pGEX3x sont faites. Garantir un rendement élevé les étapes suivantes doivent être effectuées pour chaque expérience. Dans notre expérience, fraîchement préparé TPS-RBD est la clé à un test d'activation GTPase robuste et précis. </li><li> Ajouter 50 uL (approximatif, ne pas décongeler) du stock de glycérol à 50 mL de LB ampères et de croître à 37 ° C pendant la nuit avec agitation. </li><li> Diluer à 1:10 dans 500 ml LB-amp et de grandir pendant 1 h. </li><li> Provoquer la TPS production de protéines avec 0,1 mM d'IPTG pendant 2 heures. </li><li> Répartir uniformément dans les bouteilles à centrifuger et centrifuger, Sorval GSA3 rotor à 5000 tours à 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Resuspendre le culot dans des bouteilles de centrifugeuse, 10 ml de tampon de lyse *. * Tampon de lyse bactérienne: 20% de saccharose, glycérol 10%, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 mM MgCl2, 2 mM de DTT, Ajouter fraîche PMSF, benzamide, l'aprotinine et leupeptine. </li><li> Soniquer 2-3 min (cela dépend du type de sonicateur. Nous utilisons un modèle de Fischer Sonic Dismembranator 500 fixé à la marque 6, cycle de 50%). </li><li> Centrifugeuse, Sorvall SS34, 20 min 10 000 rpm à 4 ° C. A ce point une petite aliquote peut être souscrite et gérée par SDS-PAGE. Le gel peut être coloré au bleu de Coomassie et d'une bande doit être apparente à 46 kDa. </li><li> Enlever le surnageant et ajouter 1 mL de 50% glutatione-Sépharose 4B boue. </li><li> Incuber pendant 30 min à 4 ° C avec rotation. Laver 3 fois avec un tampon de lyse. </li><li> Remettre les billes GST-RBD/glutatione-Sepharose à une suspension de 50% (environ 1 mL) avec la TPS poissons tampon **. ** La TPS-Fish Tampon: 10% glycérol, 50 mM Tris pH 7,4, NaCl 100 mM, 1% NP-4, 2 mM MgCl 2, Ajouter fraîche PMSF, benzamide, l'aprotinine et leupeptine </li></ol> 2. Fusion GST pull down test <ol><li> Utilisez 5-10 x 10 6 cellules / test </li><li> Laver les cellules une fois en PBS glacé, gardez les plaques sur la glace (nous utilisons un plat en verre plat rempli de glace) et Lyse avec 0,5 mL TPS poissons tampon. </li><li> Incuber 5 min sur la glace, les cellules de récolte à l'aide d'un policier en caoutchouc ou scrapper plat, transfert à microcentrifugeuse tube et centrifuger 5 min 20000 rpm à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube de micro frais. Prenez 50 ul pour déterminer totale Rho (c'est à dire le PIB + GTP lié). </li><li> Ajouter 0,5 ml GST-RBD/glutatione-Sepharose perles et incuber à 4 ° C, nuit à la rotation. </li><li> Lavez 6x avec TPS-poissons tampon. </li><li> Remettre en suspension dans 40 perles tampon d'échantillon 2x-uL Laemelli À ce stade de la concentration de l'aliquote Rho protéines totales prise en 2.4 devrait être déterminée et 30 ug préparé pour être exécuté sur le gel avec l'échantillon d'activation correspondant. </li><li> Faire bouillir les échantillons à 90 ° C pendant 5 min, centrifuger brièvement et prendre surnageant (c'est à dire éviter les perles) charger et d'exécuter sur une pente de 12 puits 4-20% gel SDS-PAGE. </li><li> Exécuter un gel sans volts supérieure à 150, le transfert à la membrane en utilisant du tampon Towbin et constante de courant de 100 W. </li><li> Bloc membrane avec 5% de lait / TBST solution et sonde avec RhoC-specfic anticorps. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs De bons résultats devraient produire une bande unique à environ 22 kDa. Mauvais résultats de produire des bandes multiples ou bruit de fond élevé. Ceci est révélateur de la dégradation des protéines, le lavage incomplet des échantillons ou l'utilisation de l'ancienne TPS-RBD. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Trois lignées cellulaires séparées exprimant différents niveaux de RhoC GTPase sont présentés pour démontrer de faibles niveaux de RhoC actif et total, des niveaux élevés de RhoC active et totale ou ne RhoC. Le blot a ensuite été déshabillé et sondé avec un anticorps de la gène de l'actine maison gardant pour servir de contrôler le chargement de la protéine RhoC total. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Bandes multiples ou les résultats de fond élevé de dégradation des protéines, le lavage incomplet des échantillons ou l'utilisation de l'ancienne TPS-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

L&#39;étape la plus critique de la procédure est la nouvelle génération de TPS-RBD. Le défaut de porter une attention particulière à cette étape est la raison principale de l&#39;échec. Toutes les étapes, de génération de la TPS-RBD (1.2) à l&#39;incubation pendant la nuit avec le lysat cellulaire (2,5), devrait être fait en une seule journée. Une autre étape cruciale est de rendre certains qu&#39;il ya suffisamment de cellules pour produire les lysats cellulaires. Ceci est d&#39;une importance particulière quand on reg...

<table><tbody><tr><td>Billes de glutathion-sépharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Gels Criterion Tris-HCl 4-20 %</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

assay rhoc activation gtpase

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase présente une homologie de 91% à RhoA GTPase. En raison de sa prévalence dans les cellules, de nombreux réactifs et des techniques de RhoA GTPase ont été développés. Toutefois, RhoC GTPase est exprimé dans les cellules cancéreuses métastatiques à des niveaux relativement bas. Par conséquent, quelques RhoC réactifs spécifiques ont été développés. Nous avons adapté un test d&#39;activation de Rho GTPase pour détecter RhoC. Cette technique utilise un TPS-Rho protéine de liaison de fusion de domaine à sortir actifs GTPase RhoC. En outre, nous pouvons récolter des protéines totales au début de l&#39;essai pour déterminer les niveaux du total (GTP et le PIB lié) GTPase RhoC. Ceci permet pour la détermination de la GTPase RhoC actifs par rapport au total dans la cellule. Plusieurs versions commerciales de cette procédure ont été développés cependant, les kits commerciaux sont optimisés pour RhoA GTPase et typiquement ne fonctionne pas bien pour RhoC GTPase. Pièces de l&#39;essai ont été modifiés ainsi que le développement d&#39;un anticorps spécifique RhoC.

Ce protocole utilise un menu déroulant d&#39;essai pour déterminer les niveaux de GTPase RhoC actifs dans les cellules.

Assay RhoC activation GTPase

La GTPase RhoC présente une homologie de 91 % avec la GTPase RhoA. En raison de la prévalence de cette dernière dans les cellules, de nombreux réactifs et techniques ont été développés pour la GTPase RhoA. ...

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La méthode présentée ici décrit un dosage de suivre l'activation de RhoA facteurs spécifiques de change GDP / GTP (GEF) dans les cellules cultivées en faisant usage d'une protéine mutante RhoA fusion GST qui a une forte affinité pour GEFs activés. GEF sont précipités à partir de lysats cellulaires, détectées par Western blot et quantifiée par densitométrie.

Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF l&#39;aide d&#39;un TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales

Cette vidéo présente un test de compétition pour étudier les partenaires protéiques de liaison à la GTPase. En utilisant la protéine GTPase liée aux nucléotides immobilisée sur des billes magnétiques, la liaison compétitive entre deux partenaires protéiques en interaction pour le même site de liaison sur la GTPase peut être étudiée pour évaluer les affinités de liaison des partenaires protéiques.

Essai de liaison à la compétition pour étudier les partenaires protéiques concurrents de liaison à la GTPase

L'essai de mobilisation du calcium par fluorescence ici décrit est un système de criblage inverse pharmacologie à débit moyen pour l'identification de ligand (s) d'activation fonctionnellement G orphelins de récepteurs couplés aux protéines (RCPG).

Caractérisation des récepteurs de protéines G couplées par une mobilisation de calcium dosage à base de fluorescence

Ce protocole compare les affinités relatives des partenaires de liaison pour les GTPases de la famille Rho, y compris Rac1. In vivo, les protéines de liaison à Rac1 sont en compétition pour une seule interface de liaison, dont la conformation est dictée par un nucléotide lié. Le nucléotide est à la fois important et difficile à contrôler expérimentalement, en raison du taux d’hydrolyse élevé.

En comparant l&#39;affinité des protéines de liaison en utilisant GTPase Compétition dosages

L’adsorption peptidique sur des objets en plastique lors de dilutions en série traditionnelles basées sur des pointes peut avoir un impact significatif sur la détermination de l’activité et confondre la compréhension des relations structure-activité utilisées pour les phases d’identification et d’optimisation des pistes de découverte de médicaments. Ici, des méthodes de dilution en série acoustique automatisée sans contact d’échantillons de peptides sont décrites.

Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays

La liaison à la guanosine triphosphate (GTP) est l'un des premiers événements dans l'activation du récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Ce protocole décrit comment caractériser pharmacologiquement des interactions spécifiques de GPCR-ligand en surveillant la liaison de l'analogue GTP radio-marqué, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en Réponse à un ligand d'intérêt.

Mesure de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G via liaison GTP radiomarquée

Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la prénylation et la guanosine-5'-triphosphate (GTP)-chargement de la Rho GTPase. Ce protocole comprend deux méthodes détaillées, à savoir fractionnement membrane et une GTPase-immuno assay. Le protocole peut être utilisé pour mesurer la prénylation et la GTP chargement de différentes autres petites GTPases.

Détection des petits GTPase prénylation et GTP Binding utilisant le fractionnement Membrane et GTPase-linked Immunosorbent Assay

Ce rapport décrit le dépistage de différents détergents pour la préparation du GPCR visuel, de la rhodopsine et de son complexe avec mini-Go. Des méthodes biochimiques caractérisant la qualité du complexe à différents stades de purification sont démontrées. Ce protocole peut être généralisé à d’autres complexes de protéines membranaires pour leurs futures études structurelles.

Dépistage stratégique et caractérisation du complexe de signalisation des protéines VISUAL GPCR-mini-G pour une cristallisation réussie

Dans ce travail, un test de fluorescence calcique intracellulaire à haut débit pour des plaques à 384 puits afin de cribler de petites banques de molécules sur des récepteurs couplés aux protéines G recombinantes (RCPG) est décrit. La cible, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, est exprimée dans les cellules CHO-K1. Ce test identifie les agonistes et les antagonistes utilisant les mêmes cellules dans un test de « double addition ».

Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

Nous avons mis au point un test de réassemblage de la luciférase fractionnée pour surveiller les contacts réticulum-mitochondrie endoplasmique dans les cellules vivantes. À l’aide de ce test, nous décrivons un protocole permettant de mesurer quantitativement le niveau de ces couplages inter-organites dans HEK293T cellules, dans des conditions de traitement chimique.

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Découvrez le test de pull down pour quantifier l'activation de RhoC GTPase dans les cellules. Cette méthode fiable permet d'étudier la signalisation cellulaire et les fonctions biologiques de RhoC.

Assay RhoC activation GTPase

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