Name: Lisolement, lenrichissement et lentretien des cellules souches Médulloblastome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour isoler et maintenir des cellules souches de médulloblastome à partir de modèles murins modifiés génétiquement. Cette technique améliore les cultures de neurosphères en réduisant la différenciation spontanée et la mortalité cellulaire.

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Cette étude a été soutenue par des subventions du Vanderbilt-Ingram Cancer Center Grant Support (P30 CA068485), la Fondation des tumeurs cérébrales enfance et les National Institutes of Health (NS042205).

1. Micro-dissection de la tumeur portant Cervelet, dissociation du tissu tumoral et placage <ol><li> Récupération de tissu tumoral <ol><li> Malade médulloblastome chez des souris porteuses sont souvent chétifs, affiché hydrocéphalie et typique des symptômes neurologiques, y compris paralysie des membres postérieurs et l'incapacité à retrouver une posture en cas de retournement. Pour récupérer le tissu tumoral, euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone. Il est important de ne pas effectuer dislocation cervicale, une procédure qui génère une pression sur le crâne postérieur et peut compromettre l'intégrité des tissus tumoraux. </li><li> Décapitation est effectuée immédiatement après la mort en utilisant une paire de ciseaux, enlever les poils et les tissus musculaires, autant que possible pour une bonne visualisation du crâne. Nettoyer la surface du crâne avec Kimwipe imbibé d'éthanol à 95%. </li><li> Utilisez des ciseaux pour couper fines une ouverture le long de la ligne médiane du crâne, et éliminer les tissus du crâne avec une pince fine, à quel point l'ensemble du cerveau, y compris porteurs d'une tumeur du cervelet est exposée. </li><li> Alors que les cervelets des adultes sains d'affichage bien définis hémisphères et du vermis, les cervelets de souris porteuses de tumeurs sont souvent élargie, amorphe avec une surface lisse et les vaisseaux sanguins visibles. En utilisant des techniques stériles, extraire la tumeur du cervelet en utilisant une pince à épiler et le lieu de PBS glacé, sans Mg 2 + et Ca 2 +. </li></ol></li> Remarque: tous les instruments sont stérilisés dans de l'éthanol à 95% avant utilisation. <li> La dissociation du tissu tumoral <ol><li> Transférer le tissu tumoral du PBS pour Accutase 50% (dilué dans du PBS), qui est environ 4 fois le volume du tissu tumoral, émincer les tissus avec des ciseaux fins pour 3 minutes à température ambiante, suivie d'une incubation à 37 ° C pendant 4 minutes , après quoi le tissu subit pipetage répétitifs avec un Pipetman de 1 ml pour 3 minutes supplémentaires. Cette méthode devrait donner un mélange de cellules individuelles et de petits agrégats cellulaires. </li><li> Diluer la suspension cellulaire 3 fois avec du PBS et centrifuger pendant 5 minutes à 1000 g pour sédimenter les cellules. Resuspendre la cellule dans l'eau douce moyennes tiges de culture de cellules neurales et plaque granulés sur une parabole de 60 mm gélatinisé Primaria culture de tissus. Nous utilisons des plats Primaria pour la fixation améliorée au plaquage première passages ultérieurs peuvent être étalés sur des boîtes de culture tissulaire régulière. </li></ol></li></ol> Remarque: des boîtes de culture Manteau avec 0,1% de gélatine pendant au moins 30 minutes. Préparer une solution fraîche moyennes neuronaux de culture de cellules souches composé de milieu Neurobasal avec de la glutamine, Pen-Strep, N2, B27, EGF humain (25 ng / ml) et FGF basique (25 ng / ml). 2. Enrichissement, entretien et l'expansion des cellules tumorales par des passages en série Médulloblastome Nous obtenons habituellement de nombreuses colonies après 1 semaine de plaquage initial (figure 1). Ces colonies peuvent être dissociés et sur de nouveaux plats réétalées gélatinisé pour l'enrichissement de la population de cellules tumorales. Premier changement au nouveau milieu de culture, il suffit d'utiliser un Pipetman 1 mL mécaniquement détacher colonies suivie par pipetage répétitifs pendant 4 minutes pour obtenir une suspension cellulaire (pas Accutase nécessaire). Vérifiez sous un microscope pour s'assurer que les mottes à grandes cellules ont été dissociées. Puis passer la suspension cellulaire sur de nouveaux plats gélatinisé pour cultiver plus loin et passer par la même procédure pour les passages supplémentaires. Seules les cellules tumorales, les cellules sanguines et d'autres types cellulaires sont éliminés par série re-placages, laissant les cellules tumorales attachés à développer rapidement. Changer milieu de culture sur le deuxième jour suivant l'ensemencement initial, et chaque jour d'autres par la suite. 3. La coloration par immunofluorescence et examen des cellules cultivées 1. Cultiver des cellules tumorales sur des lamelles de verre Au jour 1, lamelle de verre placer un dans chacun d'une plaque à 6 puits, puis ajouter 0,1% de gélatine pendant 30 minutes à 37 ° C. Graines d'environ 2-4x 10 5 cellules tumorales par mL. Les cellules devraient attacher la nuit et le milieu des cellules souches neurales changé le jour 3. La coloration est réalisée sur 4 jours. 2 La coloration par immunofluorescence Retirer milieu de culture et les cellules laver deux fois avec PBS glacé. Fixer les cellules avec des fraîchement faite PFA 4% pendant 15 minutes. Brièvement laver les cellules deux fois avec du PBS et permeablize avec Triton 0,3% (dans du PBS) pendant 5 minutes. Brièvement laver les cellules deux fois avec du PBS et de bloquer avec du sérum de chèvre 10% pendant 40 minutes. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire pendant 90 minutes, puis lavez les cellules trois fois avec PBS, pendant 5 minutes chacune. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire pendant 60 minutes, puis laver trois fois avec du PBS, 5 minutes chacun. Mont lamelles sur des lames avec 5 ml d'un milieu aqueux de montage et d'effectuer la microscopie confocale. 4. La différenciation des cellules tumorales Retirer neurones moyennes de cellules souches et brièvement laver les cellules avec du PBS deux fois. Ajouter milieu de différenciation sur le jour 1, le changement moyen au jour 4 et déterminer le niveau de différenciation par immunofluorescence au jour 7. Le milieu de différenciation consiste DMEM, Pen-Strep et 10% de sérum fœtal bovin. 5. Les résultats représentatifs Morphologie des résultats Après le traitement Accutase et doux pipetage répétitifs, le tissu tumoral devrait être principalement dissocié en petits agrégats cellulaires et des cellules individuelles. Beaucoup de colonies considérables peuvent être observés dès 5 jours après l'étalement initial, comme le montre la figure 1. Cellules tumorales fortement prolifératives sont souvent bi-polaire avec un ratio nucléaire / cytoplasmique élevé. Ces cellules sont généralement vus rayonnant à partir de petits agrégats cellulaires attachés à la surface gélatinisé. Les cellules sanguines, petites et rondes, sont généralement enlevés par les changements de supports suivants et les placages de série. Après plusieurs passages, on peut observer uniformément répartie, prolifératif Ki67 + cellules tumorales et la contamination peu avec d'autres types cellulaires (figure 2). Expression des marqueurs des cellules souches neurales, analyse clonale et différenciation en multiples lignées Afin de déterminer si les cellules proliférantes dérivées de dissocier caractéristiques de la tumeur du cervelet montrent tissu de cellules souches tumorales, nous avons effectué une caractérisation plus poussée par l'expression du marqueur de cellules souches, l'analyse clonale et la puissance de différenciation. Nous avons constaté que ces cellules tumorales isolées très explicite marqueurs des cellules souches neurales telles que Sox2 et nestine (figure 3). Comme nous l'avons récupéré à partir des tissus tumoraux SmoM2-YFP, toutes les cellules tumorales expriment YFP. Conformément à une récente étude indiquant que les cils primaires sont importants pour le développement de la voie Shh-dépendant médulloblastome 12, SmoM2-YFP d'expression a été clairement localisé les cils des cellules tumorales Sox2 + (figure 3). Lorsque la densité plaquées à clonale de 300 cellules par mL de milieu de culture, nous avons observé l'expansion clonale d'une cellule tumorale unique d'une colonie importante (figure 4). En outre, ces cellules ont été capables de se différencier en divers types de cellules neuronales et gliales lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions pro-différenciation (figure 5). <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Morphologie d'une colonie hautement proliférative après le placage d'abord des tissus médulloblastome dissociées. Généralement, une colonie importante des formes dans les 5 jours après l'ensemencement initial de tissu tumoral dissocié, et un représentant est illustré ici dans le champ lumineux. Bi-polaire, rayonnent des cellules allongées d'un agrégat de cellules noyau dense. Attaché aux cellules tumorales sont petites, rondes globules rouges, qui sont progressivement épuisés par placages de série. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Morphologie des cellules de médulloblastome établis au delà de trois passages. Cette image en champ clair montre l'aspect typique des cellules de médulloblastome établie après plusieurs passages. Les cellules restent essentiellement bi-polaire de haute nucléaire / cytoplasmique ratio. Nous montrons coloration tubuline acétylée de cellules tumorales, dont la plupart sont le vélo, comme indiqué par une forte Ki67 expression. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Cellules de médulloblastome Fondée expresse marqueurs des cellules souches neurales. SmoM2-YFP marques cellules exprimant constitutivement active Smo, donc activité de la voie Shh. Toutes les cellules des lignées cellulaires établies médulloblastome exprimé YFP, et la plupart d'entre eux co-exprimé des niveaux élevés de différents marqueurs des cellules souches neurales, tels que la nestine et Sox2. Fait intéressant, lorsque nous avons effectué la détection du signal YFP avec la puissance laser minimale pendant la microscopie confocale, nous avons détecté le signal YFP concentrés dans les cils des cellules + Sox2. Cette observation est cohérente avec un rapport récent que 12 décrit le rôle essentiel des cils dans le développement de la voie Shh-dépendant médulloblastome. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Fondée cellules tumorales subissent une expansion clonale. Après dissociation en suspension cellulaire unique, les cellules tumorales ont été étalées sur une plaque de 24 puits-à une densité clonale de 300 cellules par ml de milieu de culture. Dans chaque puits, nous avons observé des colonies par clonage élargi. Cette série d'images en champ clair démontrer les changements typiques sur une période de 10 jours de culture. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Analyses de différenciation des cellules de médulloblastome établie. Lorsque les cellules tumorales sont passés du FEM / bFGF contenant un milieu sans sérum à DMEM/10% de FBS, YFP + cellules tumorales sensiblement modifié leur morphology et différencié dans différents types cellulaires, y compris Tuj1 + ou + NeuN neurones, les cellules GFAP + astrogliales ou CNPase + oligodendrocytes.

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</ol>

Nous décrivons une façon efficace d&#39;isoler, d&#39;enrichir et de maintenir les cellules souches du tissu médulloblastome tumeur primaire récupérées à partir des souris mutantes avec constitutivement active de signalisation Hedgehog. Nous avons constaté qu&#39;un étape critique dans la réussite d&#39;un lignée tumorale des cellules souches saines est le traitement utilisé pendant Accutase la dissociation du tissu tumoral primaire. Dans notre expérience, lors de la première tissu tumoral dissociant du cervelet, 4 minu...

<table><tbody><tr><td>Milieu Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B27(-RA)</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td>50 %</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>0,1 %</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Plaques Primaria</td><td>Fisher Scientific</td><td>087724C</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Sox2</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4343</td><td>Souris, 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Nestin</td><td>DSHB</td><td>rat401</td><td>Souris, 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps anti-YFP</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A11122</td><td>Lapin, 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFAP</td><td>Neuromics</td><td>CH22102</td><td>Poulet, 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Tuj1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5076</td><td>Souris, 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-NeuN</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>Souris, 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CNPase</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB326</td><td>Souris, 1:1000</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement, l&#39;enrichissement et l&#39;entretien des cellules souches médulloblastome

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Les tumeurs cérébrales ont été proposés à posséder une petite population de cellules souches qui sont à l&#39;origine de la tumorigenèse. Dosages Neurosphère ont été généralement adoptée pour étudier la nature des cellules souches neurales, y compris ceux issus de tissus normaux et tumoraux. Cependant, des quantités appréciables de différenciation et mort cellulaire sont communs dans neurosphères culture probablement en raison de sous-optimale état tels que l&#39;accessibilité de toutes les cellules dans les agrégats sphère au milieu de culture. Médulloblastome, la plus fréquente des tumeurs pédiatriques du SNC, est caractérisé par sa progression rapide et tendance à se propager le long de la totalité du cerveau-rachidien axe avec le résultat clinique lamentable. Le médulloblastome est une tumeur neuro-du cervelet, comptant pour 20% et 40% des tumeurs intracrâniennes et la fosse postérieure dans l&#39;enfance, respectivement 1. Il est maintenant bien établi que la signalisation de Shh stimule la prolifération des précurseurs de neurones du cervelet granules (CGNPs) pendant le développement du cervelet 2-4. De nombreuses études utilisant des modèles de souris, dans lequel la voie Shh est constitutivement activé, ont lié la signalisation de Shh avec médulloblastome 5-9. Un récent rapport a montré que sous-ensemble de cellules provenant de souris médulloblastome LacZ Patched1 / + sont des cellules souches cancéreuses, qui sont capables d&#39;initier et propogating tumeurs 10. Nous décrivons ici une méthode efficace pour isoler, d&#39;enrichir et de maintenir les cellules souches tumorales dérivées de plusieurs modèles murins de médulloblastome, avec voie Shh constitutivement activé en raison d&#39;une mutation dans Smoothened (11, Héraion mentionné que SmoM2), un RCPG qui est essentiel pour Shh activation de la voie. Dans tous les tissus médulloblastome isolés, nous avons été en mesure d&#39;établir de nombreuses colonies très prolifératives. Ces cellules robuste exprimé plusieurs marqueurs des cellules souches neurales telles que Nestin et Sox2, peuvent subir des passages en série (plus de 20) et ont été clonogénique. Bien que ces cellules souches tumorales en culture ont été relativement faibles, souvent avec des armes nucléaires bipoar élevé par rapport au cytoplasme lorsqu&#39;elles sont cultivées dans des conditions favorisant la croissance des cellules souches, ils radicalement modifié leur morphologie, prolongée de plusieurs processus cellulaires, aplatie et se retire du cycle cellulaire lors de la commutation d&#39;une cellule milieu de culture supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. Plus important encore, ces cellules souches tumorales différenciées en Tuj1 + ou + NeuN neurones, les astrocytes et GFAP + + CNPase oligodendrocytes, soulignant ainsi leur multi-puissance. En outre, ces cellules ont été capables de propager des médulloblastomes secondaire lorsque orthotopique transplantées chez des souris hôte.

Ce protocole décrit l&#39;isolement, l&#39;enrichissement et l&#39;entretien des cellules tumorales médulloblastome souches dérivées de souris mutantes avec ectopique Sonic activité de la voie Hedgehog.

L&#39;isolement, l&#39;enrichissement et l&#39;entretien des cellules souches Médulloblastome

Il a été suggéré que les tumeurs cérébrales possèdent une petite population de cellules souches qui seraient à l'origine de la tumorigénèse. Les essais de neurosphères ont été...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler, d'enrichir et de maintenir des cellules de médulloblastome murin présentant des propriétés de cellules souches. Cette étape est réalisée en premier lieu par la dissection du tissu tumoral de médulloblastome provenant d'une souris génétiquement modifiée. La deuxième étape de la procédure consiste en une dissociation mécanique et enzymatique du tissu tumoral disséqué.La troisième étape de la procédure consiste à centrifuger les cellules tumorales dissociées, suivie de l'élimination de la solution enzymatique. La dernière étape de la procédure est la mise en culture des cellules tumorales dans des boîtes de culture tissulaire gélatinisées. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant la formation de cellules souches de médulloblastome fortement prolifératives, clonogéniques et multipotentes, capables de subir plusieurs passages et de propager des tumeurs secondaires par des tests d'allogreffe.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la méthode de culture de neurosphères pour les cellules souches cancéreuses, est qu'elle permet un accès équivalent aux nutriments, réduisant ains

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Ce protocole décrit l'isolement et la dissociation des tissus médulloblastome de la souris, et après allogreffe de cellules tumorales dans des souris immunodéprimées bénéficiaires afin d'initier un médulloblastome secondaire.

Intracrânienne allogreffe orthotopique de cellules dans des souris immunodéprimées Médulloblastome

Ce protocole vidéo démontre l'isolement et l'expansion des cellules souches comme des cellules de glioblastome mutliforme résection chirurgicale humaine (GBM) tissu tumoral en utilisant la méthode de dosage Neurosphère culture.

L&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère

L'identification des cellules tumorales du cerveau d'amorçage (BTICs), les cellules rares, dans un tumorales hétérogènes possédant des propriétés de cellules souches, offre de nouvelles perspectives sur la pathogénie des tumeurs cérébrales humaines. Nous avons amélioré les conditions de culture spécifiques pour enrichir BTICs, et nous avons l'habitude d'utiliser la cytométrie en flux pour enrichir davantage ces populations. D'auto-renouvellement des tests et de l'analyse par transcription seule...

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Protocole pour la propagation des spécimens chirurgicaux à haute teneur dissociés de gliome dans le milieu sans sérum de neurosphère pour sélectionner pour des cellules avec le phénotype de cellules souches cancéreuses. Pour les spécimens qui ne se développent pas en tant que neurosphères, un protocole alternatif est suggéré. Une technique de incorporation de paraffine pour maintenir l’architecture 3D de neurosphère pour immunocytochemistry est décrite.

Optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3D

cellules souches du cancer (CCM) sont impliqués dans la rechute de la tumeur en raison de la chimiorésistance. Nous avons optimisé un protocole pour la sélection et l'expansion de la CCF de lignées cellulaires de cancer de l'ovaire. En traitant les cellules avec le cisplatine chimiothérapeutique et la mise en culture d'une cellule souche promotion de médias nous enrichir en cultures SCC non adhérentes.

Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l&#39;ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

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Guidée par l’image de la résection du glioblastome et Implantation intracrânienne d’échafaudages de graines cellules souches thérapeutiques

Ce protocole permet le maintien des cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes in vitro en imitant le microenvironnement de moelle en utilisant des acides gras abondants, le cholestérol, des concentrations plus faibles de cytokines, et l’hypoxie.

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Ici, nous décrivons une méthode de génération d’organoïdes de glioblastome (GBM) à partir d’échantillons primaires de patients ou de cultures cellulaires dérivées de patients et de les maintenir jusqu’à maturité. Ces organoïdes GBM contiennent des populations cellulaires phénotypiquement diverses et recréent des microenvironnements tumoraux ex vivo.

Maintien ex vivo de la diversité cellulaire du glioblastome humain à l’aide d’une culture organoïde tridimensionnelle

La teneur en hydroperoxyde lipidique représente l’indicateur le plus couramment utilisé de la mort cellulaire ferroptotique. Cet article présente l’analyse par cytométrie en flux étape par étape de la teneur en hydroperoxyde lipidique dans les cellules lors de l’induction de la ferroptose.

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Ici, nous décrivons un système de nucléofection conçu pour améliorer l’efficacité de l’administration de gènes dans les cellules souches neurales (NSC) élargies isolées de la zone sous-ventriculaire murine adulte. Les résultats démontrent que cette méthode améliore considérablement la perturbation des gènes dans les CSN, surpassant l’efficacité des protocoles de transfection traditionnels et augmentant le taux de survie cellulaire.

Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Le présent protocole décrit une méthode rentable pour purifier, étendre et caractériser des cellules souches mésenchymateuses (BMSC) de moelle osseuse hautement homogènes provenant de souris. Cette approche facilite l’acquisition de grandes quantités de BMSC à fort potentiel de prolifération et de différenciation, soutenant les modèles murins et faisant progresser la recherche préclinique.

Purification, expansion et phénotypage basé sur la cytométrie en flux de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse dérivées de souris

Découvrez une méthode efficace pour isoler et maintenir des cellules souches de médulloblastome à partir de modèles murins modifiés génétiquement. Cette technique améliore les cultures de neurosphères en réduisant la différenciation spontanée et la mortalité cellulaire.

L'isolement, l'enrichissement et l'entretien des cellules souches Médulloblastome

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