Name: Double fluorescence In situ dans des coupes de cerveau frais (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Découvrez la double hybridation in situ fluorescente pour détecter simultanément deux transcrits dans des coupes de cerveau frais à résolution cellulaire. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique neuronale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les travaux pris en charge par des subventions du NIH / NIDCD et la Fondation Schmitt à RP.

Ce protocole a été développé et affiné basé sur le standard radioactifs et non radioactifs des méthodes d'hybridation in situ, développée précédemment par nous et les autres afin de détecter une ou deux espèces transcription dans 1-7 tissu cérébral. Le protocole décrit ci-dessous a une longueur totale de 2 ou 3 jours, selon le nombre d'interruptions de procédure choisie par l'utilisateur final. Toutes les étapes détaillées ci-dessous doivent être menées à température ambiante, à l'exception de l'étape d'hybridation ribosonde et post-hybridation lavages. Les solutions et les tampons requis pour toutes les étapes de cette méthode peut être trouvée à la fin de ce protocole. 1. Préparation des tissus et de sectionnement <ol><li> Décapiter et extrait de cerveau du sujet rapidement, et le placer dans un moule en plastique de taille suffisante. </li><li> Couverture du cerveau avec Tissue-Tek milieu d'inclusion et de placer rapidement le moule en plastique dans un bain dry-ice/alcohol pour congélation rapide. Tissus congelés peuvent être conservés à -80 ° C jusqu'à utilisation. </li><li> L'utilisation d'un cryostat, de recueillir 2 ou 3 coupes de cerveau par glisser sur Superfrost demandé, majoré des diapositives. Epaisseur des sections devrait être de 10 à 12 um. Les diapositives peuvent être conservés à -80 ° C jusqu'à utilisation. </li></ol> 2. Préparation des colonnes Sephadex G50 pour la purification de la sonde «Colonnes Sephadex peuvent être achetés auprès de sources commerciales, cependant, nous fournissons ci-dessous une alternative à faible coût pour la génération de colonnes, ce qui sera nécessaire pour la purification de la sonde. <ol><li> Hydratez quantité adéquate de Sephadex G50 poudre avec RNase, traitée par DEPC eau (par exemple, 2 g de poudre dans 100 ml d'eau traitée au DEPC), brièvement solution de mélanger et conserver à température ambiante pour précipiter l'excès de Sephadex G50. </li><li> Retirer le surnageant (couche supérieure de l'eau) à la suite de Sephadex G50 précipitations. </li><li> Répétez le processus ci-dessus 3 - 5 fois. </li><li> Après le lavage final, re-suspendre le Sephadex G50 solution dans un tampon TE (1:1), et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. </li><li> Placez autoclavé laine de verre dans une seringue de 1 ml stériles et le compresser avec le piston pour faire une couche compacte au fond, puis placez la seringue dans un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Mélangez bien la solution de Sephadex G50 dans TE. Remplir la seringue / colonne avec cette solution. </li><li> Centrifuger la colonne pendant 30 sec à 1000 rpm. </li><li> Répétez cette procédure jusqu'à ce que la colonne est presque complètement rempli de billes de Sephadex G50. </li><li> Appliquer 200 pi de tampon de colonne de lavage à la colonne et on centrifuge pendant 2 min à 1000 rpm. Jeter l'éluat. </li><li> Appliquer 200 pi de tampon de colonne de blocage à la colonne et la faire tourner pendant 2 min à 1000 rpm. Répétez cette étape fois 4-5 à équilibrer la colonne. Les colonnes peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à leur utilisation s'ils sont scellés avec du parafilm. </li></ol> 3. Étiquetage et purification de ribosondes Ci-dessous nous détaillons la production et la purification d'une ribosonde unique. Pour dFISH, la préparation de chaque sonde impliquera la même méthodologie, sauf que l'une des sondes sera marquée à la digoxigénine (DIG)-UTP marqués tandis que l'autre avec de la biotine-UTP marqués. <ol><li> Préparer une solution concentrée (&gt; 150 ng / pl) et solution purifiée d'ADNc linéarisées d'intérêt pour générer ou l'autre sens (de contrôle) ou ribosondes antisens. </li><li> Dans un tube de 1,5 ml, ajouter 0,5 à 1 mg de protéine purifiée de matrice d'ADNc, 2 pl de tampon de la sonde étiquetage 5X, 1 pl de DIG 10X (ou biotine)-étiquetage mélanger, 0,5 pi de RNasine et 1 pl de la ARN polymerase appropriée , et porter le volume final de la solution à 10 ul avec RNAse free (traité au DEPC) d'eau. </li><li> Incuber la solution dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Ajouter 1 ul d'ARNt (stock; 20 pg / pl), et 39 pi de tampon de colonne de blocage à la solution. </li><li> Préparer la colonne de Sephadex G50 pour la purification de la sonde. À cette fin, ajouter 50 ul de tampon de blocage à la colonne et la faire tourner pendant 10 sec à 1000 rpm. Répétez cette étape 2-3 fois pour équilibrer la colonne (ie, le 50 ul appliquée à la colonne sont récupérés après cycle de centrifugation). </li><li> Appliquer la solution de sonde à l'Sephadex G50 colonne, la position d'un tube de centrifugeuse nouvelles au bas de la colonne, et la faire tourner pendant 3 min à 1000 rpm pour obtenir le purifiée 50 ul de solution ribosonde. </li><li> Évaluer la qualité et le rendement de ribosonde marquée en utilisant soit une norme de formaldéhyde-agarose ARN gel, ou un spectrophotomètre. </li></ol> 4. Post-fixation, l'acétylation et hybridation <ol><li> Supprimez les parties du congélateur à -80 ° C et permettent une température ambiante de s'équilibrer. Par la suite, incuber sections dans un froid, fraîchement fait une solution de paraformaldéhyde 3% pendant 5 min. </li><li> Rincer brièvement sections phosphate saline tamponnée (PBS) à deux reprises. </li><li> Déshydrater sections à travers une série d'alcool type (70, 95 et 100%; 2 minutes chacun), et laissez-les sécher à l'air. </li><li> Incuber sections dans une solution acétylation pendant 10 min. </li><li> Rincer les sections 3 fois dans 2X SSPE. </li><li> Déshydrater sections une fois de plus grâce à la série d'alcool standard décrit ci-dessus, et leur permettre de sécher à l'air. </li><li> Préparer un volume adéquat de solution d'hybridation et d'ajouter deux ribosondes à la solution (concentration de la sonde: 1 ng / pl pour chaque sonde). Le volume total de la solution d'hybridation est déterminée en fonction du nombre de sections à hybrider (16 ul de solution d'hybridation par section). </li><li> Appliquer un volume suffisant de la solution d'hybridation des lames de tissu et la lamelle veiller à ce qu'aucun des bulles d'air superposition des tissus. </li><li> Placer les lames dans un support de diapositives de métal. Titulaire Plongez dans un bain d'huile minérale réglé à 65 ° C pendant la nuit. Assurez-vous que des lamelles sont face vers le haut (c'est à dire, la face latérale du support de diapositives doivent être en contact avec le fond du récipient d'huile minérale). </li></ol> 5. Post-hybridation Lave <ol><li> Le lendemain, retirez soigneusement le support de diapositives du bain d'huile minérale et brièvement le rincer dans du chloroforme pour éliminer l'excès d'huile à partir des diapositives. </li><li> Placer les lames dans une solution de 2X SSPE pour les 5-10 min. Lamelles doit se détacher de diapositives tout en solution. </li><li> Placer les lames dans une nouvelle solution 2X SSPE, et de les garder pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Transfert des sections dans une solution contenant 2X SSPE, plus 50% de formamide. La température de cette solution doit correspondre à la température utilisée dans la procédure de l'hybridation pendant la nuit. Gardez diapositives dans cette solution pendant 1,5 heures. </li><li> Transfert des sections d'une solution 0,1 X SSPE préchauffée à la même température de l'étape d'hybridation. Incuber sections dans cette solution pendant 30 min. Répétez cette étape pour 30 minutes supplémentaires. </li></ol> 6. Détection et visualisation de ribosondes <ol><li> Transfert diapositives tampon TNT à laquelle le peroxyde d'hydrogène de 0,3% a été ajoutée, pour 10 min. </li><li> Lavez sections dans du tampon TNT, 3 fois (10 minutes chacun). </li><li> Utiliser un stylo DAKO, dessiner un puits autour de la zone contenant les coupes de cerveau. Surtout, il faut être prudent afin d'assurer que les articles ne se dessèchent pas. </li><li> Appliquer 150 pi de tampon TNB à chaque diapositive, et incuber sections dans cette solution pendant 30 min, dans une chambre humide. </li><li> Retirer l'excès solution TNB par des diapositives basculement. </li><li> Appliquer 150 ul de solution contenant TNB-peroxydase anticorps anti-DIG, et glisse stocker dans une chambre humide pendant 2 heures. Concentration d'anticorps doit être déterminée individuellement pour chaque transcription d'intérêt avant d'effectuer dFISH. </li><li> Lavez sections dans du tampon TNT; 3 fois, 10 minutes chacun. </li><li> Appliquer 150 ul d'Alexa 594-conjugué solution tyramide travail pour chaque diapositive, et les stocker dans une chambre humide pendant 1 heure. Cette solution doit être préparée selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections dans du tampon TNT; 3 fois, 10 minutes chacun. </li><li> Sections Incuber dans tampon TNT à laquelle le peroxyde d'hydrogène de 0,3% a été ajoutée pour 10 - 30 min. </li><li> Lavez sections dans du tampon TNT; 3 fois, 10 minutes chacun. </li><li> Appliquer 150 pi de tampon TNB par diapositive, et les garder dans une chambre humide pendant 30 min. </li><li> Retirer l'excès solution TNB par des diapositives basculement. </li><li> Ajouter 150 ul de la solution contenant TNB conjugué à la peroxydase d'anticorps anti-biotine, et glisse stocker dans une chambre humide pendant 2 heures. </li><li> Lavez sections dans du tampon TNT; 3 fois, 10 minutes chacun. </li><li> Appliquer 150 ul d'un Alexa 488-conjugué solution tyramide travail pour les diapositives et les sections incuber pendant 1 heure. Cette solution doit être préparée conformément aux recommandations du fabricant. </li><li> Lavez sections dans du tampon TNT; 3 fois, 10 minutes chacun. </li><li> Ajouter 150 pi de solution de Hoechst (1:1000 dans du tampon TNT) pour les sections et les garder dans la chambre humide pendant 2 min. </li><li> Laver les coupes dans du tampon TNT; 3 fois, 5 minutes chacun. </li><li> Sections lamelle avec un milieu de montage compatibles fluorescence (par exemple, ou de prolonger Vectashield Antifade). </li></ol> 7. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Nous montrons ici les résultats obtenus dFISH représentatives dans le cerveau diamant mandarin. Illustré sont des microphotographies obtenues à partir des caudomedial nidopallium (MR), l'analogue d'oiseaux chanteurs du cortex auditif des mammifères. Coupes de cerveau ont été hybridés avec une ribosonde biotinylé dirigé contre la parvalbumine (A), un marqueur d'une sous-population de neurones inhibiteurs, et une DIG marqué ribola sonde dirigée contre les Zenk dépendant de l'activité du gène (B), un marqueur fiable de la chanson axé sur les neurones. C) Superposition de (A) et (B) montre une population de neurones inhibiteurs qui sont activés par l'expérience auditive. Flèches et pointes de flèches indiquent les cellules marquées exclusivement avec chacun des deux ribosondes, et les astérisques indiquent les neurones représentant de co-exprimant les deux transcriptions d'intérêt. Barre d'échelle = 25 um.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

Nous avons utilisé ce protocole pour étudier comment le cerveau des vertébrés est neurochemically et fonctionnellement organisés, et de déterminer comment behaviorally pertinentes impact sensoriel des stimuli de la génomique des machines de neurones dans le cerveau adulte de 80 à 10. Nous avons utilisé avec succès cette méthode dans le tissu cérébral de souris, les rats et les oiseaux chanteurs, mais attendons à ce que ce protocole sera facilement adaptable à des sections de cerveau obtenue à partir d&#39;un ...

Solutions <ol><li> Tampon de colonne de lavage: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M de NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 ug / ul ARNt, SDS 0,1% dans 50 ml d&#39;eau traitée par DEPC. </li><li> Tampon de colonne de blocage: 10 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, 0,1 mM d&#39;EDTA dans 50 ml d&#39;eau traitée par DEPC. </li><li> Tampon TNT: 60 ml de 1 M Tris-HCl, 18 ml de NaCl 5 M et 1,8 ml de Triton X-100 dans 600 ml d&#39;eau traitée au DEPC. </li><li> TNB mémoire tampon: 100 mM Tris-HCl, 8,3 g / ul BSA, 0,15 M de NaCl et 3% de Triton X-100 dans l&#39;eau traitée au DEPC. </li><li> Tampon TE: 10 mM Tris-HCI, pH 7,5 et 1 mM EDTA, pH 7,5. </li><li> L&#39;acétylation solution: 2,7 ml de triéthanolamine majoré de 0,5 ml d&#39;anhydride acétique dans 200 ml d&#39;eau traitée au DEPC. </li><li> La solution d&#39;hybridation: 50% de formamide, 2X SSPE, 2 ug / ul ARNt, 1 ug / ul BSA et 1 ug / ul poly A dans l&#39;eau traitée par DEPC. Il a besoin de 16 l par article. </li></ol>

double fluorescence in situ</emhybridation> dans des coupes de cerveau frais

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Nous décrivons ici une version modifiée d&#39;une fluorescence à double<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt; (dFISH) méthode optimisée pour la détection de deux ARNm d&#39;intérêt dans des coupes de cerveau frais congelé. Notre groupe a utilisé avec succès cette approche pour étudier des gènes co-régulation. Plus précisément, nous avons utilisé cette méthode pour explorer dFISH l&#39;organisation anatomique, les propriétés neurochimiques, et l&#39;impact de l&#39;expérience sensorielle dans le centre de circuits sensoriels, à la résolution seule cellule. Ce protocole a été validé dans le tissu cérébral de souris, les rats et les oiseaux chanteurs, mais devrait être facilement adaptable à d&#39;autres espèces de vertébrés, ainsi que d&#39;un éventail de tissus non neuraux. Dans ce film nous fournir une démonstration détaillée des principales étapes de cette procédure.

Ce protocole implique un non-radioactifs<em&gt; In-situ</emProcessus d&#39;hybridation&gt; qui permet l&#39;identification simultanée des deux espèces transcription, à une résolution seule cellule, dans les sections minces du cerveau des vertébrés.

Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Nous décrivons ici une version modifiée d'une méthode d'hybridation in situ en fluorescence double (dFISH), optimisée pour la détection de deux ARNm d'intérêt dans des échantillons frais...

Bonjour, je suis JA, chercheur postdoctoral associé au laboratoire AL de l'Université de Rochester. Nous allons vous montrer le processus d'hybridation par digestion hybride sur des sections de cerveau congelées fraîches afin de détecter simultanément deux transcrits d'ARNm avec une résolution au niveau cellulaire unique. Cette méthode permet de répondre à des questions dans le domaine des neurosciences, telles que celles liées à l'organisation anatomique, fonctionnelle, moléculaire et neurochimique d'un circuit cérébral spécifique.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la coagulation génique dans les neurones du cerveau AV, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les rongeurs, ainsi qu'à divers types de tissus nerveux. Pour commencer cette procédure, hydrater une quantité suffisante de poudre SDX G 50 avec des ARN à l'eau.Mélangez brièvement la solution et laissez-la à température ambiante pendant deux à cinq minutes. Cette étape permet de séparer les billes SDX du dextrose présent dans la poudre Sedex commerciale après la précipitation au Sedex G 50. Retirez le sennet et répétez le processus trois à cinq fois. Après le dernier lavage, resuspendez la solution de SX G 50 dans du tampon TE selon un rapport volumétrique de un à un (tampon par rapport aux billes) et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation.Ensuite, préparez les colonnes. Placez de la ouate de verre stérilisée au autoclave dans une seringue stérile d'un millilitre et comprimez-la avec le piston afin de former une couche compacte au fond. Puis placez la seringue dans un tube conique de 15 millilitres.Remplir les colonnes avec la solution Sedex G 50 par centrifugation à 1000 tours par minute pendant 30 secondes à l’aide d’une centrifugeuse Beckman équipée d’un rotor fixe angulaire C 0 6 5 0. Après la centrifugation, laver chaque colonne en appliquant 200 microlitres de tampon de lavage des colonnes et en centrifugeant pendant deux minutes à 1000 tours par minute.Comme précédemment. Appliquez enfin 200 microlitres de tampon de blocage de la colonne sur chaque colonne et centrifugez deux minutes à 1000 tours par minute. Répétez cette étape quatre à cinq fois pour équilibrer la colonne.Conserver les colonnes préparées à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que la sonde RIBA soit marquée et prête à être purifiée pour la double hybridation in situ en fluorescence C deux ou la procédure D FISH présentée ici. Deux sondes ARN sont préparées, l'une marquée avec de l'haptenoyle-digoxigénine ou DIG et l'autre avec de la biotine. Commencer le marquage des sondes en préparant les solutions de marquage ribo-probe et en incubant les réactions de marquage dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À la fin de l'incubation de deux heures, ajouter un microlitre d'ARNt à 20 microgrammes par microlitre et 39 microlitres de tampon de blocage de colonne à chaque réaction de marquage.Préparez ensuite les colonnes EDEX G 50 pour la purification de la sonde en ajoutant 50 microlitres de tampon de blocage à chaque colonne et en centrifugeant pendant trois minutes à 2000 rotations par minute. Répétez cette étape deux à trois fois afin d'équilibrer les colonnes. Lorsque les colonnes sont prêtes, placez un nouveau tube EEND orph à la base de la colonne.Appliquer la solution de sonde sur la colonne Sedex G 50 et centrifuger pendant trois minutes à 2000 tours par minute. Pour obtenir les 50 microlitres purifiés de solution de sonde Ribo, évaluer la qualité et le rendement de la sonde ribo marquée et purifiée. Avant de passer à l'hybridation à l'aide d'un cryostat, déposer deux ou trois sections cérébrales sur des lames charge super frost plus.L'épaisseur de la coupe doit être comprise entre 10 et 12 micromètres. Les lames peuvent être conservées à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Incuber les coupes dans une solution fraîchement préparée de paraformaldéhyde à 3 %, froide, pendant cinq minutes.Ensuite, rincez brièvement les sections deux fois dans du PBS. Puis, déshydratez les sections à l'aide d'une série alcoolique standard composée de solutions d'éthanol à 70, 95 et 100 %, pendant deux minutes dans chaque solution. Après la déshydratation des sections, incubez-les dans une solution d'acétylation fraîchement préparée pendant 10 minutes.Ensuite, rincez les sections trois fois dans du SSPE 2×, puis déshydratez à nouveau les sections après l'acétylation selon la série standard d'alcool comme vient d'être indiqué. Commencez maintenant l'hybridation avec la sonde ribo. Appliquez un volume adéquat de la solution d'hybridation sur le tissu, couvrez les lames avec des lamelles et placez les lames dans un support métallique pour lames.Immerger le porte-lame dans un bain d'huile minérale réglé à 65 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le jour suivant, retirer soigneusement le porte-lame du bain d'huile minérale et le rincer brièvement dans du chloroforme pour éliminer l'excès d'huile des lames.Placer les lames dans une solution SSPE deux fois pendant cinq à dix minutes afin de retirer la lamelle. Après avoir retiré la lamelle, transférer les lames dans une nouvelle solution SSPE deux fois et les conserver pendant une heure à température ambiante. Au début de cette étape d'incubation, préchauffer la solution SSPE deux fois plus 50 % de formamide à la même température que celle utilisée pour l'hybridation. Procéder à l'étape suivante à la fin de l'incubation d'une heure.Transférez les lames dans la solution SSPE deux fois préchauffée et incubez pendant 1,5 heure. Au début de cette étape d'incubation, préchauffez une solution de SSPE 0,1 fois à la même température que celle utilisée lors de l'étape d'hybridation. Terminez les lavages post-hybridation en transférant les lames dans la solution SSPE 0,1 fois PRÉCHAUFFÉE et incubez pendant 30 minutes.Répétez ce lavage une fois. Les sections cérébrales sont désormais prêtes pour la détection et la visualisation des sondes ribo hybridées : ajoutez 0,3 % de peroxyde d'hydrogène au tampon TNT et incubez les lames dans cette solution pendant 10 minutes. Lavez ensuite les lames trois fois dans le tampon TNT, 10 minutes à chaque fois, en utilisant un stylo de décollage.Dessinez un puits autour de la zone contenant les sections cérébrales. Appliquez 150 microlitres de tampon TNB sur chaque lame et incubez les sections dans cette solution pendant 30 minutes. Veillez à ce que les sections ne s'assèchent pas pendant cette étape.Ensuite, appliquez 150 microlitres de solution TT NB contenant l'anticorps anti-DIG conjugué à la peroxydase et placez les lames dans une chambre humide pendant deux heures. À la fin de l'incubation de deux heures, lavez les sections trois fois dans le tampon TNT pendant 10 minutes. À chaque fois, appliquez 150 microlitres de solution de travail T IDE conjuguée à l’Alexa 5 9 4 sur chaque lame et placez les lames dans une chambre humide pendant une heure.À la fin d'une heure, laver les sections dans le tampon TNT trois fois pendant 10 minutes. Incuber les sections chaque fois dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 0,3 % dans le tampon TNT pendant 10 à 30 minutes. Le temps d'incubation dans la solution de peroxyde d'hydrogène dépend de l'abondance de l'ARNm et doit être testé préalablement à l'expérience D fish.Ensuite, rincer les sections dans la solution TNT trois fois, pendant 10 minutes à chaque fois. Appliquer 150 microlitres de solution TMB par lame et laisser les lames dans une chambre humide pendant 30 minutes. Éliminer l'excès de solution TMB en inclinant les lames.Ajouter 150 microlitres de solution TMB contenant un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase, puis conserver les lames dans une chambre humide pendant deux heures. Rincer ensuite les sections trois fois dans du tampon TNT pendant 10 minutes. À chaque fois, appliquer 150 microlitres d'une solution travail d'anticorps acariens conjugués à l’Alexa 488 sur les lames et incuber les sections pendant une heure.Ensuite, laver les sections dans le tampon TNT trois fois pendant 10 minutes à chaque fois. Maintenant que les deux sondes ribo sont marquées par des anticorps, incuber les sections dans 150 microlitres de solution hôte pendant deux minutes. Puis laver les sections dans le tampon TNT trois fois pendant cinq minutes à chaque fois, ajouter un milieu de montage compatible avec la fluorescence, tel que Vector Shield ou Prolong Antifa, aux sections, couvrir avec une lame à couvrir et observer au microscope à fluorescence.Ces microphotographies représentatives proviennent d'une expérience sur des poissons D avec des coupes cérébrales de moineau domestique, spécifiquement de la région NCM, l'analogue aviaire du cortex auditif des mammifères. Les coupes cérébrales ont été hybridées avec deux sondes : une sonde ribo marquée à la biotine dirigée contre la parvalbumine, un marqueur d'une sous-population de neurones inhibiteurs, et une sonde ribo marquée au DIG dirigée contre le gène dépendant de l'activité zinc, un marqueur fiable des neurones activés par le chant. Un recouvrement des deux images montre une population cellulaire de neurones inhibiteurs activés par l'expérience auditive.Les flèches indiquent les cellules marquées exclusivement avec la sonde ribo pour par. Les flèches d'albumine indiquent les cellules marquées exclusivement avec la sonde RIBA pour le zinc ; les neurones représentatifs exprimant les deux transcrits d'intérêt sont marqués d'un astérisque. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de garder votre paillasse propre et d'utiliser des solutions, des plastiques et du matériel en verre exempts de RNase.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de détecter simultanément deux espèces de MA, avec une résolution au niveau de la cellule unique, dans des sections fraîches congelées de cerveau afin d'étudier la co-régulation des gènes dans le cerveau de rat. Merci d'avoir regardé cette vidéo. Bonne chance dans vos expériences.

double-fluorescence-in-situ-hybridization-in-fresh-brain-sections

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous décrivons ici une méthode rapide et simple à l'image des cellules marquées par fluorescence dans les tranches de cerveau semi-épais. En fixant, le tranchage, et optiquement compensation du tissu cérébral, nous décrivons comment la norme d'imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et des réseaux neuronaux dans les tissus nerveux intact.

Une approche rapide à l&#39;imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais

Source : Jolly, S., et.al. Combinaison de l’hybridation in situ à double fluorescence  avec immunomarquage pour la détection de l’expression de trois gènes dans des sections de cerveau de souris. J. Vis. Exp. (2016). Cette vidéo démontre l’utilisation de l’hybridation in situ à double fluorescence pour visualiser l’expression de deux cibles d’ARN dans des coupes de cerveau de souris. Le protocole implique une détection séquentielle de l’ARN à l’aide de sondes marquées à la fluorescéine, à...

 Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris

Source : Baleriola, J., et. al., Détection d’ARNm localisés axonalement dans des sections de cerveau à l’aide de l’hybridation in situ à haute résolution.  J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre la détection de l’ARNm dans les axones cholinergiques dans des tranches d’hippocampe de souris fixes à l’aide de l’hybridation fluorescente in situ et de la coloration par anticorps. La microscopie à fluorescence révèle la localisation spatiale des ARNm marqués par sonde et de la choline...

Immunomarquage de neurones dans des tranches de cerveau de souris suite à une hybridation in situ par fluorescence

ARN L’hybridation in situ (ISH) permet de visualiser les ARN dans les cellules et les tissus. Nous montrons ici comment la combinaison de l’ARNASCOPE ISH avec l’immunohistochimie ou les colorants histologiques peut être utilisée avec succès pour détecter les ARNm localisés aux axones dans des sections de cerveaux de souris et d’humains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

Ce protocole décrit en détail comment transfecter spécifiquement différentes régions du système nerveux central C57BL/6 via électroporation in utero. Ce protocole comprend des instructions détaillées pour les transfections de régions qui se développent dans le cortex, l’hippocampe, le thalamus, l’hypothalamus, le noyau septal latéral et le striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em&gt; In Utero</em&gt; L&#39;électroporation dans la souris C57BL / 6

La localisation de l’expression génique sur des types de cellules spécifiques peut être difficile en raison de l’absence d’anticorps spécifiques. Nous décrivons ici un protocole de triple détection simultanée de l’expression génique en combinant l’hybridation in situ d’ARN à double fluorescence avec l’immunomarquage.

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

La technique de flottaison libre permet aux chercheurs d’effectuer des colorations histologiques, y compris l’immunohistochimie, sur des coupes de tissus fixes afin de visualiser les structures biologiques, le type cellulaire et l’expression et la localisation des protéines. Il s’agit d’une technique histochimique efficace et fiable qui peut être utile pour étudier une multitude de tissus, tels que le cerveau, le cœur et le foie.

Colorations histologiques utilisant des sections de tissus flottant librement

Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.

Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

Nous présentons un protocole détaillé pour la microscopie corrélative à la lumière et à la lumière électronique post-intégration d’Epon en utilisant une protéine fluorescente appelée mScarlet. Cette méthode permet de maintenir simultanément la fluorescence et l’ultrastructure. Cette technique se prête à une grande variété d’applications biologiques.

Microscopie corrélative à la lumière et à la microscopie électronique post-intégration d’Epon

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Cette étude présente un protocole simplifié pour le traitement des tissus impliquant la décapitation, la fixation, la cryosection, la coloration par fluorescence, l’immunocoloration et l’imagerie, qui peut être étendu à l’imagerie confocale et multiphotonique. La méthode maintient une efficacité comparable à celle des dissections complexes, en contournant le besoin de motricité avancée. L’analyse quantitative d’images offre un vaste potentiel d’investigation.

Cryosectionnement direct des têtes de drosophile pour une coloration par fluorescence cérébrale et une immunocoloration améliorées

Découvrez la double hybridation in situ fluorescente pour détecter simultanément deux transcrits dans des coupes de cerveau frais à résolution cellulaire. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique neuronale.

Double fluorescence In situ dans des coupes de cerveau frais

Explorer plus de vidéos