Double fluorescence In situ dans des coupes de cerveau frais

Bonjour, je suis associé de recherche postdoctoral JA au laboratoire d’aide à l’Université universelle de Rochester. Nous allons vous montrer la digestion hybride du Process Institute dans des coupes de cerveau fraîchement congelé pour détecter simultanément deux transcrits MRN à une résolution de cellule unique. Cette méthode peut vous aider à vous poser des questions dans le domaine des neurosciences, telles que la pratique relative à l’organisation anatomique, fonctionnelle, moléculaire et neurochimique d’un circuit cérébral de comprimé.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la coagulation des gènes dans les neurones du cerveau AV. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les rongeurs, ainsi qu’à une variété de tissus neuraux. Pour commencer cette procédure, hydratez une quantité adéquate de poudre SDX G 50 avec des ARN à travers l’eau.

Mélangez brièvement la solution et conservez la température ambiante pendant deux à cinq minutes. Cette étape sépare les billes SDX du dextrose présent dans la poudre de sedex commerciale après la précipitation du Sedex G 50. Retirez la sennet et répétez le processus trois à cinq fois après le lavage final, puis suspendez la solution SX G 50 dans un tampon TE à un rapport tampon/volume de bille de un pour un et stockez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.

Ensuite, préparez les colonnes. Placez la laine de verre autoclave dans une seringue stérile d’un millilitre et comprimez-la avec le piston pour former une couche compacte au fond. Placez ensuite la seringue dans un tube faucon de 15 millilitres.

Remplissez les colonnes avec la solution Sedex G 50 avec centrifugation à 1000 rotations par minute pendant 30 secondes à l’aide d’une centrifugeuse Beckman équipée d’un rotor à angle fixe C 0 6 5 0. Après centrifugation. Lavez chaque colonne en appliquant 200 microlitres de tampon de lavage de colonne et en centrifugeant pendant deux minutes à 1000 rotations par minute.

Comme avant. Enfin, appliquez 200 microlitres de tampon de blocage de colonne sur chaque colonne et tournez pendant deux minutes à 1000 rotations par minute. Répétez cette étape quatre à cinq fois pour équilibrer la colonne.

Stockez les colonnes préparées à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que la sonde RIBA soit étiquetée et prête pour la purification pour la procédure de double fluorescence en hybridation C deux ou D FISH illustrée ici, deux sondes d’ARN sont préparées, l’une marquée avec de l’oxygène ou assurée par DIG et l’autre avec de la biotine. Commencez à étiqueter les sondes en préparant les solutions de marquage de la sonde ribo et en incubant les réactions de marquage dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À la fin de l’incubation de deux heures, ajoutez un microlitre de 20 microgrammes par microlitre d’ARNt et 39 microlitres de tampon de blocage de colonne à chaque réaction d’étiquetage.

Préparez ensuite les colonnes EDEX G 50 pour la purification de la sonde en ajoutant 50 microlitres de tampon de blocage à chaque colonne et en tournant pendant trois minutes à 2000 rotations par minute. Répétez cette étape deux à trois fois pour équilibrer les colonnes. Lorsque les colonnes sont prêtes, placez un nouveau tube EEND orph au bas de la colonne.

Appliquez la solution de sonde sur la colonne Sedex G 50 et tournez pendant trois minutes à 2000 rotations par minute. Pour obtenir les 50 microlitres purifiés de la solution de sonde Ribo, évaluez la qualité et le rendement de la sonde ribo étiquetée et purifiée. Avant de procéder à l’hybridation à l’aide d’un cryostat, prélevez deux ou trois sections de cerveau sur des lames de charge super frost plus.

L’épaisseur de la section doit être de 10 à 12 microns. Les lames peuvent être stockées à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Incuber les sections dans une solution froide et fraîche de para-formaldéhyde à 3 % pendant cinq minutes.

Ensuite, rincez brièvement les sections deux fois dans PBS. Ensuite, déshydratez les sections à travers une série d’alcool standard de solutions d’éthanol à 70, 95 et 100 % pendant deux minutes dans chaque solution. Après avoir déshydraté les sections, incubez-les dans une solution d’acétylation fraîchement préparée pendant 10 minutes.

Ensuite, rincez les sections trois fois en deux fois les sections SSPE déshydratées après acétylation une fois de plus à travers la série d’alcool standard comme indiqué ci-dessus. Lancez maintenant l’hybridation avec la sonde ibo. Appliquez un volume adéquat de la solution d’hybridation sur le tissu, recouvrez les lames avec des lamelles et placez les lames dans un porte-lames métallique.

Plongez le support dans un bain d’huile minérale réglé à 65 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain. Retirez délicatement le support de diapositives du bain d’huile minérale et rincez-le brièvement au chloroforme pour éliminer l’excès d’huile des lames.

Placez les lames dans une solution SSPE deux fois pendant cinq à 10 minutes afin de retirer la lamelle. Après avoir retiré la lamelle, transférez les lames dans une nouvelle solution SSPE deux fois et conservez-les pendant une heure à température ambiante au début de cette étape d’incubation. La solution préchaude de deux fois SSPE plus 50 % aide à la même température que lors de l’hybridation. Étape à la fin de l’incubation d’une heure.

Transférez les lames dans l’EPSS d’avant-guerre deux fois pour la solution maide et incubez pendant 1,5 heure. Au début de cette étape d’incubation, préchauffer une solution de 0,1 fois SSPE à la même température que lors de l’étape d’hybridation. Terminez les lavages post-hybridation en transférant les lames dans la solution SSPE PREWARM 0,1 fois et incubez pendant 30 minutes.

Répétez ce lavage une fois. Les sections cérébrales sont maintenant prêtes pour la détection et la visualisation des sondes ribo hybrides contenant 0,3 % de peroxyde d’hydrogène et de tampon TNT et incubez les lames dans cette solution pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames dans un tampon TNT trois fois pendant 10 minutes à chaque fois à l’aide d’un stylo déco.

Dessinez un puits autour de la zone contenant les sections du cerveau. Appliquez 150 microlitres de tampon TNB sur chaque lame et incubez les sections dans cette solution pendant 30 minutes. Assurez-vous que les sections ne se dessèchent pas pendant cette étape.

Ensuite, appliquez 150 microlitres de solution TT NB contenant l’anticorps anti DIG conjugué à la peroxydase et conservez les lames dans une chambre humide pendant deux heures. À la fin de l’incubation de deux heures, lavez les sections dans un tampon TNT trois fois pendant 10 minutes. À chaque fois, appliquez 150 microlitres de solution de travail T IDE conjuguée Alexa 5 9 4 sur chaque lame et stockez les lames dans une chambre humide pendant une heure.

Au bout d’une heure, lavez les sections dans un tampon TNT trois fois pendant 10 minutes. À chaque fois, incubez les sections dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % dans une solution tampon de TNT pendant 10 à 30 minutes. Le temps d’incubation dans la solution de peroxyde d’hydrogène dépend de l’abondance de l’ARNm et doit être testé avant l’apparition de poissons D.

Ensuite, souhaitez que les sections soient dans la mémoire tampon TNT trois fois pendant 10 minutes à chaque fois. Appliquez 150 microlitres de tampon TMB par lame et conservez les lames dans une chambre humide pendant 30 minutes. Retirez l’excès de solution TMB en inclinant les glissières.

Ajoutez 150 microlitres de solution TMB contenant un anticorps anin conjugué à la peroxydase et conservez les lames dans une chambre humide pendant deux heures. Ensuite, lavez les sections dans un tampon TNT trois fois pendant 10 minutes. À chaque fois, appliquez 150 relâchements de micro d’une solution de travail conjuguée contre les acariens Alexa 4 88 sur les diapositives et incubez les sections pendant une heure.

Ensuite, lavez les sections dans un tampon TNT trois fois pendant 10 minutes à chaque fois. Maintenant que les deux sondes ribo sont marquées par des anticorps, incubez les sections dans 150 microlitres de solution hôte pendant deux minutes. Ensuite, lavez les sections dans un tampon TNT trois fois pendant cinq minutes à chaque fois, ajoutez un support de montage compatible avec la fluorescence tel qu’un bouclier vectoriel ou un antifa prolongé à la couverture des sections avec une lamelle de couverture et observez au microscope fluorescent.

Ces photomicrographies représentatives proviennent d’une expérience de poisson D avec des sections de cerveau de pinson zébré, en particulier de la région NCM, l’analogue de l’oiseau chanteur du cortex auditif des mammifères. Des sections cérébrales ont été hybridées avec deux sondes, une sonde ribo biotinylée dirigée contre l’albumine de par, un marqueur pour une sous-population de neurones inhibiteurs et une sonde ribo marquée DIG dirigée contre le gène dépendant de l’activité zinc, un marqueur fiable pour les neurones pilotés par le chant. Une superposition des deux images montre une population cellulaire de neurones inhibiteurs qui sont activés par l’expérience auditive.

Les flèches indiquent les cellules marquées exclusivement avec la sonde ribo pour le par. Les flèches d’albumine indiquent les cellules marquées exclusivement avec la sonde RIBA pour les neurones représentatifs du zinc, les Coex exprimant les deux transcrits d’intérêts sont marqués d’un astérisque. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de maintenir votre banc propre et d’utiliser des solutions sans preuves, des plastiques et de la verrerie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter simultanément deux espèces de MA, une résolution de cellule unique dans des sections de cerveau fraîchement congelées pour étudier la co-régulation des gènes dans le cerveau. Merci d’avoir regardé la vidéo. Bonne chance dans vos expériences.