Double fluorescence In situ dans des coupes de cerveau frais
14 août 2010
Ce protocole implique un non-radioactifs In-situ qui permet l'identification simultanée des deux espèces transcription, à une résolution seule cellule, dans les sections minces du cerveau des vertébrés.
Bonjour, je suis JA, chercheur postdoctoral associé au laboratoire AL de l'Université de Rochester. Nous allons vous montrer le processus d'hybridation par digestion hybride sur des sections de cerveau congelées fraîches afin de détecter simultanément deux transcrits d'ARNm avec une résolution au niveau cellulaire unique. Cette méthode permet de répondre à des questions dans le domaine des neurosciences, telles que celles liées à l'organisation anatomique, fonctionnelle, moléculaire et neurochimique d'un circuit cérébral spécifique.
Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la coagulation génique dans les neurones du cerveau AV, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les rongeurs, ainsi qu'à divers types de tissus nerveux. Pour commencer cette procédure, hydrater une quantité suffisante de poudre SDX G 50 avec des ARN à l'eau.
Mélangez brièvement la solution et laissez-la à température ambiante pendant deux à cinq minutes. Cette étape permet de séparer les billes SDX du dextrose présent dans la poudre Sedex commerciale après la précipitation au Sedex G 50. Retirez le sennet et répétez le processus trois à cinq fois. Après le dernier lavage, resuspendez la solution de SX G 50 dans du tampon TE selon un rapport volumétrique de un à un (tampon par rapport aux billes) et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation.
Ensuite, préparez les colonnes. Placez de la ouate de verre stérilisée au autoclave dans une seringue stérile d'un millilitre et comprimez-la avec le piston afin de former une couche compacte au fond. Puis placez la seringue dans un tube conique de 15 millilitres.
Remplir les colonnes avec la solution Sedex G 50 par centrifugation à 1000 tours par minute pendant 30 secondes à l’aide d’une centrifugeuse Beckman équipée d’un rotor fixe angulaire C 0 6 5 0. Après la centrifugation, laver chaque colonne en appliquant 200 microlitres de tampon de lavage des colonnes et en centrifugeant pendant deux minutes à 1000 tours par minute.
Comme précédemment. Appliquez enfin 200 microlitres de tampon de blocage de la colonne sur chaque colonne et centrifugez deux minutes à 1000 tours par minute. Répétez cette étape quatre à cinq fois pour équilibrer la colonne.
Conserver les colonnes préparées à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que la sonde RIBA soit marquée et prête à être purifiée pour la double hybridation in situ en fluorescence C deux ou la procédure D FISH présentée ici. Deux sondes ARN sont préparées, l'une marquée avec de l'haptenoyle-digoxigénine ou DIG et l'autre avec de la biotine. Commencer le marquage des sondes en préparant les solutions de marquage ribo-probe et en incubant les réactions de marquage dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À la fin de l'incubation de deux heures, ajouter un microlitre d'ARNt à 20 microgrammes par microlitre et 39 microlitres de tampon de blocage de colonne à chaque réaction de marquage.
Préparez ensuite les colonnes EDEX G 50 pour la purification de la sonde en ajoutant 50 microlitres de tampon de blocage à chaque colonne et en centrifugeant pendant trois minutes à 2000 rotations par minute. Répétez cette étape deux à trois fois afin d'équilibrer les colonnes. Lorsque les colonnes sont prêtes, placez un nouveau tube EEND orph à la base de la colonne.
Appliquer la solution de sonde sur la colonne Sedex G 50 et centrifuger pendant trois minutes à 2000 tours par minute. Pour obtenir les 50 microlitres purifiés de solution de sonde Ribo, évaluer la qualité et le rendement de la sonde ribo marquée et purifiée. Avant de passer à l'hybridation à l'aide d'un cryostat, déposer deux ou trois sections cérébrales sur des lames charge super frost plus.
L'épaisseur de la coupe doit être comprise entre 10 et 12 micromètres. Les lames peuvent être conservées à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Incuber les coupes dans une solution fraîchement préparée de paraformaldéhyde à 3 %, froide, pendant cinq minutes.
Ensuite, rincez brièvement les sections deux fois dans du PBS. Puis, déshydratez les sections à l'aide d'une série alcoolique standard composée de solutions d'éthanol à 70, 95 et 100 %, pendant deux minutes dans chaque solution. Après la déshydratation des sections, incubez-les dans une solution d'acétylation fraîchement préparée pendant 10 minutes.
Ensuite, rincez les sections trois fois dans du SSPE 2×, puis déshydratez à nouveau les sections après l'acétylation selon la série standard d'alcool comme vient d'être indiqué. Commencez maintenant l'hybridation avec la sonde ribo. Appliquez un volume adéquat de la solution d'hybridation sur le tissu, couvrez les lames avec des lamelles et placez les lames dans un support métallique pour lames.
Immerger le porte-lame dans un bain d'huile minérale réglé à 65 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le jour suivant, retirer soigneusement le porte-lame du bain d'huile minérale et le rincer brièvement dans du chloroforme pour éliminer l'excès d'huile des lames.
Placer les lames dans une solution SSPE deux fois pendant cinq à dix minutes afin de retirer la lamelle. Après avoir retiré la lamelle, transférer les lames dans une nouvelle solution SSPE deux fois et les conserver pendant une heure à température ambiante. Au début de cette étape d'incubation, préchauffer la solution SSPE deux fois plus 50 % de formamide à la même température que celle utilisée pour l'hybridation. Procéder à l'étape suivante à la fin de l'incubation d'une heure.
Transférez les lames dans la solution SSPE deux fois préchauffée et incubez pendant 1,5 heure. Au début de cette étape d'incubation, préchauffez une solution de SSPE 0,1 fois à la même température que celle utilisée lors de l'étape d'hybridation. Terminez les lavages post-hybridation en transférant les lames dans la solution SSPE 0,1 fois PRÉCHAUFFÉE et incubez pendant 30 minutes.
Répétez ce lavage une fois. Les sections cérébrales sont désormais prêtes pour la détection et la visualisation des sondes ribo hybridées : ajoutez 0,3 % de peroxyde d'hydrogène au tampon TNT et incubez les lames dans cette solution pendant 10 minutes. Lavez ensuite les lames trois fois dans le tampon TNT, 10 minutes à chaque fois, en utilisant un stylo de décollage.
Dessinez un puits autour de la zone contenant les sections cérébrales. Appliquez 150 microlitres de tampon TNB sur chaque lame et incubez les sections dans cette solution pendant 30 minutes. Veillez à ce que les sections ne s'assèchent pas pendant cette étape.
Ensuite, appliquez 150 microlitres de solution TT NB contenant l'anticorps anti-DIG conjugué à la peroxydase et placez les lames dans une chambre humide pendant deux heures. À la fin de l'incubation de deux heures, lavez les sections trois fois dans le tampon TNT pendant 10 minutes. À chaque fois, appliquez 150 microlitres de solution de travail T IDE conjuguée à l’Alexa 5 9 4 sur chaque lame et placez les lames dans une chambre humide pendant une heure.
À la fin d'une heure, laver les sections dans le tampon TNT trois fois pendant 10 minutes. Incuber les sections chaque fois dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 0,3 % dans le tampon TNT pendant 10 à 30 minutes. Le temps d'incubation dans la solution de peroxyde d'hydrogène dépend de l'abondance de l'ARNm et doit être testé préalablement à l'expérience D fish.
Ensuite, rincer les sections dans la solution TNT trois fois, pendant 10 minutes à chaque fois. Appliquer 150 microlitres de solution TMB par lame et laisser les lames dans une chambre humide pendant 30 minutes. Éliminer l'excès de solution TMB en inclinant les lames.
Ajouter 150 microlitres de solution TMB contenant un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase, puis conserver les lames dans une chambre humide pendant deux heures. Rincer ensuite les sections trois fois dans du tampon TNT pendant 10 minutes. À chaque fois, appliquer 150 microlitres d'une solution travail d'anticorps acariens conjugués à l’Alexa 488 sur les lames et incuber les sections pendant une heure.
Ensuite, laver les sections dans le tampon TNT trois fois pendant 10 minutes à chaque fois. Maintenant que les deux sondes ribo sont marquées par des anticorps, incuber les sections dans 150 microlitres de solution hôte pendant deux minutes. Puis laver les sections dans le tampon TNT trois fois pendant cinq minutes à chaque fois, ajouter un milieu de montage compatible avec la fluorescence, tel que Vector Shield ou Prolong Antifa, aux sections, couvrir avec une lame à couvrir et observer au microscope à fluorescence.
Ces microphotographies représentatives proviennent d'une expérience sur des poissons D avec des coupes cérébrales de moineau domestique, spécifiquement de la région NCM, l'analogue aviaire du cortex auditif des mammifères. Les coupes cérébrales ont été hybridées avec deux sondes : une sonde ribo marquée à la biotine dirigée contre la parvalbumine, un marqueur d'une sous-population de neurones inhibiteurs, et une sonde ribo marquée au DIG dirigée contre le gène dépendant de l'activité zinc, un marqueur fiable des neurones activés par le chant. Un recouvrement des deux images montre une population cellulaire de neurones inhibiteurs activés par l'expérience auditive.
Les flèches indiquent les cellules marquées exclusivement avec la sonde ribo pour par. Les flèches d'albumine indiquent les cellules marquées exclusivement avec la sonde RIBA pour le zinc ; les neurones représentatifs exprimant les deux transcrits d'intérêt sont marqués d'un astérisque. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de garder votre paillasse propre et d'utiliser des solutions, des plastiques et du matériel en verre exempts de RNase.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de détecter simultanément deux espèces de MA, avec une résolution au niveau de la cellule unique, dans des sections fraîches congelées de cerveau afin d'étudier la co-régulation des gènes dans le cerveau de rat. Merci d'avoir regardé cette vidéo. Bonne chance dans vos expériences.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole repose sur une procédure d'hybridation in situ non radioactive permettant l'identification simultanée de deux espèces de transcrits, avec une résolution au niveau de la cellule unique, dans des coupes minces du cerveau de vertébrés. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions relatives à l'organisation anatomique, fonctionnelle, moléculaire et neurochimique des circuits cérébraux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Analyse de l'expression génique
- Techniques d'hybridation in situ
Contexte
- Cette méthode permet la détection de plusieurs transcrits dans une seule expérience.
- Elle peut être appliquée à divers tissus nerveux, notamment ceux provenant de rongeurs.
- La compréhension de l'expression des gènes dans les neurones est essentielle pour la recherche en neurosciences.
- La technique fournit des informations sur l'organisation moléculaire des circuits cérébraux.
Objectif de l'étude
- Détecter simultanément deux transcrits d'ARNm dans des sections cérébrales.
- Explorer la régulation des gènes dans des populations neuronales spécifiques.
- Approfondir la compréhension de l'organisation fonctionnelle du cerveau.
Méthodes utilisées
- Procédure d'hybridation in situ non radioactive.
- Préparation de coupes cérébrales fraîches congelées.
- Hydrolyse simultanée des transcrits par hybridation.
- Visualisation des transcrits à une résolution unicellulaire.
Résultats principaux
- Identification réussie de deux espèces de transcrits dans des sections cérébrales.
- Démonstration de l'applicabilité de la méthode à divers tissus nerveux.
- Apport de connaissances sur les profils d'expression génique dans les neurones.
- Contribution à la compréhension des bases moléculaires du fonctionnement cérébral.
Conclusions
- Le protocole est efficace pour l'étude de l'expression génique dans le cerveau.
- Il peut être utilisé dans divers contextes de recherche en neurosciences.
- Cette méthode améliore la capacité à étudier les circuits neuronaux complexes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode dFISH permet la détection simultanée de deux transcrits d'ARNm avec une résolution au niveau cellulaire unique sur des coupes cérébrales fraîches congelées, facilitant la détection mécanistique des risques lors de la validation de cibles en révélant les profils de co-régulation génique au sein de populations neuronales définies. L'approche offre une confiance prédictive pour les tests ultérieurs en établissant des relations spatiales et fonctionnelles entre les transcrits dans les circuits sensoriels, orientant ainsi des stratégies de criblage fondées sur des hypothèses. Sa souplesse d'application à diverses espèces de vertébrés et à des tissus non neuronaux renforce la continuité translationnelle et la réutilisation de la plateforme dans les flux de travail de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en visualisant la co-expression de gènes marqueurs (par exemple, la paralbumine et le zinc) dans les neurones inhibiteurs activés par l'expérience sensorielle.
- Valeur opérationnelle : Permet une détection précoque des risques biologiques grâce à l'observation directe des relations spatiales des transcrits dans des tissus frais congelés, réduisant ainsi la dépendance aux inférences indirectes.
- Valeur stratégique : Soutient le tri du portefeuille en fournissant des données à résolution unicellulaire sur l'expression neurochimique et dépendante de l'activité des gènes dans des circuits pertinents pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des procédures ultérieures en confirmant la spécificité de la sonde et l'efficacité d'hybridation sur des sections cérébrales.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité du test grâce à des étapes optimisées de marquage, de purification et d'hybridation des sondes, utilisant des colonnes Sedex G 50 et des conditions tampon contrôlées.
- Valeur stratégique : Met en évidence la préparation au criblage et la réutilisation de la plateforme en démontrant son applicabilité chez la souris, le rat, les oiseaux chanteurs, ainsi que son extension prévue à d'autres espèces de vertébrés et à des tissus non neuronaux.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Aborde la pertinence pour les maladies en explorant l'organisation anatomique et les propriétés neurochimiques des circuits sensoriels centraux, en reliant la co-régulation des gènes aux résultats fonctionnels.
- Valeur opérationnelle : Décrit la valeur ajoutée en termes de continuité, du stade de découverte à la validation préclinique, en permettant une analyse longitudinale de l'impact de l'expérience sensorielle sur l'expression génique dans un même type de tissu.
- Valeur stratégique : Met l'accent sur la valeur prédictive de réduction des risques en fournissant des éclairages mécanistiques sur la manière dont les stimuli sensoriels modifient les programmes transcriptionnels dans des sous-types neuronaux définis.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la phase de découverte précoce jusqu'à l'identification de composés candidats, en soutenant les tests d'hypothèses et la clarification des voies impliquées dans les cibles neurobiologiques avant le criblage de composés.
- Biologie de la découverte : Explique comment la méthode permet de tester des hypothèses en détectant des transcrits co-régulés (par exemple, le zinc dépendant de l'activité et le marqueur des neurones inhibiteurs, la parvalbumine) en réponse à une expérience sensorielle.
- Écrantage : Décrit la préparation du test grâce à des étapes reproductibles de purification des sondes et d'hybridation, produisant des signaux fluorescents quantitatifs avec une résolution au niveau cellulaire unique.
- Analytique : Met en évidence des mesures telles que l'intensité du signal fluorescent et les profils de co-localisation (par exemple, les cellules co-exprimant marquées d'un astérisque), permettant de comparer les conditions entre différents groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Relie la méthode à la continuité préclinique en démontrant son applicabilité sur des sections de cerveau fraîchement congelées provenant de plusieurs espèces, soutenant ainsi une validation interspécifique de l'engagement de la cible.
- Réutilisation en milieu professionnel : Présente la méthode comme une capacité réutilisable plutôt que comme une technique à usage unique, étant donné son adaptabilité à divers tissus neuronaux et non neuronaux ainsi que son protocole standardisé de purification des sondes basé sur des colonnes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans les études de co-régulation génique.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité grâce à la purification des sondes par colonne et à l'utilisation de tampons d'hybridation et de lavage définis.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/ne pas aller, efficacité du capital et réduction des risques biologiques tardifs en confirmant précocement les profils de co-expression des cibles lors de la phase de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, basées sur des données de transcrits résolus spatialement dans des circuits cérébraux pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise scientifique requise en histologie moléculaire, marquage de sondes et microscopie en fluorescence.
- Besoins en instrumentation et infrastructure analytique, notamment un cryostat, une centrifugeuse, un bain d'huile minérale et un microscope à fluorescence équipé de jeux de filtres appropriés.
- Exigences de standardisation entre équipes pour la préparation des sondes, les conditions d'hybridation et les seuils de détection du signal.
- Considérations d'adaptation selon les systèmes modèles, incluant des ajustements de l'épaisseur des tissus, de la perméabilisation et du temps d'hybridation en fonction de l'espèce et de l'abondance de la cible.
- Limites pratiques appuyées par la documentation : le temps d'incubation avec le peroxyde d'hydrogène doit être testé empiriquement avant la réalisation de la DISH, en fonction de l'abondance des ARNm, afin d'éviter une sur- ou sous-détection.
