Name: Le modèle organotypiques dhippocampe Culture Slice dexamen des lésions neuronales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Apprenez à générer des cultures de tranches organotypiques d'hippocampe pour modéliser les lésions neuronales. Cette méthode permet de quantifier la mort cellulaire dans les régions CA1, CA3 et dentée.

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Financé par le NINDS, l&#39;American Heart Association, l&#39;American Federation for Aging Research, Mars of Dimes

1. Préparation Avant de commencer, réunissez les instruments nécessaires chirurgicale, la dissection et les milieux de culture, et 7 jours vieux rat ou de souriceaux. Le protocole est le même pour les souris et les préparations de rat. (I) Les matériaux et équipements <ul><li> Ciseaux d'exploitation (longueur droite 6 ", le chat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Micro dissection ciseaux, (longueur 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Acier au carbone Dumont pince à épiler (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li> Mise à jour de verre "transfert" des pipettes (en bas de pipette Pasteur enlevé et lissée de bord) </li><li> Aclar film plastique coupé à 2 "en x 2" en carrés (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li> Couverture des éponges 4 en de 3 po (Kendall, le chat # 3157, rue Mansfield, MA) </li><li> 30 mm à membrane Millicell inserts (0,4 um; Millipore, Bedford, MA) </li><li> Tissue chopper Mcllwain avec une lame de rasoir à double tranchant (tissue chopper McIlwain, Société Vibratome, St. Louis, MO) </li><li> Microscope inversé avec caméra CCD et un logiciel d'analyse d'image </li></ul> Dissection moyen (ii) (DM; 1 litre à pH 7,3) <table border="0"><tbody><tr><td> Balanced Salt Hank </td><td> 1 flacon (95,2 g/1L) (Sigma: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4,2 mm) </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2,83 g </td></tr><tr><td> Le glucose (33,3 mM) </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine (100x) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> BSA (0,3%) </td><td> 300 mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O </td><td> 1,44 g </td></tr></tbody></table> Le milieu de culture (iii) (400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> MEM (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> *** Sel Bilan de Hank (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Sérum de cheval (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> Tampon HEPES (1 M; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine (100x) </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> *** Ajouter 12,8 g de glucose à Salt Équilibre 500 ml de Hank avant de faire un milieu de culture </td></tr></tbody></table> (Iv) les animaux 7 jours ou de vieux rat souriceaux postnatale, en général une portée par l'expérimentation. 2. Lors de la Journée de la Culture <ol><li> Tous les outils de dissection et le film Aclar doivent être trempées dans EtOH à 70% pendant 30 minutes avant de commencer. La surface de la hotte de dissection, lame, et chopper des tissus doivent être désinfectés avec de l'éthanol. </li><li> Préparez plusieurs (3-4) 6 ainsi plaques de culture tissulaire, ajouter 1 ml milieu de culture par puits, et insérez une membrane Millipore perméable dans chaque puits. Placer des plaques 6 puits dans le 37 ° incubateur jusqu'à prêt à transférer les tranches. </li><li> Préparez plusieurs (4-6) 60 plaques mm avec DM et placer sur la glace. </li><li> Rapidement décapiter avec des ciseaux et les tremper dans EtOH à 70%, et rapidement exposer le cerveau avec une incision sagittale du crâne. Retirer délicatement le cerveau et le place immédiatement dans un froid de DM. Le séparer en deux hémisphères et le lieu de chaque côté médial hémisphère vers le bas sur une éponge couvercle pendant 2-3 secondes. </li><li> Soulevez doucement et le lieu de l'hémisphère sur la place du film Aclar et les placer sur le broyeur de tissu et couper le cerveau coronaire dans 350 sections um. Lorsque vous avez terminé, amenez doucement la place à l'hémisphère Alcar sectionné et plonger dans un froid de DM. </li><li> En utilisant un microscope à dissection, séparer les sections hippocampiques. Pour le rat, il devrait y avoir cinq sections et s'étend à l'hippocampe rostrale caudale, et pour la souris il devrait y avoir des sections 3-4. </li><li> Sortez les assiettes de 6 puits avec des inserts de membrane de la 37 ° de culture de tissu incubateur. Transfert des coupes d'hippocampe individuellement sur les membranes perméables à l'aide de la pipette en verre. Si trop de DM est libéré sur la membrane, enlever l'excès de DM avec une pipette Pasteur. Placez cinq coupes d'hippocampe sur chaque membrane. Attendre au moins 3 puits par condition, ou 15 tranches. </li><li> Incuber les plaques de culture à 37 ° dans un 5% de CO incubateur humidifié pendant 12-14 jours avant le début de l'expérience de toxicité. Le milieu de culture peut être changé deux fois par semaine. </li></ol> 3. Induire et quantification des lésions neuronales hippocampiques en culture Slice <ol><li> Après 12-14 jours de culture, ajouter 5 ug / ml d'iodure de propidium (PI) pour les milieux de culture. Cette étape permettra la visualisation et la quantification de la mort des cellules basales. </li><li> Le jour suivant, quantifier PIfluorescence dans la sous-région CA1 (et / ou CA3 ou denté si désiré) de chaque tranche de l'hippocampe et d'obtenir des mesures de PI signifie la fluorescence représentant la mort de cellules basales (appelé temps = 0 heures, ou T 0). Pour l'acquisition d'image et de quantification, nous utilisons des logiciels OpenLab (Improvisation, UK), mais l'acquisition d'image d'autres logiciels d'analyse et peut être utilisé pour quantifier l'intensité de fluorescence. </li><li> Immédiatement après l'acquisition d'image de T 0 par fluorescence PI, provoquer des lésions neuronales par votre méthode de choix (nous avons utilisé 10 uM NMDA, l'oxygène-glucose privation, ou de LPS pendant une heure pour induire une toxicité neuronale 2,5). Après la relance toxiques, remplacez moyenne avec un milieu frais contenant 5 ug / ml PI et de maintenir les tranches pendant la nuit. </li><li> Au jour 3, de quantifier la fluorescence de PI signifie la condition expérimentale à 24h, ou T 24. </li><li> Après cette acquisition d'image, changer immédiatement moyen et ajouter 10 uM NMDA et 5 pg / mL PI et les tranches incuber pendant la nuit pour atteindre maximale mort neuronale. </li><li> Au jour 4, de quantifier la fluorescence PI dire de la mort neuronale maximale, définie comme T max. Calculer la mort cellulaire pour cent comme suit: (T 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Ligne du temps (A) pour la production expérimentale de blessure de l'hippocampe et ultérieures et d'acquisition d'image. (B) des images représentant des coupes d'hippocampe basale (T 0), les 24 heures suivant une exposition de 1 heure à 10 uM (T 24) NMDA, et après un 24h ou encore 10 uM NMDA pour obtenir maximale lésions neuronales (T max).

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Il ya deux points importants à suivre pour assurer des résultats reproductibles et cohérents lors de la réplication des expériences. Premièrement, il est important de laisser l&#39;âge hippocampique tranches pendant 12-14 jours avant l&#39;expérimentation. Avec l&#39;isolement tranche, il ya une réponse significative microgliales, et les microglies activées restent pendant un certain temps, avec un retour à un état ​​de repos ramifiées survenant au jour 10 in vitro de 3,6. Deuxièmement, dire PI inten...

le modèle organotypiques d&#39;hippocampe culture slice d&#39;examen des lésions neuronales

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypiques la culture tranche de l&#39;hippocampe est une méthode in vitro pour examiner les mécanismes de lésions neuronales dans laquelle l&#39;architecture de base et la composition de l&#39;hippocampe est relativement préservée 1. Le système de culture organotypique permet pour l&#39;examen des effets neuronaux, astrocytaire et microgliale, mais comme une préparation ex vivo, ne tient pas compte des effets de la circulation sanguine, ou le recrutement de cellules inflammatoires périphériques. À cette fin, cette méthode de culture est souvent utilisé pour examiner des blessures hypoxiques excitotoxique et aux neurones pyramidaux de l&#39;hippocampe, mais a également été utilisée pour examiner la réponse inflammatoire. Ici nous décrivons les méthodes pour générer des cultures tranche de l&#39;hippocampe du cerveau de rongeur postnatale, l&#39;administration de stimuli toxiques pour induire des lésions neuronales, et en dosant et en quantifiant la mort neuronale hippocampique.

Le modèle de l&#39;hippocampe organoptypic la culture tranche est une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle utilisé pour examiner les lésions neuronales dans une variété de paradigmes. Dans cet article, nous décrivons les méthodes pour générer des cultures tranche et la quantification des lésions neuronales.

Le modèle organotypiques d&#39;hippocampe Culture Slice d&#39;examen des lésions neuronales

La culture d'organotypes de coupes hippocampiques est une méthode in vitro permettant d'examiner les mécanismes de lésion neuronale, dans laquelle l'architecture et la composition fondamentales de...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cultures organotypiques de tranches hippocampiques pouvant être utilisées pour modéliser les lésions neuronales en réponse à divers stimuli, notamment le NMDA, l'excitotoxicité, la privation d'oxygène et de glucose, ou des stimuli inflammatoires tels que le lipopolysaccharide ou le peptide bêta-amyloïde. Cette approche consiste d'abord à isoler le cerveau postnatal et à découper chaque hémisphère afin d'obtenir des tranches coronales. La deuxième étape de la procédure consiste à isoler les régions hippocampiques et à les cultiver sur des inserts membranaires dans des plaques à six puits. Après culture des sections, celles-ci sont colorées au iodure de propidium et le niveau de mort neuronale spontanée est calculé.Enfin, les tranches sont traitées avec un agent neurotoxique et restainées afin de mesurer la réponse toxique au traitement. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant le pourcentage de mort neuronale dans les régions CA1, CA3 et le gyrus dentelé de l'hippocampe selon différentes conditions expérimentales, grâce à la quantification de la fluorescence de l'iodure de propidium par microscopie d'immunofluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la culture primaire de neurones, est que le mécanisme de lésion neuronale est examiné dans une préparation où l'architecture de base de l'hippocampe est relativement intacte.Et le troisième type comprend l'exercice. Les microglies et ROY sont préservés avant de commencer la dissection. Insérez une membrane perméable Millipore dans chacun.Ajouter un millilitre de milieu de culture dans chaque puits de plusieurs plaques de culture cellulaire à six puits. Incuber les plaques dans une étuve à 37 degrés Celsius.Immergez brièvement la tête d&eacutecapit&eacute;e d'un raton &acirc;g&eacute; de sept jours dans de l'&eacute;thanol &agrave; 70 %. Pour la d&eacute;sinfecter, utilisez des ciseaux de dissection microchirurgicaux afin de r&eacute;aliser une incision sagittale &agrave; travers le cr&acirc;ne et exposer le cerveau. Utilisez une pince pour retirer rapidement le cerveau et transf&eacute;rez-le dans une bo&icirc;te de 60&nbsp;millim&egrave;tres contenant du milieu de dissection plac&eacute;e sur de la glace.Utilisez une pince pour séparer le cerveau en deux hémisphères. Placez chaque hémisphère, côté médial vers le bas, sur une éponge sèche pendant deux à trois secondes afin d'absorber tout excès d'humidité. Transférez le cerveau sur un carré de film transparent et placez-le sur la plateforme d’un coupe-tissu pour réaliser des sections coronales de 350 microns en partant du rostral.Et poursuivre délicatement. Soulever doucement le carré d’A clar et plonger les tranches dans un nouveau récipient contenant du milieu de dissection glacé. Sous un microscope stéréoscopique, identifier l’hippocampe, une structure en forme de C située sous le cortex cérébral et accolée au striatum.Utilisez une pince pour séparer l'hippocampe de chaque section coronale. Utilisez une pipette de Pasteur modifiée comme décrit dans le texte pour transférer cinq tranches d'hippocampe sur chaque membrane. Insérez-les dans les plaques à six puits préparées et réchauffées.Éliminer tout excès de milieu à la surface de la membrane. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 12 à 14 jours. Après 12 à 14 jours de culture, changer le milieu comme décrit dans le texte accompagnant, puis renouveler le milieu et ajouter cinq microgrammes par millilitre par pum d’iodure, abrégé en pi, afin de permettre la visualisation et la quantification de la mort cellulaire basale.Incuber les tranches toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone sous un microscope à fluorescence inversé relié à une caméra CCD. Capturer des images de la tranche à un grossissement de 40 x à ce moment-là. Enregistrer la fluorescence du iodure de propidium (PI) correspondant aux niveaux basaux de mort cellulaire au temps égal à zéro heure, ou T zéro, immédiatement après l'acquisition d'images. Induire une lésion neuronale sur les tranches selon la méthode privilégiée pour l'expérience en cours.Ici, les tranches sont incubées avec un milieu frais contenant 10 micromolaire de NMDA pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après le traitement neurotoxique, remplacer le milieu par un milieu de culture frais contenant cinq microgrammes par millilitre de pi.Incuber les tranches toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone image de la fluorescence de l'iodure de propidium après un traitement neurotoxique. Les mesures moyennes de fluorescence pour ce point temporel représentent les niveaux de mort cellulaire. Après 24 heures de lésion expérimentale, ou T 24 heures, remplacer immédiatement le milieu par un milieu de culture frais contenant 10 micromolaire de NMDA et cinq microgrammes par millilitre.Incuber les tranches avec du PI toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin d'obtenir une mort neuronale maximale. Acquérir le jeu final d'images de la fluorescence du PI, ainsi que les mesures de fluorescence moyenne pour ce point temporel. Représenter les niveaux maximaux de mort cellulaire, ou Tmax.Quantifiez la fluorescence du PI dans la région d'intérêt à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image, comme décrit dans le texte accompagnant. Il s'agit d'une image représentative de la coloration par le PI de la mort neuronale basale dans la région CA1 de l'hippocampe. Voici une image représentative de la mort neuronale colorée au PI.24 heures après un traitement d'une heure avec du NMDA à 10 micromolaire, observez une coloration plus intense indiquant un degré accru de mort cellulaire. Cette image montre une coloration maximale au PI après une incubation nocturne avec du NMDA à 10 micromolaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des tranches organotypiques d'hippocampe et mesurer le niveau de lésion neuronale.

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Nous décrivons une méthode pour préparer organotypiques coupes d'hippocampe qui peut être facilement adaptée à d'autres régions cérébrales. Tranches de cerveau sont fixées sur les membranes poreuses et milieux de culture est autorisée à former une interface. Cette méthode préserve l'architecture brute de l'hippocampe pour 2 semaines de culture.

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

Cette vidéo montre une méthode de préparation de cultures de tranches d’hippocampe organotypiques à partir du cerveau d’un ratillon. Il décrit les étapes impliquées dans la dissection de l’hippocampe, le tranchage et les conditions de culture nécessaires pour favoriser la viabilité cellulaire et la croissance dans les tranches de l’hippocampe, générant finalement des cultures de tranches organotypiques.

Préparation de cultures de tranches organotypiques à partir de l'hippocampe d'un petit rat

La co-culture organotypique de tranche de cerveau avec des cellules de carcinome permet la visualisation des changements morphologiques par fluorescence, ainsi que champ lumineux (vidéo) microscopie pendant le processus d'invasion cellulaire de carcinome du tissu cérébral. Ce système permet également de modèle pour change de cellule et de réapprovisionnement des approches et offre une grande variété de manipulations et analyses.

Système de co-culture avec un cerveau organotypique et 3D sphéroïde de cellules de carcinome

Nous avons développé un modèle de tranche de cerveau qui peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée. Cette technique génère tissu cerveau mature viable et réduit le nombre d'animaux nécessaires à l'expérimentation, tout en gardant la circuiterie neuronale, interactions cellulaires, et des compartiments post-synaptiques en partie intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Une technique d’étude des cellules NG2 et des oligodendrocytes à l’aide d’un système de culture en tranches du cerveau antérieur et du cervelet est décrite.  Cette méthode permet d’examiner la dynamique de prolifération et de différenciation des cellules au sein de la lignée des oligodendrocytes où l’environnement extracellulaire peut être facilement manipulé tout en maintenant la cytoarchitecture tissulaire.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure.

L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Nous décrivons ici une technique pour étudier la neurogenèse postnatale hippocampe en utilisant la technique de culture organotypique. Cette méthode permet la manipulation in vitro de la neurogenèse adulte et permet l'application directe d'agents pharmacologiques à l'hippocampe en culture.

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Ici, nous décrivons la préparation des tranches organotypiques rhinal de cortex-hippocampe. Sous une privation progressive et commandée de sérum, ces tranches dépeignent l’évolution épileptique-comme des événements et peuvent être considérées un modèle ex vivo d’épileptogenèse. Ce système représente un excellent outil pour surveiller la dynamique de l’activité spontanée, ainsi que pour évaluer la progression des caractéristiques neuro-inflammatoires tout au long de l’épileptogenèse.

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