La fabrication des matériaux injectables d'origine biologique pour l'ingénierie tissulaire du myocarde

Les gels matriciels produits à partir de tissus décellularisés, péricardiques et myocardiques, conservent les composants natifs de la matrice extracellulaire, notamment diverses protéines, peptides et glycosaminoglycanes. Ces matrices tissulaires peuvent être utilisées en ingénierie tissulaire. Dans cette vidéo, des gels matriciels sont fabriqués par décellularisation de tissu péricardique afin d'obtenir une matrice extracellulaire acellulaire.

La matrice extracellulaire est ensuite traitée pour produire une version liquide solubilisée. Ensuite, la matrice solubilisée est testée sur un petit modèle animal afin d'évaluer sa faisabilité en tant que support injectable. Des analyses histologiques et immunohistochimiques montrent qu'in vivo, le matériau injecté forme un support fibreux poreux permettant l'infiltration de cellules vasculaires.

Bonjour, je m'appelle Sonia Zeki. Je suis étudiante diplômante dans le laboratoire de la Dre Karen Chrisman à l'Université de Californie à San Diego. Aujourd'hui, nous allons fabriquer une MEC solubilisée à partir de tissu décellularisé et démontrer les tests in vivo pour des applications en ingénierie tissulaire cardiaque.

Ces techniques sont importantes pour le développement d'une thérapie à base de biomatériaux injectables pour le traitement de l'insuffisance cardiaque. Post-infarctus du myocarde illustrant la procédure chirurgicale par Pam, réalisation de McGuffin, neurochirurgien vétérinaire dans notre laboratoire. Commençons donc.

Commencez ce protocole par la décellularisation du tissu afin de ne conserver que la matrice extracellulaire ou MEC : placez d'abord le péricarde porcin dans un bécher d'eau déionisée et lavez-le en agitant pendant 30 minutes à température ambiante. Après le lavage, placez le tissu dans du PBS 1× contenant 1 % de SDS et 1 % de pénicilline-streptomycine, puis agitez en continu pendant 24 heures à température ambiante. Le jour suivant, remettez le tissu dans de l'eau déionisée et agitez en continu pendant cinq heures, en secouant dans un tube de 50 millilitres jusqu'à disparition complète des bulles.

La coloration par l'hématoxyline et l'éosine devrait révéler l'absence de noyaux dans le tissu décellularisé. Placer le reste du tissu décellularisé dans un tube conique de 15 à 50 millilitres. Ensuite, placer le tissu dans l'enceinte congélateur à moins 80 degrés Celsius.

LyoPhylisez les échantillons congelés par séchage à congélation sous pression très faible et à température très basse jusqu'à complète dessiccation. Selon le système utilisé et la teneur en eau des échantillons, cette étape peut durer entre 12 et 72 heures. Une fois que le tissu décellularisé est complètement sec, transférez-le dans un broyeur Wiley Minim.

À l'aide d'un tamis de maille 40, broyer le tissu en une poudre fine. Une fois que la majeure partie de l'échantillon est passée à travers le filtre, retirer le récipient de collecte. Cet échantillon est désormais appelé poudre de matrice extracellulaire ou poudre de MEC.

Une deuxième étape de lyophilisation peut être effectuée à ce moment, si l'on ne passe pas immédiatement à l'étape suivante. Cela garantit la précision du poids enregistré pour solubiliser la MEC. Peser la quantité souhaitée de poudre de MEC dans un flacon stérile.

Ajouter une solution stérile filtrée d'acide chlorhydrique contenant un milligramme par millilitre. Pepcid dans le flacon de scintillation contenant la poudre d'ECM afin que l'ECM atteigne une concentration de 10 milligrammes par millilitre. Ajouter une barre d'agitation et placer le flacon sur la plaque d'agitation.

Agiter en continu pendant 48 à 60 heures, en raclant périodiquement les parois du flacon à l’aide d’une cuillère ou d’une spatule stérile WHE, afin de garantir la digestion complète de la poudre de MEC. Au fur et à mesure que le MEC est digéré, il passe en solution.

Une fois la MEC solubilisée, placez l'échantillon sur de la glace et ajustez le pH à 7,4 à l'aide d'hydroxyde de sodium et d'acide chlorhydrique. Une fois le pH ajusté, ajoutez du PBS 10 fois concentré de manière à obtenir une concentration finale en PBS 1 fois. Par exemple, si vous avez 900 microlitres de solution de MEC, après l'ajustement du pH, ajoutez 100 microlitres de PBS 10 fois concentré.

Déterminez la concentration de la solution d'ECM solubilisée en additionnant les volumes ajoutés pour la neutralisation et les volumes prélevés pour tester le pH. Ajoutez ensuite du PBS à une concentration égale pour atteindre la concentration finale souhaitée ici. Six milligrammes par millilitre.

Le jour de l'intervention chirurgicale, préparez une injection de 75 microlitres de MEC solubilisée dans une seringue de 0,1 millilitre munie d'une aiguille de calibre 30. Maintenez l'anesthésie d'un rat femelle Harlan dolly intubé avec 2,5 % de fluorure. Appliquez des collyres, puis vérifiez l'anesthésie en effectuant une pression sur l'orteil.

Administrer trois millilitres de solution de Ringer lactatée par injection sous-cutanée dans l'abdomen inférieur pour assurer l'hydratation. Ensuite, placer l'animal en position supine sur la table chirurgicale et fixer doucement les membres avec du ruban adhésif. Utiliser un tondeur pour raser les poils de l'abdomen et aspirer les poils libres.

Effectuez une série d'injections de 50 microlitres de lidocaïne à 2 % selon une diagonale allant du processus xiphoïde jusqu'au côté inférieur droit de l'abdomen. Ensuite, effectuez trois frictions avec du Bétadine en partant du centre et en allant vers l'extérieur. Répétez le frottis avec de l'alcool isopropylique.

Ensuite, recouvrir l'animal avec un champ opératoire comportant une fenêtre circulaire préformée. Fixer à l'aide d'un champ opératoire. Utiliser un scalpel n° 10.

Réalisez une incision de trois à quatre centimètres partant du processus xiphoïde jusqu’au côté inférieur droit de l’abdomen. Localisez le processus xiphoïde et disséquez verticalement vers le bas à travers le muscle vers la droite, en prenant soin d’éviter le gros vaisseau situé à droite. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper latéralement à travers le muscle afin d’exposer le diaphragme.

Veillez à éviter le foie en utilisant un fil de suture Vicryl 3-0 d'une longueur de 36 pouces et une paire de pinces hémostatiques. Passez une aiguille à travers le processus xiphoïde et tirez le fil à moitié à travers. Fixez ensemble les extrémités du fil à l’aide d’un ruban adhésif et attachez-les à un point situé au-dessus et en arrière de l’animal, soulevez le xiphoïde vers le haut et exposez le diaphragme à l’aide d’un autre fil de suture Vicryl 3-0 d'une longueur de 36 pouces.

Introduisez une aiguille à travers le muscle le plus proche du processus xiphoïde, puis tirez et fixez l'extrémité à un autre point situé à droite de la table chirurgicale, exposant ainsi complètement la cavité chirurgicale. Ensuite, à l’aide d’une petite pince micro-dissectrice à dents de rat, saisissez le centre du diaphragme, tirez-le vers l’extérieur et pratiquez une très petite incision avec des ciseaux contondants. Une fois cette ouverture réalisée, les poumons se rétractent.

Réalisez une incision verticale de deux à trois centimètres à travers le diaphragme afin de visualiser le cœur. Insérez ensuite un coton-tige de trois pouces à gauche de la cavité et déplacez les poumons sur le côté. Fixez le coton-tige en place à l’aide d’une pince hémostatique.

À l’aide d’un autre écouvillon, déplacez le poumon droit afin de localiser la gaine péricardique. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces microfines et d’une paire de pinces larges cannelées, percez la gaine péricardique pour exposer l’apex du cœur. Saisissez l’apex du cœur avec les pinces microfines à dents à droite et insérez l’aiguille pour injecter la matrice solubilisée, le bord biseauté orienté vers la gauche.

Un tiers du chemin à partir de l'apex, parallèlement à la surface épicardique. Veillez à éviter la grande veine cardiaque. Injectez le gel matriciel solubilisé et attendez quelques secondes avant de retirer l'aiguille.

Le tissu doit blanchir au site d'injection ; essuyez le sang dans la cavité, puis retirez la pince hémostatique et le coton-tige maintenant le poumon droit à l'aide de pinces hémostatiques micro-courbes, et faites un nœud initial avec un morceau de suture en proline 5-0 d'une longueur de 30 pouces. Ensuite, utilisez des pinces micro-fines à dents de rat pour fermer le diaphragme par une suture continue et une aiguille effilée avant de refermer complètement. Insérez un tube d'aspiration PE 160 et effectuez une fermeture en utilisant une seringue de 10 millilitres pour évacuer la cavité thoracique.

Lorsque le point de suture est serré, le diaphragme doit être concave. Réduisez la concentration d'oxyde de fluor à 1 %. Retirez les deux sutures en Vicryl 3-0 qui maintiennent la cavité ouverte. Hydratez le muscle en essuyant l'excès avec un coton-tige ou une gaze stérile.

Utilisez une nouvelle longueur de suture 3-0 pour fermer la couche musculaire par des points séparés. Ensuite, éteignez l'isoflurane. Nettoyez la zone et utilisez des agrafes pour fermer la peau.

Appliquez ensuite une pommade antibiotique triple sur le site de l'incision. Laissez le rat se rétablir sous 100 % d'oxygène. Lorsque l'animal commence à respirer par lui-même, retirez le tube trachéal.

Une fois que l'animal est de retour sur ses pattes, administrer une injection sous-cutanée de 0,05 milligramme par kilogramme d'analgésique chlorhydrate de buprénorphine, puis le ramener à sa cage d'origine sur une serviette stérile. Des échantillons de tissu cardiaque provenant de rats injectés avec des gels matriciels solubles ont été découpés en tranches et colorés à l'hémat, à la toïne et à l'éosine pour une analyse macroscopique du tissu à différents moments. Après la chirurgie, à des moments précoces, la région injectée apparaît comme un réseau fibreux rose qui s'est étendu de manière interstitielle à des moments ultérieurs.

L'afflux cellulaire est observé après deux semaines. La dégradation de la matrice injectée est visible. Si la MEC a été marquée par de la biotine avant l'injection, elle peut être visualisée de manière plus directe en colorant la biotine à l'aide de streptavidine conjuguée à la peroxydase pour mettre en évidence la pénétration et la formation de vaisseaux dans la région d'injection de la matrice.

Les lames ici ont été doublement colorées avec un conjugué de fitzy. La sélectine, conjuguée et liée aux cellules endothéliales, est montrée en vert, et un anticorps anti-actine des cellules musculaires lisses est montré en rouge. Les cellules souches peuvent également être identifiées près de la région d'injection.

Ici, ils ont été visualisés à l'aide d'une coloration d'immunohistochimie dirigée contre le c-kit. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer une MEC solubilisée à partir de tissu décellularisé et la tester in vivo pour des applications en ingénierie tissulaire cardiaque. N'oubliez pas que, bien que nous utilisions du tissu péricardique, cette procédure générale peut être modifiée pour être utilisée avec toute source de tissu.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.