Name: Étudier linfluence gliales hétérogénéité cellulaire sur la croissance axonale aide dune méthode coculture Nouveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Découvrez une méthode de coculture pour étudier l'influence de l'hétérogénéité des cellules gliales sur la croissance axonale des neurones DRG de rat. Ce protocole permet d'analyser les interactions glio-neuronales in vitro.

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Cette étude a été soutenue par FMMU nouvelle fondation et trouver le financement partiel du NIH.

1. Culture cellulaire Glia Les cellules gliales peuvent être cultivées à partir de différentes régions du système nerveux central. L'ensemble du processus est montré dans la figure processus. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="Processus 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Processus 1"> Jour 1 plaque de culture de revêtement et des lamelles <ol><li> Dry rondes stérilisés lamelles de microscope en verre dans un autoclave. </li><li> Plaque les lamelles stérilisés dans la plaque de culture stérilisé de 24 puits. </li><li> Enduire les lamelles avec de la poly-lysine et incuber pendant 2 heures sous une température racine. </li><li> Manteau plaques de culture de 6 puits de la même manière qu'à l'étape 3. </li><li> Lavez les lamelles et la plaque de culture de 6 puits à deux reprises avec de l'eau distillée et sécher à l'air dans le capot de la culture. </li><li> Ajouter 200 pl de milieu DMEM (10% de FBS) dans chaque puits de la plaque de 24 puits et 2 ml dans chaque puits de la plaque à 6 puits et les mettre en étuve à 37 degrés avec 5% de CO 2 </li></ol> Jour 2 du cortex isolation et de culture de cellules gliales <ol><li> Stériliser la hotte à flux positifs de dissection. </li><li> Allumez la lumière UV pendant 20 min. </li><li> Pulvériser sur toutes les surfaces avec de l'éthanol 70% et attendre 15 minutes avant utilisation. </li><li> changement de tension: les ratons Anesthetize (P2-P6) par l'hypothermie, et décapiter à la base du magnum framen l'aide de ciseaux d'exploitation. </li><li> Ouvrez la boîte crânienne le long de la suture sagittale en utilisant un ciseau d'iris et de décoller le crâne. </li><li> Enlever le cerveau et les mettre en réfrigérée milieu L15, sous stéréomicroscope, nettoyer soigneusement la membrane-mère et pie avec des vaisseaux sanguins, d'isoler le cortex et laver plusieurs fois avec du milieu L15. </li><li> Couper le cortex en petits morceaux avec des ciseaux de microchirurgie. </li><li> Ajouter 0,125% de trypsine-EDTA préparé avec du milieu L15 en morceaux le cortex et incuber à 37 degrés pendant 15 min. </li><li> Transfert des blocs de tissus dans un milieu DMEM 20mL avec du FBS 20% en tube 50ml, ajouter à la solution mère de DNase 10ug/mL concentration finale, aspirer la solution des tissus haut et en bas pendant 20 heures avec le feu en verre poli Pasteure pipette, de recueillir la suspension seule cellule. </li><li> Laver les cellules en suspension une fois avec du milieu DMEM, rétablir la suspension des cellules dans du DMEM avec 10% de FBS, compter les cellules sous le microscope des cellules hémocytomètre une graine, à 5000-10000/cm 2. Maintenir les cellules dans un 37 degrés incubateur à 5%, le changement de la moitié des 2 moyennes fois par semaine. </li></ol> 2. Ganglions de la racine dorsale Neurones isolement, de la Culture et de purification Jour 1 Préparer le matériel de la culture <ol><li> Enduire les lamelles stérilisés à la poly-lysine lamelles de lavage, deux fois avec distiller l'eau et l'air sec, les mettre dans des plaques 24 puits. </li><li> Ajouter 100 ul milieu Neurobasal avec 2% B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml), mettre la plaque en 37 CO degré 5% 2. </li></ol> Jour 2 Isoler les GHM à partir d'embryons <ol><li> Stérilisé la hotte à flux de la même manière que la culture de cellules gliales. </li><li> Euthanasier un rat enceintes (E15) par overdose avec du CO 2, de l'abdomen stérilisés par 70% d'éthanol, les embryons ont été isolées de l'utérus et de mettre en réfrigérée milieu L15. </li><li> Isoler avec des moelles épinières ganglions de la racine dorsale connecté sous stéréomicroscope et transfert à 35mm avec des plats refroidis milieu L15. </li><li> Recueillir suspension cellulaire unique et se laver une fois avec la FBN (milieu Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml)). </li></ol> Jour 3 Purifier neurones DRG <ol><li> 18h-24h après le semis neurone, ajouter une solution concentrée à 1 mM de stock FUDR à la culture de neurones à une concentration finale de 20 pM et un volume final de 200 pl. </li><li> 72h plus tard, de remplacer la moitié de la moyenne avec milieu Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50ng/mL) sans FUDR. Après cela, changer le milieu tous les autres jours. </li></ol> 3. Coculture avec des neurones DRG cellules gliales <ol><li> Lorsque la culture de cellules gliales atteint la confluence (environ 20 jours après le semis), ils étaient prêts à co-culture avec les neurones. </li><li> 24 heures avant d'ajouter les neurones purifiés, gliales cellules moyennes ont été changées à moyen Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml). </li><li> Neurones purifiés ont été recueillies à partir des puits de culture, seule la suspension des cellules ont été obtenues par le passage mécanique grâce à la pipette Pasteure polies au feu. </li><li> Après avoir compté le nombre, les neurones ont été ensemencées à confluence 500/cm 2 sur les cellules gliales dans le milieu de Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50ng/mL). </li><li> L'adhérence et la croissance neuritique des neurones sur les cellules gliales pourraient être enregistrées et analysées à différents moments par des logiciels d'analyse d'image et l'immunocytochimie utilisant des anticorps de type cellulaire spécifique. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <ol><li> Culture de cellules gliales: Après l'ensemencement, les cellules gliales deviennent confluentes environ 20 jours. Sous microsc contraste de phaseOPE, il a été facilement identifiés que les différentes sous-populations de cellules gliales morphologiques différentes sous-structures formées modèle de croissance et les astrocytes GFAP positives représentaient plus de 90% comme indiqué par la technique immuocytochemisty (Figure 1, Figure 2). </li><li> DRG neurones de la culture: Dans notre méthode, après 72 heures de traitement FUDR, la pureté des neurones DRG atteindra aussi élevé que 99% dans les 6 jours, les neurones DRG ont montré leurs morphologies et unique avec une croissance de densité des neurites élevé (figure 3, figure 4). </li><li> Gliales et neurones coculture de cellules: les neurones et l'adhérence DRG neurites survenue facilement sur ​​les cellules gliales dans les 4 heures après l'ensemencement, l'observation minutieuse a montré que l'adhésion des neurones et la croissance des neurites ont été influencés par les sous-populations de cellules gliales qui forment spéciale soubassements modèle de croissance, ce qui pourrait être facilement identifiés sous le microscope à contraste de phase et par immunocytochimie (Figure 5, Figure 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Morphologie des cellules gliales confluentes. Corticales cellules gliales ont été plaqués sur la lamelle revêtement polylysine et cultivées pendant 20 jours, notez le modèle de croissance différents de cellules gliales, les cellules sur le côté gauche disposés de manière rayonnée. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Confluent cellules gliales étiquetés par la protéine fibrillaire gliale acide (GFAP) anticorps. Notez la disposition rayonnée de la GFAP (en rouge) des cellules positives sur le côté droit. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Dorsale neurones ganglions de la racine a grandi in vitro, sans traitement FUDR. Les cellules contaminantes formé DRG fond neurones ». <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Dorsale neurones ganglions de la racine a progressé après un traitement in vitro de FUDR. Les cellules de fond contaminant avait été complètement éliminé. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Dorsale neurones ganglions de la racine cultivée sur cellules gliales. Adhérence neurones et la croissance des neurites étaient inhibés sur les cellules rayonnée arrangé et limitée sur les cellules gliales côté droit. <img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Dorsale neurones ganglions de la racine de croissance sur les cellules gliales étiqueté par l'anticorps neurofilaments. Les neurites (vert) ont été inhibés sur le rayonnée disposées les cellules gliales côté gauche et limité sur le côté droit, toutes les cellules gliales ont été marqués par des anticorps GFAP (en rouge).

<ol><li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+time+to+move%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: time to move?</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li>
<li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li>
<li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Culturing+nerve+cells%22%5BJournal%5D)">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li>
</ol>

Ce protocole expérimental a été conçu pour atteindre deux objectifs d&#39;étudier les cellules gliales, l&#39;influence en particulier l&#39;hétérogénéité des astrocytes sur l&#39;adhésion des neurones et la croissance des neurites. Le premier objectif était de maintenir l&#39;hétérogénéité des astrocytes autant que possible, dans cette expérience, la confluence des cellules gliales de la culture des astrocytes a été mélangé enrichi la culture primaire sans aucun traitement chimique et de la propagation de digestion, ce...

<table><tbody><tr><td>DMEM (haute concentration de glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Milieu L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415-114</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Poly-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>qualité culture</td></tr><tr><td>NGF (2,5S)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25 %</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-neurofilaments</td><td>Abcam</td><td>ab24575</td><td></td></tr></tbody></table>

Étudier l&#39;influence gliales hétérogénéité cellulaire sur la croissance axonale aide d&#39;une méthode coculture nouveau

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

Dans le système nerveux central de tous les mammifères, les axones sectionnés après une blessure sont incapables de se régénérer à leurs objectifs initiaux et la récupération fonctionnelle est très pauvre 1. L&#39;échec de la régénération des axones est le résultat combiné de plusieurs facteurs, notamment l&#39;environnement des cellules gliales hostile, inhibition des molécules liées et une diminution de la myéline des neurones intrinsèques de régénération capacité 2. Les astrocytes sont les cellules les plus prédominantes gliales dans le système nerveux central et de jouer un rôle important dans les fonctions axone sous la physiologie et la pathologie des conditions 3. Contraste pour les oligodendrocytes homologues, les astrocytes sont une population cellulaire hétérogène composé par différentes sous-populations d&#39;astrocytes avec des morphologies différentes et 4 l&#39;expression des gènes. La signification fonctionnelle de cette hétérogénéité, comme leurs influences sur la croissance des axones, est largement inconnue. Pour étudier les cellules gliales, en particulier la fonction de l&#39;hétérogénéité des astrocytes dans le comportement des neurones, nous avons établi une nouvelle méthode de co-culture de haute purifiée dorsale neurones ganglions de la racine avec des cellules gliales obtenu à partir du cortex de rat. Par cette technique, nous avons pu comparer directement l&#39;adhérence et la croissance des axones des neurones sur les sous-populations différentes astrocytes dans les mêmes conditions. Dans ce rapport, nous donnons le protocole détaillé de cette méthode pour l&#39;isolement et la culture des astrocytes, neurones ganglions de la racine dorsale isolement et de purification, et la co-culture de neurones avec GHM astrocytes. Cette méthode pourrait également être étendu aux autres régions du cerveau à l&#39;étude cellulaire ou régionales interaction spécifique entre neurones et cellules gliales.

Dans ce protocole, nous avons décrit une nouvelle méthode pour étudier l&#39;influence de l&#39;hétérogénéité des cellules gliales sur la croissance des axones avec un<em&gt; In vitro</em&gt; Système de co-culture. Corticaux de rat les cellules gliales ont été cultivées jusqu&#39;à confluence et co-cultivées avec hautement purifiées du rat dorsale neurones ganglions de la racine. Différents une influence sur l&#39;adhérence des cellules gliales et neurones croissance axonale a été comparé directement à la même culture. Cette méthode offre une nouvelle façon d&#39;étudier directement l&#39;influence des cellules gliales hétérogénéité sur l&#39;adhérence et la croissance des neurones axone.

Étudier l&#39;influence gliales hétérogénéité cellulaire sur la croissance axonale aide d&#39;une méthode coculture Nouveau

Dans le système nerveux central de tous les mammifères, les axones sectionnés après une lésion sont incapables de se régénérer vers leurs cibles d'origine et la récupération fonctionnelle est ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'influence de l'hétérogénéité gliale sur la croissance des axones des ganglions de la racine dorsale et la déionisation cellulaire. Cela est réalisé en premier lieu en transformant les cellules gliales issues du cortex de rat nouveau-né. La deuxième étape de la procédure consiste à cultiver et à purifier les neurones des ganglions de la racine dorsale provenant d'embryons de rat.La troisième étape de la procédure consiste à ajouter les neurones du ganglion rachidien purifiés sur les cellules gliales. La dernière étape de la procédure est d'observer la croissance des exons dans l'axone cellulaire et de réaliser une coloration cellulaire ainsi qu'une analyse de quantification. En fin de compte, les résultats peuvent être obtenus.Ce travail montre que la croissance des neurones des ganglions de la racine dorsale est influencée par des cellules gliales hétérogènes, grâce à l'enregistrement en microscopie à intervalles et à la microscopie d'immunofluorescence. Bonjour, je travaille au laboratoire d'imagerie neuronale du Département de neurologie de l'UCRA. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'étudier l'in

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Nous avons développé une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture in vitro du système nerveux central de recherche interactions axone-glie. La plateforme est capable de conduire jusqu'à six expériences indépendantes en parallèle et a été fabriqué en utilisant un tout nouveau micro / macro méthode de fabrication hybride.

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Une technique de co-culture indirecte neurone-astrocyte pour étudier les interactions neurones-glie

Cette vidéo montre le modèle de coculture d’un explant ganglionnaire de la racine dorsale et de cellules de Schwann. Dans des conditions de coculture, l’acide ascorbique favorise la différenciation des cellules de Schwann en formes myélinisantes. Les cellules de Schwann myélinisantes enveloppent les axones plusieurs fois pour créer une gaine de myéline, essentielle à la fonction nerveuse.

Co-culture d’un explant de ganglion de la racine dorsale avec des cellules de Schwann pour la myélinisation des neurones

Ganglions de la racine dorsale (DRG) sont des structures contenant les neurones sensoriels du système nerveux périphérique. Lorsqu'ils sont dissociés, ils peuvent être co-cultivées avec des cellules souches du tissu adipeux SC-like (ASC), fournissant un modèle précieux pour étudier in vitro la régénération nerveuse et la myélinisation, imitant l'environnement in vivo au site de la lésion.

Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

Ce protocole décrit la coculture neurone-astrocyte indirect pour l'analyse compartimentée des interactions neurone-glie.

Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Mise en place pour l&#39;investigation détaillée des interactions Neuron-glie

Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

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Surveillance en temps réel de la migration cellulaire des gliomes humains sur les co-cultures d'Axon-Oligodendrocyte de Ganglion de racine dorsal

Ici, nous présentons une approche simple utilisant des milieux de culture spécifiques qui permettent l’établissement de cultures enrichies de neurones et d’astrocytes, ou de cultures neuron-glia du cortex embryonnaire, avec un rendement élevé et une reproductibilité.

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Coculture de neurones rétiniens axotomisés de ganglion de rat avec glia ensheathing olfactif, comme modèle in vitro de régénération axonale adulte

Ici, nous présentons un test de co-culture facile à utiliser pour analyser la migration du glioblastome (GBM) sur des neurones à motifs. Nous avons développé une macro dans le logiciel FiJi pour une quantification facile de la migration des cellules GBM sur les neurones, et avons observé que les neurones modifient la capacité invasive des cellules GBM.

Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Découvrez une méthode de coculture pour étudier l'influence de l'hétérogénéité des cellules gliales sur la croissance axonale des neurones DRG de rat. Ce protocole permet d'analyser les interactions glio-neuronales in vitro.

Étudier l'influence gliales hétérogénéité cellulaire sur la croissance axonale aide d'une méthode coculture Nouveau

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