Étudier l'influence gliales hétérogénéité cellulaire sur la croissance axonale aide d'une méthode coculture Nouveau

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'influence de l'hétérogénéité gliale sur la croissance des axones des ganglions de la racine dorsale et la déionisation cellulaire. Cela est réalisé en premier lieu en transformant les cellules gliales issues du cortex de rat nouveau-né. La deuxième étape de la procédure consiste à cultiver et à purifier les neurones des ganglions de la racine dorsale provenant d'embryons de rat.

La troisième étape de la procédure consiste à ajouter les neurones du ganglion rachidien purifiés sur les cellules gliales. La dernière étape de la procédure est d'observer la croissance des exons dans l'axone cellulaire et de réaliser une coloration cellulaire ainsi qu'une analyse de quantification. En fin de compte, les résultats peuvent être obtenus.

Ce travail montre que la croissance des neurones des ganglions de la racine dorsale est influencée par des cellules gliales hétérogènes, grâce à l'enregistrement en microscopie à intervalles et à la microscopie d'immunofluorescence. Bonjour, je travaille au laboratoire d'imagerie neuronale du Département de neurologie de l'UCRA. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'étudier l'influence hétérogène des cellules gliales sur la croissance, au moyen d'une nouvelle méthode de culture de neurones.

Dans notre laboratoire, nous utilisons cette nouvelle méthode pour étudier l'interaction entre les neurones et les cellules gliales. Testons donc l'étude. Afin d'établir une co-culture de cellules gliales et de neurones du ganglion spinal ou DRGs, nous commencerons par cultiver les cellules gliales sous une hotte de culture tissulaire. Tapisser le fond de plaques de culture pré-stérilisées de 24 puits avec des lamelles circulaires en verre stérilisées, recouvrir les lamelles dans les puits d'une plaque de culture de 6 puits avec de la polylysine et incuber pendant deux heures à température ambiante.

Lavez les lamelles et les plaques de culture deux fois avec de l'eau distillée et laissez sécher à l'air. Ensuite, ajoutez 200 microlitres ou deux millilitres de milieu d'Earle modifié dcos ou DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal ou FBS dans chaque plaque de 24 puits ou de 6 puits, respectivement. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone le jour suivant.

Stérilisez la hotte de dissection à flux positif. Allumez la lumière UV pendant 20 minutes, puis vaporisez toutes les surfaces situées sous la hotte avec de l’éthanol à 70 % et attendez 15 minutes avant utilisation. Commencez avec les têtes de deux ratons âgés de P2 à P6 qui ont été anesthésiés par hypothermie.

Ensuite, décapiter à la base du foramen magnum à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Ouvrir le crâne le long de la suture sagittale à l’aide de ciseaux à iridectomie et retirer le crâne. Enlever le prosencéphale et le placer dans du L-15 de Leibovitz refroidi, puis répéter l’opération avec la deuxième tête.

Ensuite, travailler sous un microscope stéréo. Retirer soigneusement la dure-mère ainsi que les membranes et vaisseaux sanguins recouvrant le cerveau. Isoler le cortex et le laver plusieurs fois avec du milieu L 15.

Utilisez des ciseaux de microchirurgie pour découper le cortex en petits morceaux. Incubez ensuite dans un milieu L 15 contenant 0,125 % de trips en EDTA à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, transférez les fragments de tissu dans un tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de DMEM avec 20 % de FBS.

Ajouter le DS à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Ensuite, utiliser une pipette à pâte polie à la flamme pour agiter la solution tissulaire environ 20 fois afin de séparer les cellules. Enfin, laver les cellules une fois avec du DMEM contenant 10 % de FBS et déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, ensemencer les cellules à raison de 5 000 à 10 000 cellules par centimètre carré et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Changer le milieu deux fois par semaine afin d'isoler, purifier et cultiver les ganglions racinaires dorsaux. Préparer tout d'abord des plaques de 24 puits avec des lamelles en verre revêtues de polylysine, comme indiqué précédemment.

Ajoutez 100 microlitres de milieu NVF sur chaque lamelle et incubez les plaques à 37 degrés Celsius le jour suivant. Stérilisez la hotte à flux laminaire comme précédemment. Ensuite, commencez avec des embryons de rat de E12 à E15 qui ont été isolés de l’utérus d’un rat gravide euthanasié au dioxyde de carbone sous microscope stéréo.

Isolez les moelles épinières avec les ganglions de la racine dorsale connectés et transférez-les dans des boîtes de 35 millimètres contenant du milieu L 15 froid. À l’aide de pinces de microchirurgie, disséquez soigneusement les GDR connectés des moelles épinières dans le milieu L 15 froid sans endommager les GDR, en coupant les axones connectés.

En général, 20 à 30 ganglions de la racine dorsale sont isolés à partir d'une moelle épinière lorsque tous les ganglions ont été prélevés. Tous les ganglions isolés sont placés dans une solution de tripsine 0,125 % contenant du EDTA et incubés pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Laver les cellules une fois avec du DMEM contenant 20 % de FBS, puis ajouter des DNAs et pipeter plusieurs fois à l’aide d’une pipette en verre polie à la flamme afin d’obtenir une suspension cellulaire homogène, comme démontré avec les cellules gliales. Réaliser un deuxième lavage dans du milieu MBF, compter les cellules, puis les ensemencer sur les lamelles préparées dans des plaques de 24 puits à raison de 5 000 cellules par puits, et les incuber toute la nuit pour purifier les neurones des ganglions de la racine dorsale.

18 à 24 heures après l'ensemencement. Remplacer le milieu par un milieu neurobasal contenant 20 micromolaire de cinq fluoro deux doxy uridine 72 heures plus tard. Remplacer la moitié du milieu par un milieu neurobasal dépourvu de FUDR.

Le milieu est ensuite renouvelé tous les deux jours. Environ 20 jours après l'ensemencement des cellules gliales, celles-ci atteindront la confluence et seront prêtes à être co-cultivées avec les neurones, 24 heures avant la combinaison des deux types cellulaires.

Remplacez le milieu des cellules gliales par du milieu MBF. Préparez une suspension monocellulaire de ganglions rachidiens purifiés comme indiqué précédemment. Déterminez la densité cellulaire.

Ensuite, ensemencer les neurones à raison de 500 cellules par centimètre carré sur les cellules gliales. L’axone des neurones et la croissance des neurites sur les cellules gliales peuvent être analysés à différents points temporels à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image et d’immunochimie avec des anticorps spécifiques des types cellulaires. Voici des exemples de cellules gliales et de neurones du ganglion de la racine dorsale cultivés séparément et en co-culture : les cellules gliales deviennent confluentes après 20 jours.

En culture. Sous un microscope à contraste de phase, il était évident que les différentes sous-populations de cellules gliales formaient des motifs de croissance et des morphologies distincts. Et par immunocytochimie, les astrocytes positifs pour la GFAP représentaient plus de 90 % de la culture.

En utilisant notre méthode de traitement par FUDR pendant 72 heures, la pureté des neurones des ganglions de la racine dorsale atteindra jusqu'à 99 % en six jours et présentera leurs morphologies uniques avec une forte densité de croissance des neurites dans une co-culture de neurones et de cellules gliales. L'ensemencement des neurones DRG et l'élaboration des neurites se produisent facilement sur les cellules gliales dans les quatre heures suivant l'ensemencement ; la croissance des neurones et des neurites étant influencée par les sous-populations de cellules gliales, qui forment des sous-structures de motifs de croissance particuliers aisément identifiables au microscope à contraste de phase. Et par immunocytochimie, je vais simplement vous montrer comment cultiver des neurones DRG avec des cellules claires afin d'étudier l'influence de l'hétérogénéité des cellules gliales sur la croissance neuronale.

Lors de cette séance, il est très important de manipuler le tissu avec beaucoup de précaution et de maintenir les cellules dans le milieu. Ne les exposez jamais à l'air ni ne les laissez sécher. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.