Résonance de spin électronique Micro-imagerie d'espèces vivantes pour la cartographie d'oxygène

L'objectif général de l'expérience suivante est d'acquérir des images tridimensionnelles à l'échelle micrométrique de la concentration en oxygène dans l'environnement immédiat de cellules vivantes, au moyen de la microscopie par résonance de spin électronique ou RSE. Le protocole sera démontré sur des cyanobactéries, qui sont des cellules photosynthétiques courantes. Cela est réalisé en préparant d'abord un échantillon de cellules de cyanobactéries à l'intérieur du porte-échantillon de la microscopie RSE.

Intégré dans une solution stable de radicaux organiques. Le porte-échantillon est placé à l'intérieur de la sonde d'imagerie, qui est insérée dans l'électroaimant statique du système de microscopie de RPE. Plusieurs images microscopiques tridimensionnelles de RPE de la solution de radicaux organiques sont désormais acquises à l'aide du microscope de RPE.

Cela est réalisé pour plusieurs variantes de séquences d'impulsions et souvent dans diverses conditions externes, telles que sous lumière ou dans l'obscurité. Ensuite, les images des données brutes sont traitées par ordinateur afin d'extraire les temps de relaxation tridimensionnels résolus spatialement du radical. Ces temps de relaxation fournissent une mesure directe de la concentration en oxygène grâce à un étalonnage préexistant, permettant ainsi d'obtenir des cartes tridimensionnelles complètes en oxygène des échantillons mesurés dans différentes conditions externes.

Les résultats obtenus montrent clairement l'absence de production d'oxygène par les cyanobactéries en l'absence de lumière. En outre, il est démontré qu'en présence d'irradiation lumineuse, un gradient d'oxygène important et une hétérogénéité de l'oxygène se forment à proximité des cellules de cyanobactéries. Bonjour, je suis Al du laboratoire de BLA à la faculté S de chimie du Technion, Institut israélien de technologie à Haïfa.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de cartographier les concentrations d'oxygène au voisinage des cellules vivantes en trois dimensions et avec une haute résolution spatiale, au moyen de la microscopie FIS-ARM. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le taux de consommation d'oxygène et l'activité métabolique des cellules. Commençons donc.

La résonance paramagnétique électronique ou RPE est une technique spectroscopique dans laquelle un rayonnement électromagnétique à une fréquence spécifique est absorbé par des espèces paramagnétiques possédant un spin électronique non apparié, placées dans un champ magnétique statique externe. Il s'agit d'une méthode puissante pour étudier l'environnement des molécules paramagnétiques dans des espèces vivantes, notamment les concentrations d'oxygène et d'espèces réactives de l'oxygène. Voici une image typique de la concentration en oxygène chez une souris porteuse d'une tumeur, illustrant des échantillons hétérogènes.

Les informations spectrales de RPE peuvent être obtenues de manière résolue spatialement grâce à l'utilisation de gradients de champ magnétique. Un radical organique stable et libre a été injecté dans la souris, et ses caractéristiques de RPE fournissent la concentration en oxygène dans son environnement. Les résultats basés sur la RPE sont superposés à une image anatomique IRM.

Jusqu'à présent, de telles techniques d'imagerie de résonance paramagnétique électronique (RPE) sur des spécimens vivants n'avaient été réalisées qu'avec des échantillons relativement grands à l'échelle du millimètre. La microscopie RPE concerne les mesures d'échantillons de taille millimétrique et submillimétrique, fournissant des images tridimensionnelles de RPE avec une résolution approchant un micron.

Voici deux exemples d'images ESR à haute résolution à l'échelle micrométrique, de l'échantillon généré avec de la poudre NNC 60 et des cristaux paramagnétiques de cyanure de lithium. Un microscope ESR est similaire à un spectromètre ESR classique : il comprend un aimant pour générer le champ statique, un système micro-ondes pour l'excitation des spins et la détection du signal, une sonde pour maintenir l'échantillon, et une console informatisée pour contrôler le processus d'acquisition et le traitement des données. D'autres composants du système incluent des générateurs de gradient de champ magnétique, qui font partie du système électronique, ainsi que des bobines de gradient situées dans la sonde d'imagerie.

Les bobines de gradient possèdent également une ouverture permettant l'irradiation lumineuse de l'échantillon. Un air humide à température contrôlée est appliqué sur l'échantillon afin d'en minimiser la déshydratation durant l'expérience. Les principales caractéristiques uniques de la microscopie ESR sont la petite taille de la sonde et des bobines de gradient, la sensibilité accrue en spin du système, ainsi que la forte intensité des générateurs de gradient de champ magnétique. Avant le début de cette procédure, préparez une suspension de cyanobactéries à une concentration de 40 milligrammes par millilitre.

Pour commencer la préparation de l'échantillon pour l'imagerie micro-ESR, prenez quelques carrés de papier absorbant d'une taille d'environ 400 par 400 microns à l'aide de pinces fines. Insérez-les ensuite dans un tube einor. Remplissez par la suite le tube avec 1,2 millilitre de la suspension de cyanobactéries.

Ensuite, centrifuger le surnageant pendant deux minutes à 6 000 tr/min dans une microcentrifugeuse ; après la centrifugation, éliminer complètement le surnageant sauf environ 50 microlitres, qui sont laissés afin d'éviter la déshydratation des cyanobactéries. Ce processus entraîne la saturation du papier absorbant par les cellules de cyanobactéries. Préparer ensuite un porte-échantillon en verre spécialement conçu, extraire quelques fibres du papier à l’aide de fines pincettes et les placer au fond du porte-échantillon.

Ensuite, ajoutez trois millimolaires de tridel et de solution BG 11, préparée comme décrit dans le protocole écrit, à l’aide d’un huitième de seringue. Scellez ensuite le porte-échantillon avec une colle durcissable aux UV en appliquant la colle entre les bords du porte-échantillon en verre et sa lame de couverture correspondante, en laissant une petite sortie d’air ouverte. Enfin, durcissez la colle avec une lumière UV pendant deux secondes.

Pour commencer l'expérience d'imagerie, allumez le système d'imagerie micro-ESR et insérez l'échantillon dans le résonateur placé à l'intérieur de la sonde d'imagerie. À l'aide du logiciel de contrôle par ordinateur, mettez le système en mode accord et déterminez la fréquence de micro-ondes de résonance de la sonde, qui sera utilisée pour les mesures d'ESR. Ensuite, réglez le champ magnétique statique à la valeur correspondant à la fréquence de micro-ondes appliquée.

Définissez les paramètres temporels de la séquence d'impulsions et observez le signal de RPE pour vous assurer que le système fonctionne correctement et que l'échantillon est bien préparé. Ensuite, réglez les paramètres d'imagerie tels que le nombre de pixels, l'intensité des gradients et la durée des impulsions de gradient aux valeurs requises. Après la configuration, acquérez trois images 3D de RPE à l'aide d'une séquence d'impulsions d'imagerie par écho de Han, avec des valeurs de séparation interimpulsions tau de 500, 600 et 700 nanosecondes.

À ce stade, allumez le projecteur lumineux sur l'échantillon si cela est requis par les conditions expérimentales pendant toute la durée de l'acquisition ; les données sont alors automatiquement enregistrées. Après le processus d'acquisition des données, les fichiers de données brutes sont traités à l'aide d'un script logiciel MATLAB. À l'aide du logiciel, générez des images de la concentration du radical trill et du temps de relaxation.

T deux permet de cartographier puis de traduire ces images en une image de concentration en oxygène au moyen d'une courbe d'étalonnage préexistante qui relie la concentration en oxygène au temps de relaxation. Ici, T deux zéro est le temps de relaxation spin-spin du traceur dans des conditions anoxiques, dépendant de la concentration C du traceur et de son coefficient de diffusion D. Des images brutes typiques provenant de plusieurs expériences d'imagerie par résonance paramagnétique électronique tridimensionnelles réalisées sur des cyanobactéries sont présentées. Ces images ont été acquises avec différentes valeurs de tau, soit en conditions d'obscurité, soit en lumière.

Dans des conditions d'obscurité, les résultats sont très similaires, sauf pour une intensité réduite pour les valeurs plus élevées de T dues au temps de relaxation spin-spin T deux. Inversement, sous irradiation lumineuse, le motif de l'image change en raison de temps de relaxation différents à travers l'échantillon. Ces données sont ensuite traitées pour obtenir une image d'amplitude à partir de cette image.

Il est évident que les cyanobactéries se trouvent principalement du côté droit du porte-échantillon. Les deux images sont converties en valeurs de concentration en oxygène à l'aide d'une courbe d'étalonnage préexistante qui relie la concentration en oxygène au temps de relaxation. Les résultats sont présentés pour les cyanobactéries en présence et en absence de lumière.

Il est clair que la production d'oxygène est initiée par la lumière et provoque une augmentation significative de la concentration en oxygène dans la solution. Cela conduit à une diminution du radical T deux, principalement dans les voxels proches des fibres de papier absorbant contenant les cyanobactéries. Nous venons de vous montrer comment préparer un échantillon contenant des cellules vivantes avec un radical libre stable afin de cartographier la concentration en oxygène par microscopie de résonance paramagnétique électronique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de la maintenir aussi brève que possible afin d'assurer la reproductibilité et d'éviter la dégradation de l'échantillon.

Voilà, c'est terminé. Merci de nous avoir regardés et bonne chance avec votre expérience.