Name: Résonance de spin électronique Micro-imagerie despèces vivantes pour la cartographie doxygène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez la micro-imagerie par résonance de spin électronique pour cartographier l'oxygène autour de cellules vivantes. Cette méthode utilise des cyanobactéries photosynthétiques et permet d'étudier les gradients d'oxygène en trois dimensions.

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Ce travail a été partiellement financé par des subventions non. 213/09 de la science israélienne Fondation, accorder aucune. 2005258 de la fondation du BSF, accorder aucune. 201665 du Conseil européen de la recherche (CER), et par l&#39;Institut Russell Berrie Nanotechnology au Technion. Nous reconnaissons l&#39;aide du professeur Noam Adir et Faris Salame de la Faculté de chimie Schulich du Technion concernant la fourniture et la manutention des cyanobactéries. L&#39;aide et le soutien de Svetlana Yoffis du Technion Micro-Nano unité de fabrication est grandement appréciée.

1. Aperçu de l'ESR de micro-imagerie D'abord, nous donner une brève explication de l'ESR, la microscopie ESR, et les différentes composantes de notre système, puis nous décrirons les expériences d'imagerie réelle. Résonance paramagnétique électronique est une technique spectroscopique dans lequel le rayonnement électromagnétique à une fréquence spécifique est absorbée par les molécules avec des spins des électrons non appariés, placé sous un champ magnétique externe statique (figure 1). ESR est employé dans de vastes domaines de la science, comme la chimie, la biologie, la physique et la science des matériaux, pour la détection et l'identification des radicaux libres et des centres paramagnétiques. C'est une méthode puissante pour étudier l'environnement de molécules paramagnétiques d'espèces vivent et fournit des informations sur l'acidité (pH), la viscosité, d'oxygène et d'espèces réactives d'oxygène concentrations 3. Pour les échantillons hétérogènes, ESR informations spectrales peuvent être obtenus d'une manière résolue spatialement (ie, par l'obtention d'une image), grâce à l'utilisation des gradients de champ magnétique 4. Ceci est très similaire à la méthode plus commune de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) qui observe principalement des spins des protons. Jusqu'à maintenant, ces techniques d'imagerie RPE ont été appliquées pour les spécimens vivants de la taille relativement grande de quelques centimètres et en millimètres échelle résolution. (Par exemple, voir la figure 2, tirée de la référence 5.) Un développement relativement récent dans l'imagerie ESR est l'extension de ses capacités en regardant les petits animaux à l'échelle millimétrique résolution à la mesure des échantillons millimétriques et submillimétriques-size avec l'échelle du micron résolution. Ce champ est connue comme la microscopie ESR, qui aujourd'hui peuvent fournir des images 3D ESR avec une résolution voisine de 1 micron 2 (voir des exemples représentatifs de la figure 3). Un microscope ESR est essentiellement similaire à un spectromètre RPE conventionnelle. Il a un aimant pour générer le champ statique, un système de micro-ondes pour l'excitation de spin et de détection de signal, une sonde pour la tenue de l'échantillon, et une console informatisée pour contrôler le processus d'acquisition et de traitement des données. D'autres composants uniques de l'imagerie en général et ESR existantes également en microscopie ESR sont magnétiques sources gradient de champ, qui font partie du système électronique, et des bobines de gradient qui sont situés dans la sonde d'imagerie. Plus de détails sur notre système spécifiques sont présentés dans le film du protocole et décrit dans la référence 2. 2. Préparation ESR exemples de micro-imagerie Cette étape décrit la méthode pour la préparation des échantillons pour l'ESR de micro-imagerie expérience. A la fin de cette étape de cellules sont placées sur le fond d'un conteneur spécialement préparé ESR échantillon de verre de microscopie avec un trityle radicale 6 solution tampon. Ce protocole décrit la mesure de cellules de cyanobactéries, et donc, pour d'autres types de cellules, les ajustements appropriés peuvent être nécessaires au stade de la préparation de l'échantillon. <ol><li> Tout d'abord, quelques carrés de papier absorbant avec une taille d'environ 400 400 um sont prises et inséré dans un tube Eppendorf qui est ensuite remplie de 1,2 ml de la suspension de cyanobactéries (à une concentration de 40 mg / ml). </li><li> La suspension est centrifugée pendant 2 minutes à 6000 RPM dans une microcentrifugeuse. </li><li> Suite à cela, le tampon surnageant est complètement enlevée, sauf pour ~ 50 uL qui sont à gauche pour éviter la déshydratation des cyanobactéries. En conséquence de ce processus, le papier absorbant est maintenant saturé par les cellules de cyanobactéries. </li><li> En utilisant une pince à épiler fine, quelques fibres sont extraites du papier et placés sur le fond d'une coupelle porte-verre échantillons préparés spécialement 7. Après qu'un mm 3 de trityle dans BG-11 solution de 8, 9 (voir schéma 1) est ajouté au porte-échantillon à l'aide d'une seringue fine. Le titulaire est alors scellé à l'aide de la colle UV curable, laissant une petite ouverture de sortie d'air. <table border="1"><tbody><tr><td> Stock 4 </td><td> Stock 3 </td><td> Stock 2 </td><td> Stock 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Ferrique 0.6g/liter citrate d'ammonium </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> L'acide citrique: 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Namoo 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Schéma 1. Préparation du BG-11 moyennes. </li></ol> 3. ESR expériences de micro-imagerie <ol><li> Pour commencer l'expérience d'imagerie, tournez sur la RSE de micro-imagerie système et insérez l'échantillon dans le résonateur qui va à l'intérieur de la sonde d'imagerie. </li><li> Maintenant, en utilisant le logiciel de contrôle d'ordinateur, réglez le système sur le mode "Tune" et de trouver la fréquence micro-ondes de résonance de la sonde, qui sera utilisé pour les mesures de l'ESR. </li><li> Suite à cela, définissez le champ magnétique statique sur la valeur qui correspond à la fréquence micro-ondes appliquée, réglez les paramètres de timing pour la séquence d'impulsions et d'observer le signal ESR pour s'assurer que le système fonctionne bien et l'échantillon est bien préparé. </li><li> Ensuite, définissez les paramètres d'imagerie, telles que le nombre de pixels, la force des gradients, et la longueur des impulsions de gradient à leurs valeurs requises. </li><li> Après l'installation, recueillir trois images 3D ESR par une séquence d'écho de Hahn imagerie impulsion (figure 4) avec une séparation interpulse, les valeurs de  500, 600 et 700 ns. </li><li> Lumière projetée à l'échantillon est allumé ou éteint selon les conditions requises expérimental. </li><li> Pendant l'acquisition, les données sont automatiquement sauvegardées. Les thèses fichiers de données brutes sont ensuite traitées via le script du logiciel Matlab pour fournir des images de la concentration trityle radical et le temps de relaxation T 2 carte, qui est traduit en une image la concentration en oxygène via une pré-existants d'étalonnage. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Les résultats de l'expérience sont en trois dimensions de plusieurs ESR micro-images enregistrées à des valeurs τ différents. Typiques premières images données sont fournies dans la Figure 5. Les trois meilleurs images, mesurée dans des conditions sombres, sont très similaires, sauf pour la réduction de l'intensité du signal. D'autre part, les changements de modèle d'image sous irradiation lumineuse due à des temps de relaxation différents dans différentes parties de l'échantillon. Ces données peuvent être traitées une à obtenir une image d'amplitude, comme le montre la figure 6 et également des images du temps de relaxation T 2 (figure 7). Les deux images T sont convertis en valeurs de concentration d'oxygène à travers une courbe de calibration pré-existante qui relie la concentration en oxygène au temps de relaxation grâce à l'équation: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Équation 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Équation 1"> Ici, T 2 0 est le temps de relaxation spin-spin de la sonde dans des conditions anoxiques (en fonction de la concentration de la sonde, C, et son coefficient de diffusion, D), et k est une constante de proportionnalité. Dans la plupart des cas, le coefficient de diffusion ne varie pas beaucoup d'échantillons vivants (quoique, si nécessaire, il peut en principe être directement évalués également par ESR 6, 10), et la concentration de rotation est obtenu au cours du processus d'imagerie. Par conséquent, cette relation peut être utilisée pour mesurer directement la concentration en oxygène. Pour en revenir à la figure 6, il est évident d'après l'image d'amplitude que les cellules de cyanobactéries ont été principalement situés sur le côté droit du porte-échantillon. En outre, sur la figure 7, il est clair que la lumière déclenche la production d'O 2 et provoque une augmentation significative de la solution S 2 de concentration, principalement dans les voxels à proximité de la cyanobactérie. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Les niveaux d'énergie dans la résonance spin de l'électron. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: l'image typique de la concentration en oxygène d'une souris portant une tumeur. L'image de gauche montre les informations anatomiques, basé sur une image IRM. Un libre stable radical organique a été injecté à la souris et ses caractéristiques ESR fournir la concentration d'oxygène à son environnement (à droite). ESR-base des résultats sont superposées sur l'image IRM anatomique. Champ de vision est de 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: Deux exemples de haute résolution de micro-échelle ESImages R de l'échantillon photolithographie générés avec N @ C 60 en poudre (à gauche) et des cristaux paramagnétiques LIPC (à droite) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: typique Hahn imagerie séquence d'impulsions micro-ondes montrant l'(MW) et le gradient, G x, G y et z G impulsions. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5: typique données brutes ESR micro-images: a, b et c sont des données brutes de l'échantillon cyanobactérie sans éclairage en lumière mesurée pour τ = 500600700 ns, respectivement. Articles D, E, et sont les mêmes que a, b et c, mais avec un éclairage en lumière. L'intensité est tracée en échelle arbitraire (mais est compatible au sein de chaque ensemble de trois images sombres ou lumineuses données brutes) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6: image d'amplitude correspondant à la concentration dans la solution radicale (échelle arbitraire). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figure 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7: T 2 images et les correspondants [O 2] valeurs sous sombres (à gauche) et léger (à droite) les conditions.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
<li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE%5BTitle%5D)+AND+%22ESR.+J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li>
<li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

Ce protocole montre comment ESR de micro-imagerie peut être appliquée à cartographier la concentration d&#39;oxygène à proximité de vivre de petits échantillons. Une résolution spatiale de ~ 30 x 30 x 100 um est démontré, avec une sensibilité quasi-micromolaires concentration en oxygène et sous-femtomoles sensibilité à l&#39;oxygène absolue par voxel. L&#39;utilisation de l&#39;ESR de micro-imagerie pour la cartographie de l&#39;oxygène à proximité de cellules complète les techniques actuellement disponibles à base de micro-électrodes ou de fluorescence / phosphorescence. Par ailleurs, avec la sonde paramagnétique appropriée, il sera facilement applicable pour l&#39;oxygène intracellulaire de micro-imagerie, une capacité qui trouvent d&#39;autres méthodes très difficile à réaliser. Dans le futur proche, nous prévoyons sur l&#39;amélioration de cette méthodologie pour fournir des images en direct de l&#39;échantillon avec une résolution de quelques microns, fournissant des paramètres de contraste telles que la concentration d&#39;oxyde de super, l&#39;acidité (pH), coefficient de diffusion de la sonde et, bien sûr, la concentration en oxygène. Ces capacités sont complémentaires à l&#39;actuelle optique basée sur des méthodologies à la fois en termes de type de contraste et aussi des caractéristiques des échantillons (par exemple, non transparente des échantillons d&#39;épaisseur et, dans certains cas, les mesures intracellulaire vs extracellulaire).

<table><tbody><tr><td>Centrifugeuse </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Radical triarylméthyle (trityle) perdeutéré</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Synthétisé à Novosibirsk selon la méthode décrite dans la référence &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td> tampon BG-11</td><td></td><td></td><td>Pour les instructions de préparation, voir le schéma 1 et les références 8, 9.</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Polymérisation par rayonnement ultraviolet</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63 ou NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

résonance de spin électronique micro-imagerie d&#39;espèces vivantes pour la cartographie d&#39;oxygène

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Ce protocole décrit une résonance de spin électronique (ESR) de micro-imagerie méthode pour la cartographie en trois dimensions des niveaux d&#39;oxygène dans l&#39;environnement immédiat des cellules vivantes présentant de l&#39;échelle du micron de résolution 1. L&#39;oxygène est l&#39;une des molécules les plus importants dans le cycle de vie. Il sert de l&#39;accepteur d&#39;électrons terminal de la phosphorylation oxydative dans les mitochondries et est utilisé dans la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène. Les mesures de l&#39;oxygène sont importants pour l&#39;étude des fonctions mitochondriales et métaboliques, les voies de signalisation, les effets de différents stimuli, perméabilité de la membrane, et la différenciation de la maladie. La consommation d&#39;oxygène est donc un marqueur informatif du métabolisme cellulaire, qui est largement applicable à divers systèmes biologiques à partir des mitochondries dans les cellules d&#39;organismes entiers. En raison de son importance, de nombreuses méthodes ont été développées pour les mesures de l&#39;oxygène dans les systèmes de vivre. Les tentatives actuelles pour fournir l&#39;oxygène d&#39;imagerie à haute résolution sont essentiellement basées sur la fluorescence optique et les méthodes de phosphorescence qui ne fournissent pas de résultats satisfaisants car ils emploient des sondes avec photo-toxicité et une sensibilité élevées en oxygène est faible. ESR, qui mesure le signal provenant de sondes paramagnétiques exogènes dans l&#39;échantillon, est connu pour fournir des mesures très précises de la concentration en oxygène. Dans un cas typique, les mesures ESR carte élargissement LineShape de la sonde et / ou de détente en temps le raccourcissement qui sont directement liés à la concentration en oxygène local. (Oxygène est paramagnétique, par conséquent, en cas de collision avec la sonde paramagnétique exogènes, c&#39;est la brièveté de son temps de relaxation). Traditionnellement, ces types d&#39;expériences sont réalisées à faible résolution, l&#39;échelle millimétrique ESR pour l&#39;imagerie des petits animaux. Nous montrons ici comment ESR imagerie peuvent également être effectuées dans le micron-échelle pour l&#39;examen de petits échantillons vivants. ESR de micro-imagerie est une méthodologie relativement nouvelle qui permet l&#39;acquisition de signaux résolus spatialement ESR avec une résolution voisine de 1 micron à 2 température ambiante. L&#39;objectif principal de ce protocole-papier est de montrer comment cette nouvelle méthode, avec récemment développé des sondes sensibles à l&#39;oxygène, peuvent être appliquées à la cartographie des niveaux d&#39;oxygène dans de petits échantillons vivants. Une résolution spatiale de ~ 30 x 30 x 100 um est démontré, avec une sensibilité quasi-micromolaires concentration en oxygène et sous-femtomoles sensibilité à l&#39;oxygène absolue par voxel. L&#39;utilisation de l&#39;ESR de micro-imagerie pour la cartographie de l&#39;oxygène à proximité de cellules complète les techniques actuellement disponibles à base de micro-électrodes ou de fluorescence / phosphorescence. Par ailleurs, avec la sonde paramagnétique appropriée, il sera aussi facilement applicables pour l&#39;oxygène intracellulaire de micro-imagerie, une capacité qui trouvent d&#39;autres méthodes très difficile à réaliser.

Ce protocole décrit une méthode pour l&#39;échelle du micron imagerie en trois dimensions de la concentration d&#39;oxygène dans l&#39;environnement immédiat des cellules vivantes par microscopie résonance de spin des électrons.

Résonance de spin électronique Micro-imagerie d&#39;espèces vivantes pour la cartographie d&#39;oxygène

Ce protocole décrit une méthode de micro-imagerie par résonance paramagnétique électronique (RPE) pour la cartographie tridimensionnelle des niveaux d'oxygène dans l'environnement immédiat...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'acquérir des images tridimensionnelles à l'échelle micrométrique de la concentration en oxygène dans l'environnement immédiat de cellules vivantes, au moyen de la microscopie par résonance de spin électronique ou RSE. Le protocole sera démontré sur des cyanobactéries, qui sont des cellules photosynthétiques courantes. Cela est réalisé en préparant d'abord un échantillon de cellules de cyanobactéries à l'intérieur du porte-échantillon de la microscopie RSE.Intégré dans une solution stable de radicaux organiques. Le porte-échantillon est placé à l'intérieur de la sonde d'imagerie, qui est insérée dans l'électroaimant statique du système de microscopie de RPE. Plusieurs images microscopiques tridimensionnelles de RPE de la solution de radicaux organiques sont désormais acquises à l'aide du microscope de RPE.Cela est réalisé pour plusieurs variantes de séquences d'impulsions et souvent dans diverses conditions externes, telles que sous lumière ou dans l'obscurité. Ensuite, les images des données brutes sont traitées par ordinateur afin d'extraire les temps de relaxation tridimensionnels résolus spatialement du radical. Ces temps de relaxation fournissent une mesure directe de la concentration en oxygène grâce à un étalonnage préexistant, permettant ainsi d'obtenir des cartes tridimensionnelles complètes en oxygène des échantillons mesurés dans différentes conditions externes.Les résultats obtenus montrent clairement l'absence de production d'oxygène par les cyanobactéries en l'absence de lumière. En outre, il est démontré qu'en présence d'irradiation lumineuse, un gradient d'oxygène important et une hétérogénéité de l'oxygène se forment à proximité des cellules de cyanobactéries. Bonjour, je suis Al du laboratoire de BLA à la faculté S de chimie du Technion, Institut israélien de technologie à Haïfa.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de cartographier les concentrations d'oxygène au voisinage des cellules vivantes en trois dimensions et avec une haute résolution spatiale, au moyen de la microscopie FIS-ARM. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le taux de consommation d'oxygène et l'activité métabolique des cellules. Commençons donc.La résonance paramagnétique électronique ou RPE est une technique spectroscopique dans laquelle un rayonnement électromagnétique à une fréquence spécifique est absorbé par des espèces paramagnétiques possédant un spin électronique non apparié, placées dans un champ magnétique statique externe. Il s'agit d'une méthode puissante pour étudier l'environnement des molécules paramagnétiques dans des espèces vivantes, notamment les concentrations d'oxygène et d'espèces réactives de l'oxygène. Voici une image typique de la concentration en oxygène chez une souris porteuse d'une tumeur, illustrant des échantillons hétérogènes.Les informations spectrales de RPE peuvent être obtenues de manière résolue spatialement grâce à l'utilisation de gradients de champ magnétique. Un radical organique stable et libre a été injecté dans la souris, et ses caractéristiques de RPE fournissent la concentration en oxygène dans son environnement. Les résultats basés sur la RPE sont superposés à une image anatomique IRM.Jusqu'à présent, de telles techniques d'imagerie de résonance paramagnétique électronique (RPE) sur des spécimens vivants n'avaient été réalisées qu'avec des échantillons relativement grands à l'échelle du millimètre. La microscopie RPE concerne les mesures d'échantillons de taille millimétrique et submillimétrique, fournissant des images tridimensionnelles de RPE avec une résolution approchant un micron.Voici deux exemples d'images ESR à haute résolution à l'échelle micrométrique, de l'échantillon généré avec de la poudre NNC 60 et des cristaux paramagnétiques de cyanure de lithium. Un microscope ESR est similaire à un spectromètre ESR classique : il comprend un aimant pour générer le champ statique, un système micro-ondes pour l'excitation des spins et la détection du signal, une sonde pour maintenir l'échantillon, et une console informatisée pour contrôler le processus d'acquisition et le traitement des données. D'autres composants du système incluent des générateurs de gradient de champ magnétique, qui font partie du système électronique, ainsi que des bobines de gradient situées dans la sonde d'imagerie.Les bobines de gradient possèdent également une ouverture permettant l'irradiation lumineuse de l'échantillon. Un air humide à température contrôlée est appliqué sur l'échantillon afin d'en minimiser la déshydratation durant l'expérience. Les principales caractéristiques uniques de la microscopie ESR sont la petite taille de la sonde et des bobines de gradient, la sensibilité accrue en spin du système, ainsi que la forte intensité des générateurs de gradient de champ magnétique. Avant le début de cette procédure, préparez une suspension de cyanobactéries à une concentration de 40 milligrammes par millilitre.Pour commencer la préparation de l'échantillon pour l'imagerie micro-ESR, prenez quelques carrés de papier absorbant d'une taille d'environ 400 par 400 microns à l'aide de pinces fines. Insérez-les ensuite dans un tube einor. Remplissez par la suite le tube avec 1,2 millilitre de la suspension de cyanobactéries.Ensuite, centrifuger le surnageant pendant deux minutes à 6 000 tr/min dans une microcentrifugeuse ; après la centrifugation, éliminer complètement le surnageant sauf environ 50 microlitres, qui sont laissés afin d'éviter la déshydratation des cyanobactéries. Ce processus entraîne la saturation du papier absorbant par les cellules de cyanobactéries. Préparer ensuite un porte-échantillon en verre spécialement conçu, extraire quelques fibres du papier à l’aide de fines pincettes et les placer au fond du porte-échantillon.Ensuite, ajoutez trois millimolaires de tridel et de solution BG 11, préparée comme décrit dans le protocole écrit, à l’aide d’un huitième de seringue. Scellez ensuite le porte-échantillon avec une colle durcissable aux UV en appliquant la colle entre les bords du porte-échantillon en verre et sa lame de couverture correspondante, en laissant une petite sortie d’air ouverte. Enfin, durcissez la colle avec une lumière UV pendant deux secondes.Pour commencer l'expérience d'imagerie, allumez le système d'imagerie micro-ESR et insérez l'échantillon dans le résonateur placé à l'intérieur de la sonde d'imagerie. À l'aide du logiciel de contrôle par ordinateur, mettez le système en mode accord et déterminez la fréquence de micro-ondes de résonance de la sonde, qui sera utilisée pour les mesures d'ESR. Ensuite, réglez le champ magnétique statique à la valeur correspondant à la fréquence de micro-ondes appliquée.Définissez les paramètres temporels de la séquence d'impulsions et observez le signal de RPE pour vous assurer que le système fonctionne correctement et que l'échantillon est bien préparé. Ensuite, réglez les paramètres d'imagerie tels que le nombre de pixels, l'intensité des gradients et la durée des impulsions de gradient aux valeurs requises. Après la configuration, acquérez trois images 3D de RPE à l'aide d'une séquence d'impulsions d'imagerie par écho de Han, avec des valeurs de séparation interimpulsions tau de 500, 600 et 700 nanosecondes.À ce stade, allumez le projecteur lumineux sur l'échantillon si cela est requis par les conditions expérimentales pendant toute la durée de l'acquisition ; les données sont alors automatiquement enregistrées. Après le processus d'acquisition des données, les fichiers de données brutes sont traités à l'aide d'un script logiciel MATLAB. À l'aide du logiciel, générez des images de la concentration du radical trill et du temps de relaxation.T deux permet de cartographier puis de traduire ces images en une image de concentration en oxygène au moyen d'une courbe d'étalonnage préexistante qui relie la concentration en oxygène au temps de relaxation. Ici, T deux zéro est le temps de relaxation spin-spin du traceur dans des conditions anoxiques, dépendant de la concentration C du traceur et de son coefficient de diffusion D. Des images brutes typiques provenant de plusieurs expériences d'imagerie par résonance paramagnétique électronique tridimensionnelles réalisées sur des cyanobactéries sont présentées. Ces images ont été acquises avec différentes valeurs de tau, soit en conditions d'obscurité, soit en lumière.Dans des conditions d'obscurité, les résultats sont très similaires, sauf pour une intensité réduite pour les valeurs plus élevées de T dues au temps de relaxation spin-spin T deux. Inversement, sous irradiation lumineuse, le motif de l'image change en raison de temps de relaxation différents à travers l'échantillon. Ces données sont ensuite traitées pour obtenir une image d'amplitude à partir de cette image.Il est évident que les cyanobactéries se trouvent principalement du côté droit du porte-échantillon. Les deux images sont converties en valeurs de concentration en oxygène à l'aide d'une courbe d'étalonnage préexistante qui relie la concentration en oxygène au temps de relaxation. Les résultats sont présentés pour les cyanobactéries en présence et en absence de lumière.Il est clair que la production d'oxygène est initiée par la lumière et provoque une augmentation significative de la concentration en oxygène dans la solution. Cela conduit à une diminution du radical T deux, principalement dans les voxels proches des fibres de papier absorbant contenant les cyanobactéries. Nous venons de vous montrer comment préparer un échantillon contenant des cellules vivantes avec un radical libre stable afin de cartographier la concentration en oxygène par microscopie de résonance paramagnétique électronique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de la maintenir aussi brève que possible afin d'assurer la reproductibilité et d'éviter la dégradation de l'échantillon.Voilà, c'est terminé. Merci de nous avoir regardés et bonne chance avec votre expérience.

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