Administration orale de la roténone en utilisant un Gavage et analyse d'images d'alpha-synucléine inclusions dans le système nerveux entérique

Les symptômes de la maladie de Parkinson, incluant les troubles moteurs et la dysfonction de la parole, résultent d'une activité réduite des cellules sécrétant la dopamine dans le cerveau. Le système nerveux entérique et le bulbe olfactif sont les structures nerveuses les plus exposées et les premières à être touchées. La maladie de Parkinson a été associée à une exposition aux pesticides.

Afin d'analyser les effets des pesticides sur le système nerveux entérique, le pesticide roone est administré à des souris par gavage oral. Les souris sont ensuite perfusées par voie intracardiaque avec du paraformaldéhyde à 4 %, puis le cerveau et le système nerveux entérique sont prélevés. Les tissus sont extraits, préparés et soumis à une immunomarquage pour les protéines associées à la maladie de Parkinson.

Les images de la bêta-tubuline trois et de l'alpha-synucléine obtenues par microscopie confocale démontrent l'accumulation de l'alpha-synucléine à l'intérieur des neurones du système nerveux entérique chez les animaux exposés aux pesticides. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'administration systémique de roténone, est qu'elle permet de s'assurer que l'effet de la roténone reste limité au système nerveux entérique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la maladie de Parkinson, telles que son étiologie et les mécanismes sous-jacents à sa progression.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic de la maladie de Parkinson, car elles permettront le développement de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles méthodes diagnostiques. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme l'étude de l'effet d'autres toxines environnementales sur les systèmes nerveux entérique, sympathique et parasympathique ainsi que sur la paroi intestinale. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il faut un certain temps pour maîtriser la gavage.

J'ai eu pour la première fois l'idée de ces méthodes en lisant à propos du lien entre les pesticides et la maladie de Parkinson. Il a également été utile d'assister à la conférence CORAs élevées lors du Congrès mondial sur la maladie de Parkinson à Berlin en 2005. Une démonstration pacifique de cette méthode est nécessaire.

La méthode d'administration d'ol par gavage est difficile, car les souris possèdent une anatomie différente de celle des humains ; en revanche, l'analyse d'image a été réalisée selon des étapes personnalisées pour ces images. Commencez le protocole par peser l'animal. Calculez le volume approprié de rotenone.

0,01 millilitre est nécessaire par gramme de poids de l'animal, ce qui correspond à une dose de cinq milligrammes par kilogramme de roone. Remplir une seringue d'un millilitre avec la solution de roone, puis remplir une deuxième seringue avec la solution véhicule. Prendre la souris et tenir la queue de la souris d'une main.

Étirez la peau du cou en la tirant avec les deux premiers doigts de l'autre main. Une fois la tête immobilisée entre les deux doigts, appuyez-la contre la paume de la main et retournez-la. Immobilisez la queue.

À l’aide des quatrième et cinquième doigts, en maintenant la tête vers l’arrière, appuyez sur le palais pour ouvrir la bouche de la souris. Introduisez délicatement la sonde d’œsophage dans la bouche. Déplacez lentement la sonde vers l’estomac jusqu’à ce que sa longueur totale soit insérée.

Afin d'éviter que le produit n'atteigne les poumons, administrer la solution de roone ou le véhicule en appuyant doucement sur l'embolus. Une fois l'administration terminée, retirer lentement la sonde d'œsophage, puis replacer l'animal dans une autre cage jusqu'à ce que tous les animaux d'une même cage aient été traités. Après le traitement, les souris sont perfusées par voie intracardiaque avec un adjuvant de paraformaldéhyde à 4 %.

Dans du PBS, les intestins sont ensuite extraits par dissection et placés dans du saccharose à 15 % pendant une nuit. Le jour suivant, le tissu est transféré dans du saccharose à 30 % et incubé à nouveau toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le tissu est ensuite placé dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius et conservé jusqu'à son utilisation. À l'aide d'un cryostat, des coupes de 20 micromètres de l'intestin sont réalisées.

Des coupes transversales sont transférées sur des lames porte-objets, puis bloquées et soumises à des procédures d'immunomarquage. L'utilisation d'anticorps anti-bêta-tubuline III et anti-α-synucléine est ensuite effectuée. Il est recommandé qu'une personne extérieure réalise une analyse aveugle des données.

Pour commencer l'analyse, ouvrez le logiciel Fiji. Ouvrez le fichier d'image confocale. Ensuite, séparez les canaux afin de pouvoir travailler sur chaque canal indépendamment.

Fermez les canaux qui ne seront pas utilisés et sélectionnez, analysez, réglez, mettez à l'échelle, puis réglez la taille du pixel à un. Définissez la distance connue à 0,13 et cliquez sur global. La taille de l'image s'affichera désormais en micromètres.

Sélectionnez le canal de l'alpha-synucléine et sélectionnez le ganglion. Assurez-vous que la sélection englobe le ganglion dans toutes les tranches. Dupliquez l'image avec uniquement le ganglion sélectionné : une image de la taille du ganglion sera dupliquée.

Appuyez sur éditer : la zone en dehors de la région sélectionnée deviendra noire. Dupliquez à nouveau l'image pour évaluer la qualité de la procédure. Les images présentant un faible rapport signal sur bruit de fond ne doivent pas être utilisées pour l'analyse d'image.

Sélectionnez l'image, ajustez le seuil, puis sélectionnez l'entropie maximale. Ensuite, parcourez les tranches de l'image rognée et de l'originale pour vous assurer que la procédure s'est bien déroulée.

Le seuil de détection sélectionne un niveau de signal d'intensité en fonction de l'histogramme de l'image, et seuls les pixels dont l'intensité est supérieure à ce seuil seront affichés dans un processus de sélection d'image en blanc sur fond noir. Ensuite, cliquez sur « smooth ». Cette étape transforme les bords pixelisés des images en bords lisses dans le processus de sélection.

Ensuite, cliquez sur binaire et choisissez Convertir en binaire. L'image s'affichera en noir sur fond blanc. Dupliquez l'image pour effectuer l'étape suivante sur la copie : cliquez sur Analyser, puis Analyser les particules. Sélectionnez ensuite Afficher les contours et cliquez sur Résumer.

Le reste des paramètres doit être laissé par défaut. Cette fonction reconnaît le nombre total de pixels portant un signal ainsi que la surface totale des pixels groupés avec signal. De plus, le nombre de groupes de pixels et la taille moyenne sont indiqués.

Comparez et sélectionnez la coupe présentant la plus grande surface totale qui s'ajuste bien. La coupe sera marquée. Copiez le tableau de données contenant la surface totale de l'alpha-synucléine, le nombre d'inclusions et la taille moyenne des particules.

Collez les données dans un tableur Excel ou annotez-les ailleurs. Revenez à Fiji. Retrouvez la coupe précédemment sélectionnée dans le canal de la bêta-tubuline et sélectionnez-la.

Sélectionnez la zone du ganglion et cliquez sur analyser. Ensuite, sélectionnez mesurer. Un autre tableau apparaîtra, indiquant la surface totale du ganglion.

Extraire les données du tableau vers un classeur Excel près de la mesure de l'alpha-synucléine ou les recopier ailleurs à l'aide d'Excel. Diviser les différents paramètres obtenus lors de la mesure de l'alpha-synucléine par la surface du ganglion afin d'obtenir la surface totale d'alpha-synucléine et le nombre d'inclusions normalisés par la taille du ganglion, dans le but d'analyser les effets du rotenone agissant localement sur le système nerveux entérique. Cinq milligrammes par kilogramme du pesticide rotenone ont été administrés par gavage oral à des souris C57BL/6 âgées de 1 an. Le chromatogramme présenté ici montre la présence d'un pic de rotenone une heure après l'administration ; des souris contrôles ont été traitées avec 20 milligrammes par kilogramme de rotenone et 10 ainsi que 5 milligrammes par kilogramme de rotenone.

Les concentrations de roténone ont été déterminées dans le sang et dans les extraits de cerveau et de tronc cérébral par HPLC, comme indiqué ici. L'administration de cinq milligrammes par kilogramme de roténone par gavage oral ne donne pas lieu à des concentrations mesurables dans le sang une, deux ou trois heures après le traitement, selon l'analyse par HPLC. Ce graphique montre les concentrations de roténone dans le cerveau et le tronc cérébral de souris traitées.

Une heure après l'administration d'extrait de 10 milligrammes par kilogramme ou moins de roténone, aucun niveau de roténone n'est détecté dans les échantillons de cerveau ou de tronc cérébral. Une heure après l'administration, l'activité du complexe mitochondrial I a été évaluée dans les échantillons de muscle et de cerveau de souris traitées pendant 1,5 mois. Aucune différence significative n'est observée entre les groupes, ce qui indique l'absence d'inhibition du complexe mitochondrial I, confirmant ainsi qu'il n'y avait pas de roténone dans ces régions.

Analyse de l'alpha-synucléine, composant des corps de Lewy dans la maladie de Parkinson, après administration de rone, permettant une détermination fiable de la quantité totale d'alpha-synucléine en surface, de la présence d'inclusions d'alpha-synucléine et du motif d'alpha-synucléine dans la cellule. Cette image montre une coloration anti-bêta-tubuline III, alpha-synucléine et DAPI sur des coupes de duodénum et d'iléon, comme on peut le voir ici. Un traitement de 1,5 mois avec roach connu a induit un motif ponctué accru d'alpha-synucléine à l'intérieur des ganglions du système nerveux entérique, même comparé aux témoins de trois mois.

Ce schéma est observable à la fois dans l'iléon et le duodénum. Après trois mois de traitement, la formation d'inclusions plus importantes d'alpha-synucléine peut être visualisée par coloration immunofluorescente utilisant l'anti-alpha-synucléine, le TOF, la flavine et le DPI, qui mettent en évidence l'agrégation d'accumulations plus importantes d'alpha-synucléine uniquement après trois mois. Cette expérience a été analysée à l'aide de méthodes automatiques de segmentation et de seuil basé sur l'entropie.

Dans le graphique de gauche, chaque colonne représente le rapport entre la surface totale de l'alpha-synucléine et la surface du ganglion. Dans le graphique de droite, chaque colonne représente le nombre total d'inclusions d'alpha-synucléine par surface de ganglion analysée. Ensemble, ces données suggèrent qu'une administration locale de rotonone induit la phosphorylation, l'accumulation et l'agrégation de l'alpha-synucléine accompagnée d'une gliose dans les ganglions du système nerveux entérique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une minute par animal si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'introduire la sonde d'œsophagostomie délicatement, et si des obstacles sont rencontrés, il vaut mieux la retirer et la réintroduire en suivant ces procédures. D'autres méthodes telles que la HPLC, la coloration immunohistochimique et l'analyse d'image peuvent être effectuées. Cela permettra d'analyser d'autres régions, les effets de la substance ou même la présence de la substance dans le sang après son administration.

Cette technique a ouvert la voie aux neuroscientifiques pour étudier les effets des neurotoxines environnementales sur le système nerveux entérique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'appliquer correctement la jauge et d'analyser les images issues de l'immunohistochimie. N'oubliez pas que le travail avec des matières en décomposition peut être extrêmement dangereux.

Par conséquent, nous recommandons l'utilisation de gants et de masques lors de la réalisation de cette procédure.