Administration orale de la roténone en utilisant un Gavage et analyse d'images d'alpha-synucléine inclusions dans le système nerveux entérique

Les symptômes de la maladie de Parkinson, y compris le dysfonctionnement moteur et de la parole, résultent d’une activité réduite des cellules sécrétant de la dopamine dans le cerveau. Le système nerveux entérique et le bulbe olfactif sont les structures nerveuses les plus exposées et les premières touchées. La maladie de Parkinson a été associée à l’exposition aux pesticides.

Afin d’analyser les effets des pesticides sur le système nerveux entérique, le pesticide roone est administré à des souris par gavage oral. Les souris sont ensuite perfusées intracardiaques avec 4 % de paraforme, d’aldéhyde cérébral et de système nerveux entérique. Les tissus sont extraits, préparés et immunocolorés pour les protéines associées à la MP.

images de la tubuline bêta trois et de la synucléine alpha acquises par microscopie confocale montrent l’accumulation de l’alpha-synucléine à l’intérieur des neurones du système nerveux entérique chez les animaux exposés aux pesticides. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’administration systémique de roténone est qu’en utilisant cette technique, on s’assure que l’effet de la roténone est confiné au système nerveux entérique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la maladie de Parkinson, telles que son étiologie et les mécanismes sous-jacents à sa progression.

Les implications de cette technique étendent la thérapie par tour et le diagnostic de la maladie de Parkinson car elles permettront le développement de nouvelles cibles thérapeutiques et méthodes de diagnostic. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la physiopathologie de la maladie de Parkinson, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que l’étude de l’effet d’autres toxines environnementales sur les systèmes nerveux entérique, sympathique et parasympathique ainsi que sur la paroi intestinale. En général, les personnes qui ne connaissent pas ces méthodes auront du mal car il faut un certain temps pour maîtriser le gavage.

J’ai eu l’idée de ces méthodes pour la première fois lorsque j’ai lu sur le lien entre les pesticides et la maladie de Parkinson. Il a également été utile d’assister à la conférence CORA au Congrès mondial sur la maladie de Parkinson à Berlin en 2005. Une démonstration pacifique de cette méthode est nécessaire.

La méthode d’administration de l’ol avec le gavage est difficile car les souris ont une anatomie différente de celle des humains de l’autre côté, l’analyse des images a été faite avec des étapes personnalisées pour ces images. Commencez le protocole en pesant l’animal. Calculez le volume approprié de roténone.

0,01 millilitre est nécessaire par gramme de poids de l’animal, ce qui correspond à une dose de cinq milligrammes par kilogramme. Chargez une seringue d’un millilitre avec la solution roone, puis chargez une deuxième seringue avec la solution pour véhicule. Prenez la souris et tenez la queue de la souris d’une main.

Étirez la peau du cou en la tirant avec les deux premiers doigts de l’autre main. Une fois la tête fixée entre les deux doigts, appuyez-la contre la paume de la main et retournez-la. Fixez la queue.

À l’aide des quatrième et cinquième doigts, en gardant la tête vers l’arrière, appuyez sur le palais pour ouvrir la bouche de la souris. Introduisez doucement le gavage dans la bouche. Déplacez lentement le gavage en direction de l’estomac jusqu’à ce qu’il soit inséré dans toute sa longueur.

Afin d’éviter que le matériel ne pénètre dans les poumons, administrez la solution ou le véhicule en appuyant doucement sur l’embole. Une fois terminé, extrayez lentement le gavage, remettez l’animal dans une autre cage jusqu’à ce que tous les animaux d’une cage aient terminé. Après le traitement, les souris sont profusées par voie intracardiaque avec 4 % d’aldéhyde paraforme.

Dans le PBS, les intestins sont ensuite extraits par dissection et placés dans du saccharose à 15 % pendant la nuit. Le lendemain, le tissu est transféré à 30 % de saccharose et incubé à nouveau pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le tissu est ensuite placé dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius et stocké jusqu’à l’utilisation à l’aide d’un cryostat intestinal de 20 microns.

Les coupes transversales sont transférées sur des lames de rost, des procédures de blocage et d’immunomarquage. L’utilisation d’anticorps anti-bêta-trois tubulines et d’anticorps antifa synucléine est ensuite effectuée. Il est recommandé qu’une personne externe effectue une analyse à l’aveugle des données.

Pour commencer l’analyse, ouvrez le logiciel Fidji. Ouvrez le fichier d’image confocale. Ensuite, divisez les canaux de manière à pouvoir travailler sur chaque canal indépendamment.

Fermez les canaux qui ne seront pas utilisés et sélectionnez, analysez, définirez, mettrez à l’échelle et définissez la taille du pixel sur un. Réglez la distance connue à 0,13 et cliquez sur global. La taille de l’image sera désormais affichée en microns.

Sélectionnez le canal alpha synucléine et sélectionnez le ganglion. Assurez-vous que la sélection enferme le ganglion dans toutes les tranches. Dupliquer l’image avec le ganglion sélectionné uniquement une image de la taille du ganglion sera dupliquée.

Appuyez sur modifier effacer à l’extérieur, la partie de l’image en dehors de la région sélectionnée deviendra noire. Dupliquez à nouveau l’image pour déterminer si la procédure s’est bien déroulée. Les images dont le rapport signal/bruit de fond est faible ne doivent pas être utilisées pour l’analyse d’images.

Sélectionnez le seuil d’ajustement de l’image. Sélectionnez ensuite l’entropie maximale. Ensuite, déplacez les tranches de l’image recadrée et l’image d’origine pour vous assurer que la procédure s’est bien déroulée.

Le seuil tropique sélectionne un niveau de signal d’intensité basé sur l’histogramme de l’image, et seuls les pixels dont l’intensité est supérieure à ce seuil seront affichés dans un processus de sélection d’image blanc sur noir. Cliquez ensuite sur lisser. Cette étape transforme les bords pixélisés des images en processus de sélection des bords lisses.

Cliquez ensuite sur binaire et choisissez Rendre binaire. L’image s’affichera sous la forme d’une image dupliquée en noir sur blanc pour effectuer l’étape suivante sur l’image dupliquée, cliquez sur analyser, analyser les particules. Sélectionnez ensuite Afficher les contours et cliquez sur Résumer.

Le reste du paramètre doit être laissé par défaut. Cette fonction reconnaît le nombre total de pixels avec un signal et ceux qui sont regroupés la surface totale des pixels avec signal. De plus, le nombre de groupes de pixels et la taille moyenne sont indiqués.

Comparez et sélectionnez la tranche avec la plus grande surface totale qui s’ajuste bien. La tranche sera marquée. Copiez le tableau de données avec la surface totale de l’alpha-synucléine, le nombre d’inclusions et la taille moyenne des particules.

Collez les données dans une feuille de calcul Excel ou annotées ailleurs. Retour aux Fidji. Recherchez la tranche sélectionnée précédemment dans le canal de tubuline bêta et sélectionnez-la.

Sélectionnez la zone ganglionnaire et cliquez sur analyser. Sélectionnez ensuite mesurer. Un autre tableau apparaîtra montrant la surface totale du ganglion.

Extrayez les données du tableau dans une feuille de calcul Excel à côté de la mesure de la synucléine alpha ou copiez-les ailleurs à l’aide d’Excel. Diviser les différents paramètres obtenus dans la mesure de l’alpha synucléine par la surface ganglionnaire pour obtenir la surface totale de l’alpha-synucléine et le nombre d’inclusions normalisé par la taille du ganglion afin d’analyser les effets de la roone agissant localement sur le système nerveux entérique, cinq milligrammes par kilogramme de la pourriture pesticide connue a été administrée par gavage oral à des souris C 57 noires six âgées de 1 an. Le chromatogramme montré ici montre la présence d’un pic de rotan connu une heure après l’administration, des souris témoins traitées avec 20 milligrammes par kilogramme de roténone 10 et cinq milligrammes par kilogramme de roténone.

Les niveaux de roténone ont été déterminés pour les extractions de sang et de cerveau et du tronc cérébral par HPLC, comme indiqué ici. L’administration de cinq milligrammes par kilogramme de pourri par gavage oral n’entraîne pas de taux mesurables dans le sang une, deux ou trois heures après le traitement, comme déterminé par H plc. Ce graphique montre les niveaux de pourriture dans le cerveau et le tronc cérébral des souris traitées.

Une heure après l’extraction, l’administration de 10 milligrammes par kilogramme ou moins de roténone ne montre aucun taux de roton dans les échantillons de cerveau ou du tronc cérébral. Une heure après l’administration du complexe mitochondrial, une activité a été évaluée dans des échantillons de muscle et de cerveau de souris traitées pendant 1,5 mois. Il n’y a pas de différence significative entre les groupes ne montrant aucune inhibition du complexe mitochondrial, confirmant ainsi qu’il n’y avait pas de rone dans ces régions.

L’analyse de la maladie de Parkinson, composant à corps de Lewy alpha synucléine après l’administration de rone permet de déterminer de manière fiable la quantité totale de surface d’alpha synucléine, la présence d’inclusions d’alpha synucléine et le motif d’alpha synucléine dans la cellule. Cette figure montre la coloration anti-bêta-trois tubuline, alpha-synucléine et DAPI dans les coupes du duodénum et de l’iléon, comme on peut le voir ici. Un traitement de 1,5 mois avec des cafards connus a induit une augmentation du motif ponctué d’alpha synucléine à l’intérieur des ganglions du système nerveux entérique, même un par rapport à trois mois de contrôles.

Ce motif peut être observé à la fois dans l’iléon et le duodénum. Après trois mois de traitement, la formation d’inclusions d’alpha-synucléine plus grandes peut être observée, la coloration immunofluorescente à l’aide d’anti-alpha-synucléine, de théof, de flavine et de DPI démontre l’agrégation de plus grandes accumulations d’alpha-synucléine seulement à trois mois. Cette expérience a été analysée à l’aide de méthodes de segmentation automatique et de seuillage basées sur l’entropie.

Dans le graphique de gauche, chaque colonne représente la surface totale de l’alpha-synucléine à la surface du ganglion. Dans le graphique de droite, chaque colonne représente le nombre total d’inclusions d’alpha-synucléine par surface ganglionnaire prélevée. L’ensemble de ces données suggère que l’administration locale de roténone induit la phosphorylation, l’accumulation et l’agrégation de l’alpha-synucléine avec gliose dans les ganglions du système nerveux entérique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une minute par animal si elle est effectuée correctement.

Lors de cette tentative, il est important d’introduire le gavage en douceur, et si des obstacles sont trouvés, il est préférable de le sortir et de l’introduire à nouveau en suivant ces procédures. D’autres méthodes telles que l’HPLC, l’immunocoloration et l’analyse d’images peuvent être effectuées. Cela permettra d’analyser d’autres régions, les effets de la substance, ou encore la présence de la substance dans le sang après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux neuroscientifiques pour étudier les effets des neurotoxines environnementales sur le système nerveux entérique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’appliquer correctement la jauge et d’analyser les images qui proviennent de l’immunochimie. N’oubliez pas que travailler avec du pourri peut être extrêmement dangereux.

Par conséquent, nous recommandons l’utilisation de gants et de masques lors de l’exécution de cette procédure. Le.