Gramicidine basée Assay fluorescence; pour déterminer le potentiel de petites molécules pour modifier les propriétés bicouche lipidique

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les modifications induites par les médicaments sur les propriétés de la bicouche lipidique telles qu'elles sont détectées par des protéines traversant la bicouche. Cela est réalisé en premier lieu en préparant des vésicules unilatérales grandes chargées de fluor. La deuxième étape de la procédure consiste à dopage des vésicules avec de la gramicidine.

La troisième étape de la procédure consiste à ajouter un inhibiteur externe et à mesurer la vitesse d'inhibition du fluorophore interne. Quatre. La dernière étape de la procédure consiste à quantifier la variation de l'inhibition de la fluorescence par unité d'activité gramin en ajustant une fonction exponentielle étirée à la courbe temporelle de fluorescence. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus afin d'évaluer si les fichiers amfi peuvent modifier les propriétés de la bicouche lipidique.

Bonjour, je suis Ola Anderson. Bonjour, je suis Helson. Salut, je suis Richie Kapo.

Et je suis Leah Sanford du laboratoire du Dr. Olaf Anderson, du Département de physiologie et de biophysique du Weill Cornell Medical College. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de mesurer les changements dans les propriétés des bicouches lipidiques. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les effets de médicaments et de petites molécules sur les propriétés des bicouches lipidiques.

Commençons. Le premier jour de cette procédure, retirez le lipide du congélateur et laissez-le équilibrer à température ambiante. Une fois l'équilibre atteint, ajoutez 0,6 millilitre de solution de lipide à 25 milligrammes par millilitre dans le chloroforme dans un ballon rond de 25 millilitres. Ensuite, faites sécher la solution sous flux d'azote tout en faisant tourner continuellement le ballon jusqu'à ce que tout le chloroforme se soit évaporé.

Et un film blanc fin de lipide recouvre toute la moitié inférieure du flacon ; séchez davantage le lipide dans un dessiccateur sous vide toute la nuit. Préparez une solution de 100 millimolaire de nitrate de sodium, 25 millimolaire d’ANTS et 10 millimolaire de HEPES à pH 7. Lors de l’ajustement du pH de cette solution, évitez toute solution contenant des chlorures.

Étant donné que le réactif extincteur au thallium forme un complexe insoluble avec le chlorure le deuxième jour, réhydratez les lipides dans 1,67 millilitre de cette solution électrolytique afin d'obtenir une suspension lipidique à 10 millimolaire. Une fois la concentration correcte atteinte, couvrez avec du film parafilm, vortexez soigneusement la suspension, protégez l'échantillon de la lumière à l'aide de papier d'aluminium et laissez vieillir toute la nuit à température ambiante.

Le troisième jour, soniquez une minute le mélange dans un sonicateur de faible puissance. Ensuite, effectuez un cycle de congélation-dégelage de l'échantillon en cinq minutes sur de la glace sèche, suivies de cinq minutes dans de l'eau tiède ; répétez ce cycle de congélation-dégelage quatre à cinq fois. Extrudez la suspension lipidique à l’aide d’un extrudeur mini Avanti.

Configurer le mini-extrudeur avec un filtre en polycarbonate de 0,1 micron et des supports de filtre, puis extruder la suspension de droite à gauche 21 fois, de sorte qu'une suspension presque translucide se retrouve dans la seringue opposée, produisant ainsi une suspension de vésicules unilamellaires de grande taille (LUV). Éliminer les anticorps externes en faisant passer la suspension extrudée sur une colonne de chromatographie PD-10 préalablement équilibrée avec du tampon sodium. Ajouter 1,5 millilitre de la suspension de LUV ainsi qu'un millilitre de tampon sodium sur la colonne.

Une fois la solution entièrement incorporée dans la colonne, éluer les liposomes avec trois millilitres de tampon sodium et recueillir l'éluat. La solution mère de LUV chargée en A NTS obtenue devrait contenir environ quatre à cinq millimolaire de lipide et apparaître translucide. Blanc laiteux.

Protéger la solution de la lumière avec du papier d’aluminium et conserver à 13 degrés Celsius pendant 24 heures avant utilisation ; vortexer soigneusement. La solution mère de LUV remplie d’ANTS. Étant donné que les UUV ont une densité supérieure à un gramme par millilitre et/ou qu’ils sédimentent.

Ensuite, diluez la solution mère de LUV remplis d'ARNt avec le tampon sodium au 1/20. Incubez les trois quarts des liposomes avec 260 nanogrammes d'abidine dans du DMSO. Ajoutez le même volume de DMSO sans gramine au quart restant.

Pour maintenir la concentration de solvant constante dans tous les échantillons, laissez l'agramine équilibrer entre les monocouches interne et externe des vésicules lipidiques pendant 24 heures à 13 degrés Celsius. Ici, un spectrofluorimètre à arrêt d'écoulement SX Photophysics point 20 équipé d'un contrôle de température est utilisé pour mesurer la vitesse d'extinction de la fluorescence. Pour commencer, allumez les instruments une heure à l'avance afin de permettre leur mise en température.

L'ouverture avec rapporteurs pour l'excitation doit être de un sur un et un filtre passe-haut de 555 nanomètres doit être utilisé pour l'enregistrement de l'émission à l'aide du logiciel Pro Data SX. Configurez d'abord les conditions d'enregistrement, réglez les longueurs d'onde d'excitation du monochromateur sur 352 nanomètres. Utilisez le réglage de maintien de pression.

Régler le temps sur une seconde et les points sur 5 000. Ajuster le nombre de répétitions à neuf pour les analyses de tampon et à 13 pour les analyses de réactif extincteur. Surveiller la température dans le profil de contrôle du logiciel Essex.

Le volume d'entraînement doit être réglé à 120 microlitres, ce qui mélange 60 microlitres provenant de chaque seringue. Cela donne un temps mort d'environ 1,2 milliseconde. Ajustez la haute tension ou le gain du détecteur de fluorescence à environ 420 volts.

L'objectif est d'obtenir une mesure de fluorescence d'environ huit. Équilibrer les UUV chargées avec A NTS préparées auparavant pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius à l'abri de la lumière. Une fois l'équilibre atteint, vortexer l'échantillon, puis le charger dans la seringue gauche. Dans la seringue droite, charger soit du tampon sodium soit du thallium.Quencher.

Éliminez toutes les bulles d'air en poussant les seringues en avant et en arrière. Les deux seringues doivent être chargées de manière égale. Avant de fermer les vannes pour le tout premier échantillon, enregistrez la fluorescence avec le tampon de sodium.

Répétez quatre fois et ajustez le gain selon les besoins. Ensuite, répétez cinq fois supplémentaires pour les échantillons restants. Enregistrez neuf répétitions avec le tampon de sodium.

Remplacez le tampon de sodium par l'agent d'extinction au thallium et enregistrez 13 répétitions. Rincez à l'eau et poursuivez avec les contrôles suivants de l'échantillon. Incluez des échantillons sans gramin et avec le solvant, sans gramin et avec la concentration maximale du composé.

Et avec le gramin et le solvant suivant le test de fluorescence, lisez les données dans le logiciel MATLAB pour analyse. Pour chaque échantillon, lisez toutes les répétitions du tampon et de l'agent extincteur ; les quatre premières répétitions seront contaminées par ce qui se trouvait précédemment dans le tube. Dans ce cas, le signal provient du mélange de l'échantillon de tampon sodique avec l'eau du lavage précédent.

Les répétitions cinq à neuf représentent le signal provenant uniquement de l'échantillon. Par conséquent, nous excluons toujours les quatre premières répétitions dans chaque cas. Pour éviter tout artefact de mélange, examinez manuellement les courbes et supprimez toute répétition défectueuse, comme la courbe rouge contenant des pics ou des déviations dus à des artefacts de mélange ou à la présence de bulles.

Ensuite, normalisez les répétitions du réactif extincteur à la valeur initiale moyenne des répétitions du tampon pour chaque échantillon et chaque condition expérimentale, puis regroupez les moyennes de tous les échantillons en un seul graphique. Les échantillons de visualisation sans gramine doivent tous être similaires et présenter une extinction de fluorescence quasi nulle. Une réduction lente du signal fluorescent est observée en raison de l’entrée progressive des ions thallium dans les vésicules pour les échantillons contenant de la gramidine. Si le composé modifie visiblement le tracé temporel de la fluorescence, cela indique qu’il altère les propriétés de la bicouche lipidique à la concentration testée. Dans ce cas, ajustez une exponentielle étirée aux deux premières millisecondes à 100 millisecondes des courbes normalisées d’extinction de la fluorescence.

Pour les répétitions individuelles, calculez la vitesse à deux millisecondes. Ensuite, calculez les moyennes et les écarts types pour un échantillon donné à partir des répétitions individuelles. L'effet de la capsaïcine, notée ici « cap », a été observé sur le tracé cinétique de l'extinction de fluorescence en l'absence ou en présence de gramin, noté « ga ». Le signal fluorescent normalisé est représenté sur une durée d'une seconde. Les points gris représentent les résultats de toutes les répétitions, tandis que les lignes rouges correspondent aux moyennes.

Les 100 premières millisecondes du signal fluorescent normalisé sont affichées. Les points gris représentent les résultats d'une répétition unique pour chaque condition. Les lignes rouges correspondent à des ajustements par une exponentielle étirée pour ces répétitions.

La ligne bleue atténuée indique le repère de deux millisecondes. Le moment auquel le taux d'extinction est déterminé. La variation relative du taux d'extinction est déterminée en normalisant les données par rapport à l'échantillon témoin contenant du gramin et aucun modificateur.

Lorsque la capsaïcine s'adsorbe sur la bicouche lipidique, elle modifie les propriétés de cette bicouche. Le changement vers une bicouche plus souple se traduira par un déplacement du côté gram dans l'équilibre mono-dimère, en faveur du dimère conducteur. Nous venons de vous présenter une procédure permettant de mesurer les effets perturbateurs d'une petite molécule sur la bicouche.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous rappeler d'utiliser les contrôles appropriés pour chaque expérience, en utilisant la même série de vésicules. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.