La transfection seule cellule dans des embryons de poulet

L’objectif général de cette procédure est d’injecter dans des cellules uniques de somites chics ou de tubes neuraux un plasmide codant pour une protéine fluorescente verte. Pour ce faire, il faut d’abord tirer des pipettes de micro-injection avec un diamètre d’ouverture de pointe approprié. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer un stock de plasmides pour les injections.

La troisième étape de la procédure consiste à préparer les embryons pour l’injection. La quatrième étape de la procédure consiste à charger les micro-pipettes avec de l’ADN plasmidique. La dernière étape de la procédure consiste à injecter les tissus souhaités.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la gamme de dérivés dans le nombre de cellules produites par des progéniteurs marqués uniques dans des sous-domaines choisis du som et du tube neural grâce à la microscopie immunofluorescente. Bonjour, je m’appelle Raël et je travaille dans le laboratoire du professeur Heim au Département de neurobiologie médicale de l’Université hébraïque de Jérusalem. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’injection de cellules uniques de somites de poulet et de tubes neuraux.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la ségrégation des lignes des cellules de l’acarien et du tube neural. Pour générer des cellules transfectées uniques dans des embryons de poulet, commencez par tirer des micro-pipettes. Nous tirons nos pipettes sur un extracteur de pipettes standard Naga PP 83 avec un réglage de chaleur de 13,5.

Le réglage précis doit être calibré pour obtenir un diamètre de pointe de pipette compris entre huit et 10 microns. Nous utilisons des filaments contenant des tubes en verre de silicate Boris d’un diamètre extérieur d’un millimètre et d’un diamètre intérieur de 0,75 à 0,78 millimètre. Vous pouvez également utiliser des micro-pipettes disponibles dans le commerce, dépourvues d’un filament d’un millimètre de diamètre extérieur et de 0,75 millimètre de diamètre intérieur.

Les pipettes préparées sont stockées dans un plat en plastique avec les pointes protégées du contact avec le bord du bol. Pour préparer l’ADN à la micro-injection, le plasmide d’intérêt est transfecté dans DH cinq alpha e coli. En utilisant les procédures standard le lendemain, le plasmide est purifié à l’aide d’un kit de préparation Maxi pour les injections non clonales, nous utilisons une concentration d’ADN d’un microgramme par microlitre.

Pour les expériences où des clones individuels sont souhaités, la concentration plasmidique sera beaucoup plus faible et devra être ajustée. Pour P-C-A-G-G-F-P-A, une concentration de 0,05 à 0,1 microgramme par microlitre fonctionne bien. Une fois la concentration optimale déterminée, nous recommandons la dilution de l’ensemble du stock de plasmides purifiés plutôt que des préparations individuelles à une concentration prédéterminée.

Ce dernier pourrait introduire une certaine variance dans les taux de réussite, probablement en raison de variations de pureté et d’autres paramètres, tels que la proportion de plasmide supercoil pour préparer les œufs pour la micro-injection Les œufs de poule qui ont été incubés pendant qu’ils étaient couchés sur leurs longues haches jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soient écouvillonnés avec de l’éthanol à 70 % et laissés sécher. Ensuite, percez l’extrémité pointue de l’œuf avec des ciseaux chirurgicaux. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres et d’une aiguille de calibre 19, prélevez deux millilitres d’albumine de l’œuf, scellez les trous avec de la paraffine chaude avant l’injection.

Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir une fenêtre en haut de la coquille de l’œuf afin d’empêcher les débris de pénétrer dans le trou. Placez un morceau de ruban adhésif sur la fenêtre et percez un trou à travers celle-ci. Pour aider à visualiser l’embryon, utilisez un capillaire tiré par le feu monté sur un aspirateur pour injecter une encre non toxique telle que le pélican 17 sous le derme sablé.

Ensuite, accédez à l’embryon en coupant et en détournant les membranes vitales et/ou amniotiques à l’aide de broches anti-insectes de 0,14 millimètre montées sur un porte-aiguille pour charger l’ADN dans la pipette tirée Eloqua et ajoutez une petite quantité de poudre verte rapide à l’aide du capillaire. Prélevez une quantité minimale de capillaire monté sur plasmide de diamètre adéquat sur un aspirateur. Ensuite, insérez-le dans l’extrémité de la pipette opposée à la pointe aiguisée et chargez l’ADN aussi près que possible de l’extrémité aiguisée.

Ensuite, fixez la pipette sur un injecteur d’air manuel monté sur un micromanipulateur. Appliquez une pression minimale si nécessaire pour permettre à la solution plasmidique d’atteindre l’extrémité de la pipette. Manipulez la pipette dans le milieu liquide de l’œuf tout en appliquant une certaine pression d’air pour éviter le colmatage de la pointe de la pipette.

Une fois que le domaine tissulaire pertinent est percé, le changement de pression est souvent suffisant pour libérer le plasmide avec un vert rapide visible. Si ce n’est pas le cas, appliquez une légère pression sur la seringue jusqu’à ce que le mélange vert rapide plasmidique soit éjecté. Répétez cette procédure le long de l’axe de l’embryon après l’injection, du PBS peut être ajouté.

Enfin, scellez la fenêtre avec du ruban adhésif et remettez les œufs dans l’incubateur. Évitez la ventilation et incluez de petits récipients d’eau dans l’incubateur pour aider à maintenir l’humidité et augmenter les rendements. Si le site cible de l’injection était suffisamment superficiel pour être facilement apparent, comme dans le tube neural ou l’ectoderme du somite dorsal, on peut mesurer le taux de réussite de l’expérience en effectuant une observation de l’ensemble de la monture à l’aide de jumelles fluorescentes.

Cette étape est particulièrement utile pour évaluer si trop ou trop peu de cellules ont été marquées. Si une incubation supplémentaire est souhaitée, ajoutez une solution d’antibiotiques contenant du PBS à l’œuf après l’avoir vu et remplacez le ruban de plafond. De plus, on peut évaluer le taux de réussite de l’injection en sectionnant en série les embryons et en effectuant une immunohistochimie.

Après quatre heures ou plus, les embryons post-injection sont fixés et traités pour la section en paraffine. Les sections montées sur verre sont ensuite finalisées par depa et l’immunocoloration pour les méthodes d’amplification de visualisation du rapporteur telles que la biotine streptavidine pourrait être souhaitable. Enfin, les coupes en série sont balayées pour détecter les cellules marquées dans les segments injectés.

Si, lors des essais initiaux, plusieurs cellules sont obtenues plutôt qu’une seule, le stock plasmidique doit être dilué dans le processus répété jusqu’à ce que des résultats adéquats soient obtenus. Nous effectuons généralement une seule injection de P-C-A-G-G-F-P par acariens tout en ciblant six à 12 segments par embryon. Dans ce cadre, un signal clair peut être détecté par l’observation de l’ensemble du support, huit heures après l’injection, dans au moins un segment d’un embryon sur 10.

Dans cet exemple, un acariens a été injecté avec un plasmide codant pour la GFP, et cinq heures plus tard, une seule cellule fluorescente est observée dans une vue de montage entier de l’embryon montré ici. Lorsqu’il est observé 24 heures après l’injection dans l’acarien central, un clone de cellules fluorescentes est observé dans un embryon monté entier deux jours après l’injection clonale. La section de ce segment révèle la présence d’une descendance clonale dans le derme et le muscle, démontrant que des progéniteurs uniques génèrent les deux dérivés.

En ce qui concerne les somites, les progéniteurs neuroépithéliaux uniques du tube neural dorsal peuvent également être empalés, comme illustré dans cette coupe transversale, photographiée ici cinq heures après l’injection. L’analyse de la coupe en série a révélé que les transfets clonaux étaient atteints lorsque le taux de réussite était d’environ 10 %. Cela signifie que pour obtenir la clonalité, la technique est par définition très inefficace. D’autre part, dans ces conditions, plus de 93 % des événements de marquage positifs se sont avérés être clonaux.

Nous venons de vous montrer comment injecter des cellules uniques d’embryons de poulet lors de cette procédure. Il est important de ne pas oublier de diluer une grande quantité de plasmide stock à une concentration idéale pour les infections unicellulaires, puis de l’utiliser tout au long de vos expériences. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.