Electroeluting fragments d'ADN

Hi.Today nous allons vous montrer comment l’électro lution est réalisée afin de purifier les fragments d’ADN tels que les produits de digestion et de PCR. Pour d’autres objectifs tels que le clonage et le séquençage, l’électro lution peut être l’une des méthodes de choix. Sur la base de la charge électrique négative de l’ADN, une barrière cellulaire élevée est placée dans le champ électro, laissant tomber les fragments et empêchant leur migration ultérieure.

Cette méthode permet de purifier une large gamme de tailles de fragments d’ADN à partir de différentes sources avec une efficacité relativement élevée allant jusqu’à 80 %Son faible coût. Représentent un autre avantage de l’électro lution par rapport à d’autres méthodes de purification telles que les colonnes, les kits de résine, entre autres. L’échantillon d’ADN est d’abord visualisé par une électrophorèse sur gel d’Aris colorée au bromure de souche afin de visualiser et d’identifier le fragment souhaité à purifier, l’électrophorèse doit se poursuivre.

Les sous-fragments sont bien séparés, les sous-dimensionnés peuvent être déterminés avec précision. Suite à l’électrophorèse. Le fragment souhaité est soigneusement excisé du gel à l’aide d’une lame de rasoir toute neuve et en prenant soin de tourner la tranche de gel aussi près que possible de la bande d’intérêt.

Cette procédure doit être effectuée avec une protection appropriée contre les rayons UV et en portant des gants. Après avoir rempli l’électroluter avec le tampon de combustion approprié et pris soin de le renverser sur la surface du plateau intermédiaire, la tranche de gel est placée à l’intérieur de l’une des roues le plus près possible du canal en V. Il ne doit pas y avoir de bulles à l’intérieur du canal vch.

Cela peut être évité en rinçant le canal avec un tampon pour éliminer tout air emprisonné. Ensuite, 100 microlitres de la barrière de sel élevée sont ajoutés soigneusement au canal en V à partir du site proximal au puits. La chambre est fermée et les électrodes connectées à la source d’alimentation pour commencer l’électro lution à 100 à 120 volts.

Le laps de temps dépendra de la taille du fragment pour les gros fragments jusqu’à 20 kbs. 50 minutes à une heure devraient suffire et les petits fragments devraient être surveillés toutes les 10 minutes avec une lumière UV pour éviter que d’autres fragments ne traversent la solution saline et ne pénètrent dans la chaîne tampon adulte finale. Dans ce cas, nous avons digéré 560 nanogrammes de plasmide avec les enzymes ND un et entrée pour libérer une base de 900 par fragment, soit l’équivalent de 84 nanogrammes d’un échantillon.

En conséquence, après avoir placé la tranche de gel à l’intérieur du puits, l’électrocution se poursuivra pendant 25 minutes à 100 volts. Une fois que la solution électrique est terminée et que les fragments d’ADN sont piégés dans le coussin sud à l’intérieur du canal en V, 400 microlitres de solution sont récupérés du canal, du côté distal du réceptacle et placés dans un microtube de 1,5 microlitre à l’aide d’une pointe fine attachée à une micro fosse, procédez à la précipitation de l’alcool en ajoutant deux volumes d’éthanol absolu froid et mélangé par vortex. De plus, deux à trois microlitres de glycogène peuvent être ajoutés pour améliorer le rendement des tubes classiques de récupération de l’ADN à moins 20 degrés Celsius pendant une heure ou alternativement, stocker à cette température une centrifugeuse de nuit à quatre degrés Celsius à vitesse maximale pendant 25 minutes.

Ce surnageant cardio et laver en ajoutant un millilitre de centrifugeuse froide à 70 % d’éthanol à quatre degrés Celsius à vitesse maximale pendant cinq à 10 minutes, jeter le surnageant et laisser sécher à température ambiante avec les tubes en position inversée, graisses passées dans 10 à 15 microlitres d’eau libre de noyau et procéder à la détermination de la concentration de l’échantillon. Dans ce cas, l’échantillon purifié a été remis en suspension dans 10 microlitres d’eau et quantifié dans un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 260 nanomètres montrant une concentration de 6,3 nanogrammes par microlitre, représentant une efficacité de 75 %. Vous pensez peut-être qu’il vaudrait mieux que vous n’investissiez que 10 minutes de votre précieux temps avec un kit.

Cependant, malgré le temps consacré à ce processus, vous serez en mesure de contrôler de nombreuses variables qui vous permettront de purifier une plus large gamme d’échantillons portant dans la nature des tailles et des sources. Comme vous avez pu le voir dans le cas présent, une efficacité de 75 % a été observée, égale ou supérieure à celle de la plupart des kits de purification de l’ADN. Merci de vous joindre à nous aujourd’hui.

Nous espérons que vous avez trouvé ce protocole utile pour vos projets de recherche.