Electroeluting fragments d'ADN

Bonjour. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment l'électroélution est réalisée afin de purifier des fragments d'ADN, tels que les produits de digestion ou de PCR. Pour des applications ultérieures comme le clonage ou le séquençage, l'électroélution peut constituer l'une des méthodes de choix. Fondée sur la charge électrique négative de l'ADN, une barrière cellulaire élevée est placée dans le champ électrique, retenant les fragments et empêchant leur migration ultérieure.

Cette méthode permet la purification d'une large gamme de tailles de fragments d'ADN provenant de différentes sources, avec une efficacité relativement élevée pouvant atteindre 80 %. Son faible coût représente un autre avantage de l'électroélution par rapport à d'autres méthodes de purification telles que les colonnes ou les kits à base de résine, entre autres. L'échantillon d'ADN est d'abord visualisé par électrophorèse sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium, afin de visualiser et d'identifier le fragment souhaité à purifier, et l'électrophorèse doit alors être poursuivie.

Lorsque les fragments sont bien séparés, les fragments de taille inférieure peuvent être précisément déterminés. Après électrophorèse, le fragment désiré est soigneusement excisé du gel à l'aide d'une lame de rasoir neuve, en prenant soin de découper la tranche de gel aussi près que possible de la bande d'intérêt.

Cette procédure doit être réalisée avec une protection adéquate contre la lumière UV et en portant des gants. Après avoir rempli l'électrocuvette avec le tampon de migration approprié et pris soin de le répandre sur la surface du plateau central, le morceau de gel est placé à l'intérieur d'une des roues, aussi près que possible du canal en V. Il ne doit y avoir aucune bulle à l'intérieur du canal en V.

Cela peut être évité en rinçant le canal avec du tampon pour éliminer tout air piégé. Ensuite, 100 microlitres de la barrière à haute teneur en sel sont ajoutés soigneusement au canal V à partir du site proximal du puits. La chambre est fermée et les électrodes sont reliées à la source d'alimentation pour commencer l'électrolyse à 100 à 120 volts.

L'intervalle de temps dépendra de la taille du fragment pour les grands fragments allant jusqu'à 20 kpb. Entre 50 minutes et une heure devrait suffire, tandis que les petits fragments doivent être surveillés toutes les 10 minutes à l'aide d'une lumière UV afin d'éviter une élution supplémentaire à travers la solution saline et dans la chaîne tampon finale. Dans ce cas, nous avons digéré 560 nanogrammes de plasmide avec les enzymes ND1 et Entry pour libérer un fragment de 900 paires de bases, équivalent à 84 nanogrammes d'échantillon.

Par conséquent, après avoir placé le morceau de gel dans le puits, l'électroélution se déroule pendant 25 minutes à 100 volts. Une fois l'électroélution terminée et les fragments d'ADN piégés dans le coussin sud du canal en forme de V, 400 microlitres de solution sont récupérés depuis le canal, du côté distal du récipient, puis transférés dans un microtube de 1,5 microlitre à l’aide d’une pipette munie d’une pointe fine. Procéder à la précipitation alcoolique en ajoutant deux volumes d’éthanol absolu froid et en mélangeant au vortex. En outre, deux à trois microlitres de glycogène peuvent être ajoutés afin d’améliorer le rendement de récupération de l’ADN. Incuber les tubes classiques à –20 °C pendant une heure ou, de façon alternative, les conserver à cette température toute la nuit. Centrifuger à 4 °C à vitesse maximale pendant 25 minutes.

Ce surnageant cardiaque et le lavage en ajoutant un millilitre d'éthanol froid à 70 %, centrifuger à quatre degrés Celsius à vitesse maximale pendant cinq à dix minutes, éliminer le surnageant et laisser sécher à température ambiante avec les tubes en position inversée, redissoudre le culot dans 10 à 15 microlitres d'eau sans noyau et procéder à la détermination de la concentration de l'échantillon. Dans ce cas, l'échantillon purifié a été remis en suspension dans 10 microlitres d'eau et quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 260 nanomètres, montrant une concentration de 6,3 nanogrammes par microlitre, ce qui représente un rendement de 75 %. Vous pourriez penser qu'il serait préférable d'investir seulement 10 minutes de votre temps précieux avec un kit.

Cependant, malgré le temps consacré à ce processus, vous serez en mesure de contrôler de nombreuses variables qui vous permettront de purifier une gamme plus étendue d'échantillons, variés par leur taille et leur origine. Comme vous avez pu le constater dans le cas présent, une efficacité de 75 % a été observée, équivalente ou supérieure à celle de la plupart des kits de purification d'ADN. Merci de nous avoir rejoints aujourd'hui.

Nous espérons que vous avez trouvé ce protocole utile pour vos projets de recherche.