Name: Electroeluting fragments dADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Apprenez l'électroélution pour purifier des fragments d'ADN avec un rendement élevé jusqu'à 80 %. Cette méthode de biologie moléculaire permet de récupérer l'ADN à faible coût pour le clonage et le séquençage.

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Le travail dans Dr Bermudez de laboratoire a été financé par le CONACYT (Grant # 82622). Nous remercions Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Rodriguez Martinez et Ximena-Torres pour l&#39;enregistrement vidéo de la procédure electroleution.

<ol><li> Afin de sélectionner des fragments d'ADN d'intérêt d'être purifiés, ils devraient être résolus dans gels d'agarose ou d'acrylamide gel coloré au bromure d'éthidium par électrophorèse en utilisant un tampon TBE 0.5X (Tris borate EDTA) à 120 volts pendant 1 heure. Pour cela, ~ 700 ng de plasmide pProEx-GdMre11S (6000 pb) préalablement digéré par Ndel et HindIII a été utilisée pour libérer un fragment de 900 pb (560 ng d'ng de plasmide et 84 du fragment). </li><li> Le réservoir electroeluter (figure 1) doit être rempli avec TBE 0.5X également répartis de chaque côté du plateau de la mi prenant soin de ne pas le renverser sur le plateau de mi. </li><li> La bande choisie (ou bandes) est découpée du gel, et placé dans la chambre de l'échantillon le plus près possible de la chaîne V (une tranche par puits). Mémoire tampon d'exécution doit être ajouté à chaque chambre; juste assez pour couvrir la tranche de gel. </li><li> Chaque canal V utilisée doit être rincée avec une pipette Pasteur afin d'éliminer toute bulle d'air emprisonnée. </li><li> Puis 100 ul de 10 M d'acétate de NH 4 (pour faciliter la visualisation d'une petite quantité de bleu de bromophénol est ajouté, juste assez pour la couleur) sont délicatement ajouté à l'intérieur du canal V. </li><li> Le couvercle doit être fermé doucement pour éviter toute remise en suspension du coussin de sel. </li><li> Électroélution est commencée à 100 volts pendant 25 minutes. </li><li> Lorsque electrolution est terminée, 400 ul sont retirés de V-canal, et placé dans un tube de centrifugeuse pour être précipité avec 2 volumes d'éthanol froid et le glycogène (recommandé pour améliorer la récupération de l'ADN) à 4 ° C pendant 1 heure ou jusqu'au lendemain. </li><li> Centrifuger pendant 20 minutes, retirer le surnageant et laver avec de l'éthanol à 70%. </li><li> Tube sec et de quantifier l'ADN à une DO 260 nm. </li><li> La reprise a été obtenu 75% (63 ng récupérés lorsque 84 ng ont été placés sur le V-canal). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma Electroeluter. Anod une cathode sont indiqués sur chaque côté du réservoir, l'ADN contenu dans le gel en tranches (illustré par un carré noir) migrera vers la cathode en raison de sa charge négative. Ensuite, il sera piégé dans le coussin de sel (représenté comme un triangle inversé noir) situé dans le V-canal.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

La durée de la course dépendra fortement de la taille des fragments, des fragments normalement jusqu&#39;à 20 ko 50 minutes à 1 heure suffit, alors que pour de petits fragments lumière UV de surveillance toutes les 10 minutes est nécessaire pour empêcher le fragment de passer par la coussin de sel et par conséquent à la chambre tampon anodique diminue de récupération. Il est important de s&#39;assurer que lorsque vous définissez votre alimentation à 100 volts, il ya un mAmp actuelle moins de 10 ans. La bande d&#39;ADN peut être contrôlé en utilisant une lampe UV-main et de détecter quand cette abandonne la tranche de gel. Le sel de coussin peut également être faite avec 3 M acétate de Na. Cette procédure permet la purification de fragments d&#39;ADN ou d&#39;ARN de différentes tailles avec une bonne récupération (~ 80%) à être radiomarquée, digéré par les enzymes de restriction, traitées par des enzymes de modification, etc

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; acétate</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Biophotomètre</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>Électr&amp;#8211;filtrer</td><td>IBI</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

electroeluting fragments d&#39;adn

Electroeluting DNA Fragments

Fragments d&#39;ADN purifiés sont utilisés à différentes fins en biologie moléculaire et ils peuvent être préparés par plusieurs procédures. La plupart d&#39;entre eux nécessitent une électrophorèse précédente des fragments d&#39;ADN afin de séparer la bande d&#39;intérêt. Ensuite, cette bande est excisée à partir d&#39;un gel d&#39;agarose ou d&#39;acrylamide et purifiée en utilisant soit: la liaison et l&#39;élution des particules de verre ou de silice, DEAE-cellulose des membranes », écraser et faire tremper la méthode&quot;, électroélution ou très souvent coûteux kits de purification commerciales. Ainsi, en choisissant une méthode dépendra surtout de ce qui est disponible dans le laboratoire. La procédure électroélution permet de purifier l&#39;ADN très propre à être utilisé dans un grand nombre d&#39;applications (séquençage, radiomarquage, restriction enzymatique, la modification enzymatique, etc clonage). Cette procédure consiste à placer l&#39;ADN bande contenant les tranches d&#39;agarose ou d&#39;acrylamide dans les puits d&#39;échantillon de l&#39;electroeluter, puis appliqué actuellement fera le fragment d&#39;ADN à partir de l&#39;agarose et d&#39;être ainsi pris au piège dans un sel coussin pour être récupéré plus tard par précipitation à l&#39;éthanol.

Cette procédure permet la purification de fragments d&#39;ADN à haut rendement.

Electroeluting fragments d&#39;ADN

Les fragments d'ADN purifiés sont utilisés à diverses fins en biologie moléculaire et peuvent être préparés selon plusieurs procédures. La plupart d'entre elles nécessitent un ...

Bonjour. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment l'électroélution est réalisée afin de purifier des fragments d'ADN, tels que les produits de digestion ou de PCR. Pour des applications ultérieures comme le clonage ou le séquençage, l'électroélution peut constituer l'une des méthodes de choix. Fondée sur la charge électrique négative de l'ADN, une barrière cellulaire élevée est placée dans le champ électrique, retenant les fragments et empêchant leur migration ultérieure.Cette méthode permet la purification d'une large gamme de tailles de fragments d'ADN provenant de différentes sources, avec une efficacité relativement élevée pouvant atteindre 80 %. Son faible coût représente un autre avantage de l'électroélution par rapport à d'autres méthodes de purification telles que les colonnes ou les kits à base de résine, entre autres. L'échantillon d'ADN est d'abord visualisé par électrophorèse sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium, afin de visualiser et d'identifier le fragment souhaité à purifier, et l'électrophorèse doit alors être poursuivie.Lorsque les fragments sont bien séparés, les fragments de taille inférieure peuvent être précisément déterminés. Après électrophorèse, le fragment désiré est soigneusement excisé du gel à l'aide d'une lame de rasoir neuve, en prenant soin de découper la tranche de gel aussi près que possible de la bande d'intérêt.Cette procédure doit être réalisée avec une protection adéquate contre la lumière UV et en portant des gants. Après avoir rempli l'électrocuvette avec le tampon de migration approprié et pris soin de le répandre sur la surface du plateau central, le morceau de gel est placé à l'intérieur d'une des roues, aussi près que possible du canal en V. Il ne doit y avoir aucune bulle à l'intérieur du canal en V.Cela peut être évité en rinçant le canal avec du tampon pour éliminer tout air piégé. Ensuite, 100 microlitres de la barrière à haute teneur en sel sont ajoutés soigneusement au canal V à partir du site proximal du puits. La chambre est fermée et les électrodes sont reliées à la source d'alimentation pour commencer l'électrolyse à 100 à 120 volts.L'intervalle de temps dépendra de la taille du fragment pour les grands fragments allant jusqu'à 20 kpb. Entre 50 minutes et une heure devrait suffire, tandis que les petits fragments doivent être surveillés toutes les 10 minutes à l'aide d'une lumière UV afin d'éviter une élution supplémentaire à travers la solution saline et dans la chaîne tampon finale. Dans ce cas, nous avons digéré 560 nanogrammes de plasmide avec les enzymes ND1 et Entry pour libérer un fragment de 900 paires de bases, équivalent à 84 nanogrammes d'échantillon.Par conséquent, après avoir placé le morceau de gel dans le puits, l'électroélution se déroule pendant 25 minutes à 100 volts. Une fois l'électroélution terminée et les fragments d'ADN piégés dans le coussin sud du canal en forme de V, 400 microlitres de solution sont récupérés depuis le canal, du côté distal du récipient, puis transférés dans un microtube de 1,5 microlitre à l’aide d’une pipette munie d’une pointe fine. Procéder à la précipitation alcoolique en ajoutant deux volumes d’éthanol absolu froid et en mélangeant au vortex. En outre, deux à trois microlitres de glycogène peuvent être ajoutés afin d’améliorer le rendement de récupération de l’ADN. Incuber les tubes classiques à –20 °C pendant une heure ou, de façon alternative, les conserver à cette température toute la nuit. Centrifuger à 4 °C à vitesse maximale pendant 25 minutes.Ce surnageant cardiaque et le lavage en ajoutant un millilitre d'éthanol froid à 70 %, centrifuger à quatre degrés Celsius à vitesse maximale pendant cinq à dix minutes, éliminer le surnageant et laisser sécher à température ambiante avec les tubes en position inversée, redissoudre le culot dans 10 à 15 microlitres d'eau sans noyau et procéder à la détermination de la concentration de l'échantillon. Dans ce cas, l'échantillon purifié a été remis en suspension dans 10 microlitres d'eau et quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 260 nanomètres, montrant une concentration de 6,3 nanogrammes par microlitre, ce qui représente un rendement de 75 %. Vous pourriez penser qu'il serait préférable d'investir seulement 10 minutes de votre temps précieux avec un kit.Cependant, malgré le temps consacré à ce processus, vous serez en mesure de contrôler de nombreuses variables qui vous permettront de purifier une gamme plus étendue d'échantillons, variés par leur taille et leur origine. Comme vous avez pu le constater dans le cas présent, une efficacité de 75 % a été observée, équivalente ou supérieure à celle de la plupart des kits de purification d'ADN. Merci de nous avoir rejoints aujourd'hui.Nous espérons que vous avez trouvé ce protocole utile pour vos projets de recherche.

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La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

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Apprenez l'électroélution pour purifier des fragments d'ADN avec un rendement élevé jusqu'à 80 %. Cette méthode de biologie moléculaire permet de récupérer l'ADN à faible coût pour le clonage et le séquençage.

Electroeluting fragments d'ADN

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