Analyse directe des cellules isolées par spectrométrie de masse à la pression atmosphérique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'expulser le contenu d'une seule cellule vivante et d'ioniser les biomolécules libérées pour une analyse par spectrométrie de masse à pression atmosphérique. Cette opération est réalisée en sélectionnant une cellule unique à l'aide d'un microscope à longue distance et en ablantant la cellule sélectionnée à l'aide d'une impulsion laser de longueur d'onde 2,94 micromètre délivrée par une fibre optique pointue. L'ablation d'une cellule unique entraîne la formation d'un panache microscopique de matière particulaire neutre destiné à ioniser le panache d'ablation.

Il est intercepté par un électrospray. Les gouttelettes chargées provenant de l'électrospray fusionnent avec les particules du panache d'ablation issu de la cellule. Les gouttelettes résultantes sont enrichies en molécules provenant de la cellule et génèrent les ions correspondants.

Des résultats sont obtenus, montrant un spectre de masse provenant d'une seule cellule. Le spectre contient de nombreux pics liés aux métabolites et aux lipides de la cellule. Bonjour, je suis le Dr. Bin Drester du laboratoire Verese, du département de chimie de l'Université George Washington.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter la procédure d'analyse directe de cellules vivantes uniques par spectrométrie de masse à pression atmosphérique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les métabolites et les lipides provenant de cellules végétales et animales isolées. Commençons donc.

L'ablation par laser pour l'ablation laser, l'ionisation par électrospray, la spectrométrie de masse ou la spectrométrie de masse dite « lazy MS » est produite par une impulsion laser de cinq nanosecondes à une longueur d'onde de 2,94 micromètres. Un oscillateur optique paramétrique accordable, piloté par un laser au néodyme YAG, est utilisé pour l'ablation dans cette étude.

Pour commencer, fixez l'extrémité gravée d'une fibre optique sur un micromanipulateur et approchez-la de la surface de la cellule. Pour un dépôt d'énergie efficace, tenez l'extrémité non gravée de la fibre optique à l'aide d'un mandrin pour fibre nue afin d'assurer l'alignement optique. Le mandrin est monté sur un translateur à cinq axes.

Injectez l'énergie laser dans la fibre en focalisant le faisceau à l'aide d'une lentille plan-convexe en fluorure de calcium, en sélénure de zinc revêtue anti-reflet ou similaire, sur son extrémité non gravée ; utilisez des miroirs en or protégés pour diriger le faisceau laser infrarouge moyen vers la lentille de focalisation. Pour maintenir la distance entre la pointe effilée de la fibre et la surface cellulaire, employez un microscope vidéo à longue distance monté selon un angle de 15 à 30 degrés mesuré par rapport à la surface. Ce système comprend également une lentille objectif de cinq fois, corrigée à l'infini, équipée d'une caméra CCD pour la surveillance et la capture d'images.

Un deuxième microscope vidéo est monté perpendiculairement à la surface de l'échantillon afin de visualiser les cellules par le haut et de les sélectionner pour l'analyse. Ce système fournit un retour visuel permettant d'aligner la pointe de la fibre au-dessus de la cellule sélectionnée pour l'ablation et l'analyse. Il se compose d'un objectif zoom de précision sept fois, équipé d'un objectif longue distance corrigé à l'infini de 10 fois et d'une caméra CCD.

Le système d'électrospray a été construit à l'aide d'un raccord métallique conducteur en perfluoro, d'embouts élastomères, de raccords, de tubes, d'un port d'aiguille à manchon, ainsi que de tubes en silice FU. L'émetteur recommandé est en acier inoxydable et possède une pointe effilée d'un diamètre de 50 micromètres ; préparez une solution de méthanol à 50 % contenant de l'acide acétique à 0,1 % pour l'électrospray. Faites circuler la solution à un débit de 200 à 300 nanolitres par minute à l'aide d'une pompe à seringue.

À l’aide d’une seringue de 500 microlitres, une haute tension comprise entre 2 et 803 000 volts sera appliquée à l’emboîtement métallique par une alimentation électrique régulée. Pour générer un électrospray stable, veillez à ce que toutes les connexions électriques soient sécurisées et protégées par un blindage, correctement mis à la terre, car un contact direct avec une haute tension exposée peut provoquer un choc électrique. Obtenez l’échantillon de tissu ou de cellules vivantes auprès d’une source appropriée et conservez-les conformément aux recommandations avant l’analyse.

Les bulbes d'allium pour cette démonstration ont été achetés dans un magasin local pour la préparation de l'échantillon de bulbe d'allium. Couper longitudinalement le bulbe à l’aide d’un scalpel chirurgical, en prélevant une section d’environ deux centimètres carrés du tissu de l’écaillle d’oignon. Ensuite, détacher une monocouche intacte du tissu épidermique interne. Utiliser la surface humide de l’épiderme pour monter le tissu sur une lame de microscope en verre préalablement nettoyée.

Tenez la lame à l’aide d’un support universel pour plaques, monté sur un dispositif de translation à trois axes pour le positionnement. Acquérez immédiatement après le montage de l’échantillon les spectres de masse afin d’éviter la dégradation des cellules. Commencez par allumer le laser, l’ionisation par électrospray et le spectromètre de masse.

Optimisez la géométrie de la source d'ions par ajustement de la position du point d'ablation et de l'émetteur électrospray l'un par rapport à l'autre et par rapport à l'orifice du spectromètre de masse. Pour obtenir une intensité ionique maximale, sélectionnez la cellule d'intérêt à analyser à l'aide du système de visualisation en vue supérieure. Après sélection, déplacez la platine d'échantillon pour amener la cellule sélectionnée directement sous l'extrémité effilée de la fibre optique.

À l’aide du microscope de vue latérale, réajuster la distance entre la pointe et la surface de la cellule à environ 20 microns. Une fois en position correcte, appliquer des impulsions laser sur la cellule sélectionnée par l’intermédiaire de la pointe de fibre gravée. Cela entraîne la perforation de la paroi cellulaire et l’éjection du cytoplasme sous forme de matière particulaire.

Après ionisation postérieure par électrospray, les ions produits sont collectés par le spectromètre de masse et les spectres de masse sont enregistrés. Une fois l'acquisition des données terminée, placez le laser, l'électrospray et le spectromètre de masse en mode veille ou éteignez-les. Conservez l'échantillon de tissu d'allium cper ablété pour une observation facultative en microscopie optique ; l'ablation réussie d'une cellule unique se traduit par la rupture de la paroi cellulaire et l'acquisition d'un spectre de masse paresseux.

Voici les résultats de l'analyse MS paresseuse d'une cellule épidermique unique incluse dans un bulbe d'Allium SEPA, montrant une image représentative en microscopie optique. Après l'échantillonnage d'une cellule, la paroi cellulaire est perforée et l'étendue de la perforation est limitée par les frontières avec les cellules voisines. Les cellules adjacentes semblent intactes.

Ici, un spectre de masse lazy représentatif produit à partir de la cellule est présenté. Une grande variété d'ions est détectée dans l'allium sea par cellule, et en fonction de leurs masses exactes, de leurs profils de distribution isotopique et de leurs spectres de masse en tandem, les ions sont soigneusement attribués à des métabolites endogènes. Les ions détectés à partir d'une seule cellule étaient similaires à ceux observés lors de l'analyse du même tissu par spectrométrie de masse lazy conventionnelle réalisée sur plusieurs cellules.

Nous venons de vous montrer comment analyser des cellules vivantes individuelles par spectrométrie de masse à pression atmosphérique. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de porter des lunettes de protection afin d'éviter toute exposition accidentelle aux lasers infrarouges de classe quatre. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.