Imagerie interactions protéine-protéine In vivo

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer la présence d’interactions protéiques à la surface de la cellule. Ceci est réalisé en clonant deux récepteurs d’intérêt, un myoterminal à deux fluorophores qui ont une émission et des spectres qui se chevauchent dans un deuxième temps. Les deux vecteurs sont simultanément transfectés dans des cellules endothéliales pour l’expression des récepteurs.

À ce stade, les fluorophores aident à évaluer l’étendue globale de l’expression ainsi que la localisation des récepteurs. Ensuite, les paramètres d’imagerie sont établis à l’aide d’un seul transfect comme contrôle sur le microscope confocal. Individuellement, les cellules transfectées sont sélectionnées en fonction de leurs niveaux relatifs d’expression et de localisation des récepteurs.

Les régions à l’intérieur de ces cellules sont ensuite imagées afin d’évaluer l’étendue des résultats de fret obtenus. Cela montre des interactions de liaison un et de deux à la surface de la cellule endothéliale basée sur la microscopie libre et confocale. Bonjour, je suis Tom Seger du laboratoire du Dr William Barton au Département de biochimie et de biologie moléculaire de l’Université du Commonwealth de Virginie.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’évaluation des interactions protéique dans les cellules endothéliales par une microscopie confocale basée sur Fret. Dans notre laboratoire, nous l’utilisons pour étudier les interactions entre les récepteurs pendant l’angiogenèse. Alors commençons.

Pour imager les interactions protéine-protéine à l’aide d’un test de proximité basé sur les frettes, commencez par cloner vos récepteurs d’intérêt dans les sites NHE un eco R one du pcd, un vecteur 3.1 hydro ou neo contenant des CFP monomères ou YFP. La détermination de la frette est empirique et dépend de manière critique de la longueur de l’agent de liaison entre la région transmembranaire et le début du fluor. Par conséquent, plusieurs liens différents de linker doivent être explorés pour chaque nouvelle paire de récepteurs. En cours d’investigation, transformer et amplifier les vecteurs selon le protocole d’accompagnement.

Préparez ensuite l’ADN de qualité transfection, transformez et amplifiez les vecteurs selon le protocole d’accompagnement. Ensuite, préparez l’ADN de qualité transfection et diluez-le à une concentration de travail d’un microgramme par microlitre pour préparer les cellules à la transfection sous une hotte de culture tissulaire divisée EAHY 92 6 cellules cultivées en DMEM complet en croûte de couverture de 35 millimètres de boîtes avec deux millilitres de milieu. Préparez une boîte pour évaluer l’expression de chaque récepteur individuel ainsi qu’une boîte pour chaque paire de récepteurs.

Laissez les cellules incuber plus de 95 % d’atmosphère de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius le lendemain. La culture doit être d’environ 70 à 90 % de confluence le jour de la transfection. Préparez des complexes de lipides nucléologiques en mélangeant deux microgrammes d’ADN du vecteur récepteur chimérique avec huit microlitres de Fuji N HD dans 200 microlitres de préchauffage optimal pour les paires de récepteurs transfecteurs avec un microgramme de chaque récepteur pour un total de deux microgrammes mélangés doucement par inversion et incubez-le à température ambiante pendant 30 minutes.

Pendant la période d’incubation, préparez les cellules pour la transfection, aspirez les milieux frais et lavez chaque plaque doucement et brièvement avec du PBS chaud avant d’ajouter deux millilitres de DMEM complet d’avant-guerre sans antibiotiques. Il est important d’éviter la présence de pénicilline et de streptomycine car elles sont considérablement plus toxiques pour les cellules pendant le traitement Avec le gène FU HD au complexe goutte à goutte vers les cellules et incuber pendant 20 à 24 heures supplémentaires. Après 24 heures, aspirez soigneusement le milieu des cellules et pipetez du DMEM complet frais avec des antibiotiques après la transfection.

La viabilité cellulaire devrait rester relativement élevée. Peu ou pas de cellules flottantes doivent être observées. Pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes, nous utilisons un microscope confocal à balayage laser A-T-C-S-P deux A OBS équipé de lasers à diode bleue argon et de lasers à hélium néon verts, orange et rouges, un H-C-X-P-I-A-O 63 x 1,3 NA à immersion, une platine XY motorisée et un incubateur de platine contrôlé en température, humidité et dioxyde de carbone.

Des contrôles expérimentaux sont essentiels pour éliminer la diaphonie du fluor entre les canaux d’émission ainsi que pour évaluer les problèmes d’expression et la quatrième isation du fluor non spécifique. En tant que tel, un seul transfect fluoro quatre est utilisé pour configurer chaque session d’image afin d’éliminer la diaphonie entre les canaux d’émission pour CFP et YFP. Placez la commande d’expression CFP dans l’incubateur de scène à l’aide d’une lumière blanche.

Ajustez la plaque Z pour faire la mise au point sur les cellules. Réglez les paramètres de la fenêtre SP pour la détection des émissions de CFP à 465 à 505 et YFP à 525 à 600 nanomètres tout en surveillant les deux canaux d’émission pour exciter le CFP à 458 nanomètres. À l’aide de l’OTF, réglez la puissance du laser pour éliminer le débordement appréciable de CFP dans le canal d’émission YFP.

Enregistrez ce paramètre. Effectuez le même contrôle pour la diaphonie YFP dans le canal CFP en ajustant la puissance d’excitation à 514 nanomètres. Les cellules exprimant uniquement YFP enregistrent ce paramètre.

Ensuite, les cellules coex-exprimant CFP et YFP dans l’incubateur de stade. Utilisation du réglage de séquence pour le logiciel confocal LICO. Localisez les cellules exprimant des niveaux similaires de CFP et de YFP avec une localisation membranaire appropriée à l’aide du logiciel LICO, à l’exception d’un programme de photoblanchiment de l’accepteur.

Définissez les paramètres du donateur et de l’accepteur sur vos paramètres CFP et YFP enregistrés, respectivement. En zoomant sur la cellule, mettez en évidence une région d’intérêt ou un retour d’intérêt dans lequel la photodestruction de YFP doit se produire sur la membrane cellulaire et commencez le programme de photodestruction de l’accepteur. Ajustez l’OTF A à 100 % de 514 nanomètres et laissez le blanchiment au laser se poursuivre jusqu’à ce que 70 % de l’émission YFP ait été épuisée.

Pour accélérer le blanchiment, les zones d’intérêt sont généralement choisies dans l’axe matriciel du laser pendant le photoblanchiment. Surveiller le mouvement cellulaire et rejeter les mesures obtenues avec un mouvement appréciable dans le plan XY. Comme ces mesures peuvent rapporter des efficacités de frettes fausses, des images avant et après le blanchiment sont enregistrées pour le donneur et l’accepteur et l’efficacité de la frette est calculée comme étant égale à l’efficacité de l’affrètement est égale à l’ouverture du poteau parent moins les parenthèses DLO divisée par le poste pour tous les postes supérieurs à D pre où D, pre et D post sont respectivement les intensités du donneur avant et après le photoblanchiment.

JMP est utilisé pour déterminer l’étendue de la variabilité expérimentale. Les récepteurs individuels doivent être fusionnés à la fois à CFP et YFP avec des longueurs variables de séquence membranaire juxta. Pour identifier la meilleure paire possible de partenaires de frettes récepteurs, l’efficacité de la transfection se situe généralement entre 30 et 40 %, malgré les découvertes précédentes d’autres personnes.

Nous n’avons pas vu que la transfection et l’expression d’un vecteur favorisent celles de l’autre. En effet, on observe fréquemment l’expression exclusive d’une flore, miroir à quatre KY ou l’autre. Ces images représentatives montrent une analyse de photoblanchiment de l’accepteur de frette entre CFP et YFP dans une cellule EAHY 9 26.

Les canaux d’émission CFP et YFP ont été surveillés séparément avant et après le photoblanchiment, le photoblanchiment et les calculs ont été limités à la région. Dans la boîte rouge, l’efficacité des frettes est affichée sous la forme d’une plage absolue allant du rouge coloré élevé à 1,0 au violet de couleur basse à zéro sur une superposition agrandie d’image fusionnée A-C-F-P-Y-F-P à des fins d’orientation uniquement pour le système récepteur T. Les valeurs typiques d’efficacité de frette sont de 20 à 28 % pour les cellules épithéliales et de 19 à 23 % pour les cellules endothéliales, comme indiqué ici.

Ainsi, une fois maîtrisée, cette technique prendra généralement trois à quatre jours si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la longueur de l’agent de liaison entre votre protéine cible et la protéine fluorescente de fusion, ainsi que leurs niveaux d’expression et leur mouvement cellulaire affectent directement la mesure de la frette après leur procédure. De plus, des tests biochimiques concernant l’activation du signal peuvent être effectués afin de mieux comprendre les voies de transduction du signal après son développement.

Cette technique permet d’étudier les interactions protéiques faibles ou transitoires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer vos propres tests de proximité basés sur les frettes et les cellules vivantes. Et n’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec des cellules en culture tissulaire, des précautions de sécurité appropriées doivent toujours être suivies.

Alors merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos futures expériences sur les frettes.