Imagerie interactions protéine-protéine In vivo

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer la présence d'interactions entre protéines à la surface cellulaire. Cette évaluation est réalisée en clonant deux récepteurs d'intérêt, chacun en fusion à l'extrémité N-terminale avec deux fluorophores dont les spectres d'émission se chevauchent, lors d'une deuxième étape. Les deux vecteurs sont ensuite transfectés simultanément dans des cellules endothéliales afin d'assurer l'expression des récepteurs.

À ce stade, les fluorophores aident à évaluer l'ampleur globale de l'expression ainsi que la localisation du récepteur. Ensuite, les paramètres d'imagerie sont établis à l'aide d'une transfection simple comme témoin sur le microscope confocal. Les cellules transfectées individuellement sont sélectionnées en fonction de leurs niveaux relatifs d'expression et de localisation du récepteur.

Des régions au sein de ces cellules sont ensuite imagées afin d'évaluer l'ampleur des résultats de transfert d'énergie par résonance de type FRET, qui montrent des interactions de type tie one et tie two à la surface des cellules endothéliales, basées sur la microscopie FRET et la microscopie confocale. Bonjour, je suis Tom Seger du laboratoire du Dr. William Barton du Département de biochimie et biologie moléculaire de l'Université de Virginie du Commonwealth.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'évaluer les interactions entre protéines dans les cellules endothéliales à l'aide d'une microscopie confocale basée sur la FRET. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette méthode pour étudier les interactions entre récepteurs durant l'angiogenèse. Commençons donc.

Pour imager des interactions entre protéines à l'aide d'un test d'approche basé sur la FRET, commencez par cloner vos récepteurs d'intérêt dans les sites NHE I et EcoR I du vecteur pcd, a 3.1 hydro ou neo contenant du CFP ou du YFP monomérique. La détermination de la FRET est empirique et dépend fortement de la longueur du linker entre la région transmembranaire et le début du fluorophore. Par conséquent, plusieurs longueurs de linker différentes doivent être explorées pour chaque nouvelle paire de récepteurs étudiée. Transformez et amplifiez les vecteurs selon le protocole fourni.

Ensuite, préparez de l'ADN de qualité transfection, transformez et amplifiez les vecteurs selon le protocole fourni. Préparez ensuite de l'ADN de qualité transfection et diluez-le à une concentration de travail d'un microgramme par microlitre afin de préparer les cellules pour la transfection sous une hotte de culture tissulaire. Répartissez les cellules EAHY 926 cultivées dans du DMEM complet dans des boîtes de 35 millimètres contenant des lamelles, avec deux millilitres de milieu. Préparez une boîte pour évaluer l'expression de chaque récepteur individuel, ainsi qu'une boîte pour chaque paire de récepteurs.

Laisser les cellules incuber dans une atmosphère contenant plus de 95 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius le jour suivant. La culture devrait présenter une confluence d'environ 70 à 90 % le jour de la transfection. Préparer les complexes nucléolipidiques en mélangeant deux microgrammes d'ADN du vecteur du récepteur chimérique avec huit microlitres de Fuji N HD dans 200 microlitres d'Opti-MEM préchauffé ; pour les paires de récepteurs, transfecter avec un microgramme de chaque récepteur, soit un total de deux microgrammes, en mélangeant doucement par retournement et en incubant à température ambiante pendant 30 minutes.

Pendant la période d'incubation, préparez les cellules pour la transfection en aspirant le milieu frais et en lavant chaque plaque doucement et brièvement avec du PBS chaud avant d'ajouter deux millilitres de DMEM complet préchauffé sans antibiotiques. Il est important d'éviter la présence de pénicilline et de streptomycine, car elles sont nettement plus toxiques pour les cellules pendant le traitement. Ajoutez goutte à goutte le complexe contenant le gène FU aux cellules et incubez-les pendant 20 à 24 heures supplémentaires. Après 24 heures, aspirez soigneusement le milieu des cellules et ajoutez du DMEM complet frais contenant des antibiotiques suite à la transfection.

La viabilité cellulaire devrait rester relativement élevée. Peu, voire aucune cellule en suspension, ne devrait être observée. Pour réaliser l'imagerie de cellules vivantes, nous utilisons un microscope confocal à balayage laser A-T-C-S-P two A OBS équipé de lasers à diode bleue, argon, et de lasers hélium-néon verts, oranges et rouges, d'un objectif H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA à immersion en glycérine, d'une platine motorisée XY et d'un incubateur de platine contrôlant la température, l'humidité et la concentration en dioxyde de carbone.

Les contrôles expérimentaux sont essentiels pour éliminer les interférences entre les canaux d'émission ainsi que pour évaluer les problèmes d'expression et la fixation non spécifique du fluorophore. Ainsi, des transfections uniques avec un fluorophore sont utilisées pour configurer chaque séance d'imagerie afin d'éliminer les interférences entre les canaux d'émission du CFP et du YFP. Placer le contrôle d'expression du CFP dans l'incubateur de microscope en utilisant la lumière blanche.

Régler la plaque Z pour focaliser sur les cellules. Configurer les paramètres de la fenêtre SP pour la détection d'émission du CFP entre 465 et 505 nm et du YFP entre 525 et 600 nm, tout en surveillant les deux canaux d'émission, puis exciter le CFP à 458 nanomètres. À l'aide du mode A OTF, régler la puissance du laser afin d'éliminer tout phénomène notable de recouvrement du CFP dans le canal d'émission du YFP.

Enregistrez ce paramètre. Effectuez le même contrôle pour la fuite spectrale de YFP dans le canal CFP en ajustant la puissance d'excitation à 514 nanomètres. Pour les cellules exprimant uniquement YFP, enregistrez ce paramètre.

Ensuite, placez les cellules coexprimant CFP et YFP dans l'incubateur de la platine. À l'aide du paramètre de séquence du logiciel confocal LICO, repérez les cellules exprimant des niveaux similaires de CFP et de YFP avec une bonne localisation membranaire en utilisant le logiciel LICO, à l'exception d'un programme logiciel d'accepteur de photobléaching.

Définissez les paramètres du donneur et de l'accepteur selon vos réglages CFP et YFP enregistrés, respectivement. En zoomant sur la cellule, délimitez une région d’intérêt (ROI) où la photo-détruction du YFP doit avoir lieu sur la membrane cellulaire, puis démarrez le programme de photo-détruction de l’accepteur. Réglez l’A OTF à 100 % de 514 nanomètres et laissez le blanchiment laser se poursuivre jusqu’à ce que 70 % de l’émission du YFP soit épuisée.

Pour accélérer la photodestruction, les zones d'intérêt (ROIs) sont généralement choisies selon l'axe de balayage du laser pendant la photodestruction. Surveillez le mouvement cellulaire et rejetez les mesures obtenues en cas de déplacement appréciable dans le plan XY. Comme ces mesures peuvent indiquer des efficacités de transfert d'énergie par résonance de type FRET erronées, des images avant et après la photodestruction sont enregistrées pour le donneur et l'accepteur, et l'efficacité du FRET est calculée selon la formule : efficacité du FRET = (DLO post-parent ouvert – DLO entre parenthèses) / Dpost, pour toutes les valeurs de Dpost supérieures à Dpré, où Dpré et Dpost représentent respectivement les intensités du donneur avant et après la photodestruction.

JMP est utilisé pour déterminer le degré de variabilité expérimentale. Les récepteurs individuels doivent être fusionnés à la fois au CFP et au YFP avec des longueurs variables de séquence juxtamembranaire. Pour identifier la meilleure paire possible de partenaires FRET parmi les récepteurs, les rendements de transfection se situent généralement entre 30 et 40 %, malgré des résultats antérieurs obtenus par d'autres chercheurs.

Nous n'avons pas observé que la transfection et l'expression d'un vecteur favorisent celle de l'autre. En effet, nous observons fréquemment une expression exclusive d'une flore, soit le miroir KY, soit l'autre. Ces images représentatives montrent une analyse par photobléachage de l'accepteur du transfert d'énergie par résonance (FRET) entre CFP et YFP dans une cellule EAHY 926.

Les canaux d'émission de CFP et de YFP ont été surveillés séparément avant et après le photoblanchiment, et les calculs ont été restreints à la région. À l'intérieur du cadre rouge, l'efficacité de transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET) est affichée selon une échelle absolue allant du rouge foncé élevé à 1,0 au violet faible à zéro, sur une superposition agrandie de l'image fusionnée A-C-F-P-Y-F-P à titre indicatif uniquement pour le système du récepteur T. Les valeurs typiques d'efficacité FRET sont de 20 à 28 % pour les cellules épithéliales et de 19 à 23 % pour les cellules endothéliales, comme illustré ici.

Une fois maîtrisée, cette technique prend généralement de trois à quatre jours si elle est correctement réalisée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l’esprit que la longueur du linker entre la protéine cible et la protéine fluorescente de fusion, ainsi que leurs niveaux d’expression et leur mobilité cellulaire, influencent directement la mesure de transfert d’énergie par résonance (FRET) après leur mise en œuvre. En outre, des dosages biochimiques relatifs à l’activation du signal peuvent être réalisés afin d’obtenir des informations sur les voies de transduction du signal après leur développement.

Cette technique fournit un test permettant d'étudier les interactions entre protéines qui sont soit faibles, soit transitoires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser vos propres tests de proximité basés sur la FRET dans des cellules vivantes. Et n'oubliez pas que lors de la manipulation de cellules en culture tissulaire, des précautions de sécurité appropriées doivent toujours être respectées.

Merci donc d'avoir regardé et bonne chance avec vos futures expériences de fret.