Name: Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications dimagerie et de microchirurgie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Apprenez la culture ex-ovo d'embryons de poulet pour l'étude de l'embryogenèse aviaire. Cette méthode permet l'imagerie, la microinjection et la microchirurgie avec accès optique complet.

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1. Protocole Culture Ex-ovo: <ol><li> Incuber les œufs de poule fécondés <ol class="lroman"><li> Œufs de poule fécondés peuvent être stockées à 13 ° C jusqu'à 5 jours avant l'incubation sans initier le développement. Un refroidisseur de vin rouge peut maintenir cette température. </li><li> Incuber les œufs côté émoussé dans un 60% d'humidité constant incubateur avec bascule en continu à 37,5 ° C pendant 72 heures. </li></ol></li><li> Préparer hamacs (figure 1a) <ol class="lroman"><li> Remplir aux ¾ de 9 oz gobelets en plastique avec de l'eau stérile chaude. Un habitué 9 oz coupe a un diamètre de 8 cm de haut. Nous avons constaté que cette taille était le plus approprié pour une application à long temps de culture présentées ici. </li><li> Coupez environ 20 cm s'accrocher envelopper. Apposez circonférentiellement sur le dessus de la tasse en plaçant une bande élastique autour. Plastique doivent être répartis sur le dessus de l'eau. Coupez le plastique excédentaire autour de la bande. Nous avons trouvé s'accrocher envelopper d'être le plus approprié pour cette application car elle empêche l'adhérence du jaune, ce qui entraîne la scission jaune pendant le transport. </li><li> Essuyez le plastique avec Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc) mouillé avec 70% d'éthanol. </li></ol></li><li> Retirer les oeufs de l'incubateur après 72 heures d'incubation. </li><li> Stériliser les œufs en essuyant la surface avec 70% d'éthanol Kimwipes mouillée. </li><li> Poser les oeufs à l'horizontale pendant 1-2 minutes pour le bon positionnement de l'embryon (figure 1b). Un carton d'œufs peuvent être utilisés pour la ponte à l'horizontale. Embryons tournera vers le haut après 1-2 minutes. </li><li> Transfert des embryons sur des hamacs de façon aseptique dans une hotte à flux laminaire. <ol class="lroman"><li> L'utilisation d'un bord tranchant (comme le bord d'un seau en métal ou un récipient en verre), appuyez doucement jusqu'à ce que l'œuf il ya une petite dent sur la partie inférieure de l'œuf (figure 1c). Rappelez-vous, l'embryon est placé sur la face supérieure. </li><li> Mettez les pouces dans les côtés opposés de la dent et tirer des obus en dehors horizontalement (figure 1d). </li><li> Placer le jaune d'oeuf avec l'embryon ainsi que l'albumine sur le hamac (figure 1E). L'albumine va fournir un environnement d'amortissement autour du jaune pour absorber les chocs induits par le déplacement du système aussi bien qu'il fournit la nutrition de l'embryon pour des pratiques de culture longue. L'eau sous le hamac d'assurer l'embryon va rester parallèle au sol pendant le transport et servir de conducteur de chaleur lors de l'imagerie si un réchauffeur de circulation d'eau est utilisé. </li><li> L'embryon doit déjà être placé sur le dessus si le transfert est effectué correctement. Si non, utiliser un flou, objet stérile (ie. bout émoussé des ciseaux courbes fermées) et caresse le jaune directionnelle tels que l'embryon tourne vers le haut. </li><li> Placer un diamètre de 10 cm boîte de Petri sur le dessus de la tasse pour sceller l'embryon. </li></ol></li><li> Placer la tasse de la culture dans l'incubateur réglé à 37,5 ° C. Si un incubateur portable est utilisé, placer 1 à 2 sept tasses oz rempli d'eau distillée maintient l'humidité à ~ 60% (figure 1f). </li><li> Si les embryons en culture au-delà de 7 jours embryonnaire, des morceaux coquille écrasée devrait être disséminés sur le pourtour de l'embryon comme une source de calcium pour le développement des os et de la maturation. </li></ol> Les équipements accessoires pour l'extérieur incubateur d'imagerie / manipulation: Un bain d'eau circulant dans la maison a été construite pour maintenir les températures d'incubation tout en imagerie ou de manipulation (figure 3). Un bain d'eau qui peuvent tenir la tasse est connecté via un tube de taille appropriée pour un réservoir d'eau. Un chauffage à résistance chauffe l'eau dans le réservoir qui est réglementé manuellement en suivant la température de l'eau. Une pompe à eau fait circuler l'eau. La représentation picturale illustre la facilité d'imagerie par ultrasongraphy / microscopie florescent (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Préparation du hamac et le transfert d'embryons de poulet aux hamacs. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les résultats représentatifs -. Différents embryons de poulet stade adulte moyen technique de culture in ovo ex embryons de HH 17 et suivants peuvent être cultivées par cette technique. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Schéma et photos représentant du système de circulation de l'eau utilisée en conjonction avec le système de culture ex-ovo de garder les embryons à la température idéale de développement. 2. Les demandes sélectionnées: Microinjection I. Cette culture de l'embryon est adapté pour des applications où les solutions de micro-injection doivent être injectés au système vasculaire de l'imagerie de contraste à base (c.-à-microscopie à fluorescence, la micro-topographie, etc calculé) (figure 4). Ci-dessous est le protocole de micro-injection: <ol><li> Préparer le Appara d'injectionTus <ol class="lroman"><li> Mode tiré 0,75 tubes en verre ID capillaire dans les micro-aiguilles embout biseauté en utilisant un microforge. Taille de la pointe requis dépend de la veine cible de diamètre / débit désiré. </li><li> Raccorder la seringue à 0,03 tube de silicone ID pouces. </li><li> Chargez le tube avec la solution à injecter et à connecter le micro-aiguille à la tubulure. </li><li> Placez le micro-aiguille sur le micromanipulateur et une seringue pour porte-seringue ou une pompe à seringue. </li></ol></li><li> Ajouter de l'eau stérile dans la tasse à augmenter ainsi l'embryon. Nous avons connu que pour une bonne pénétration de l'aiguille dans un vaisseau sanguin (ie. navire vitelline), la pénétration horizontale est nécessaire. Cela nécessite l'embryon d'être sur le même plan que les bords de la tasse. <ol class="lroman"><li> Sortez la bande de caoutchouc tenant le plastique sous l'embryon. </li><li> Soulever un côté de la plastique doucement et ajouter de l'eau stérile pour la tasse. </li><li> Fixez la bande de caoutchouc sur le plastique de nouveau. </li></ol></li><li> Injecter la solution à un navire embryonnaire. Dans notre expérience, quand la solution est injectée à un navire vitelline, micro-aiguilles nécessaires pour être dimensionnée e environ 1 / 10 du diamètre du vaisseau pour maintenir la perfusion efficace sans causer des saignements. <ol class="lroman"><li> Pomper la solution à la micro-aiguille assurant pas de formation de bulles d'air. </li><li> Aligner l'extrémité de la micro-aiguille sur le navire sélectionné. Pour vaisseaux vitellins, en sélectionnant une zone de fourche donnera superficie maximale de pénétrer dans le navire. </li><li> Poussez l'aiguille vers le navire. Le navire va d'abord se rétracter. Une fois que l'aiguille pénètre, commencer la perfusion. La couleur du sang qui coule devrait changer avec la perfusion. Si le changement de couleur ne se voit pas, l'aiguille peut avoir pénétré dans le navire. Dans ce cas, lentement se rétractent la micro-aiguille de pompage tout en solution jusqu'à changer de couleur dans le vaisseau est vu. Une fois la perfusion terminée, retirer la micro-aiguille hors du navire. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: microinjection d'un colorant fluorescent dans le système vasculaire de l'embryon ex-ovo-chiches cultivés. II. Procédure microchirurgicale - Gauche Ligature auriculaire Cette configuration de la culture ex-ovo est idéale pour réaliser des applications chirurgicales pour les embryons de poulet car elle offre une accessibilité totale à l'embryon. Voici le protocole d'une technique par exemple, a quitté la ligature auriculaire (LAL) (figure 5). La procédure est réalisée environ 24 heures dans la période de culture (HH24): <ol><li> Préparer pronation noeuds ~ 0,5 mm de diamètre à l'aide de suture en nylon 10-0 chirurgicale. </li><li> Avec une pince fine, localement enlever les membranes choriales et allantoïdien sur l'embryon et soulever l'embryon de l'arrière pour faire pivoter verticalement de telle sorte que c'est le côté gauche de l'embryon est visible. </li><li> En utilisant une pince fine, enlevez le péricarde sur l'atrium gauche. </li><li> Alignez les noeuds sur l'oreillette gauche et le serrer. Le nœud doit être lié de manière à interdire ~ 75% de la circulation sanguine d'origine pour le côté gauche. Couper les bords du noeud avec microciseaux et retirez et jetez de suture excès. </li><li> Tournez l'embryon revenir à son orientation d'origine (à droite sur le dessus). </li><li> Contrôle Sham impliquera la même procédure mais la suture sera juste passé à travers et non liées. L'efficacité du traitement du labo (75% de constriction) sera confirmée à 24 heures post-chirurgie, et les embryons disqualifiés seront exclus. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5:. Un contrôle et une gauche d'embryon de poulet ligaturé auriculaire La flèche indique l'oreillette gauche, qui est d'environ 75% plus petit dans l'embryon ligaturé.

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

L&#39;accès optique et d&#39;expérimentation dans les embryons aviaire est difficile en raison de contraintes de la coquille d&#39;œuf. Fenêtrage limite considérablement le nombre d&#39;accès à des approches d&#39;injection et de microchirurgie 8 microvaisseaux. En conséquence seuls les embryons précoces peuvent être manipulés et de l&#39;observation en continu n&#39;est pas possible. Début ex-ovo-cultures utilisant des boîtes de Petri ont été d&#39;un usage limité à cause du contrôle insuffisant de ...

<table><tbody><tr><td>Œufs de poule Leghorn blancs fertiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modèle GB1, incubateurs Avery, Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Élastiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau chaude stérile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gobelet en plastique de 9 oz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 100 mm de diamètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air thermique 1602N</td><td>GQF Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextrane conjugué à la fluorescéine (2 MDa, 1 % p/v dans une solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Glassworx, Inc, St Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires en verre (0,75 mm de diamètre interne)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Modèle M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie en fluorescence</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>Pincettes fines n°55</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fil de suture chirurgical en nylon 10-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuyau</td><td>VWR international</td><td></td><td>1 mm de diamètre externe</td></tr><tr><td>Seringue de 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette de 200 &amp;mu;L et embouts de pipette</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une ex-ovo- poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d&#39;imagerie et de microchirurgie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Comprendre les relations entre facteurs génétiques et microenvironnementales ce disque normal et malformés développement embryonnaire est fondamentale pour la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les progrès de la technologie d&#39;imagerie ont permis étude quantitative de l&#39;organisation et la maturation du plan du corps, mais à un stade ultérieur la morphogenèse embryonnaire est moins claire. Embryons de poulet sont un système de vertébrés attractif modèle animal pour cette application en raison de sa facilité de culture et de la manipulation chirurgicale. Embryons précoces peuvent être cultivées pendant un court moment sur ​​les anneaux de papier filtre, qui permet un accès complet optique pour la structuration et le destin cellulaire des études 1,2. Etudier les processus de développement avancés tels que la morphogenèse cardiaque sont traditionnellement effectuées par une fenêtre de la coquille 3-5, mais cette technique limite l&#39;accès optique due à la taille de fenêtre. Nous avons déjà développé une méthode simple pour la culture des embryons toute l&#39;ex-ovo-sur hexagonale pèsent bateaux pour un maximum de 10 jours, ce qui a permis d&#39;imagerie haute résolution via l&#39;échographie 6,7. Ces cultures ont été difficiles à transporter, limitant les types d&#39;outils d&#39;imagerie disponibles pour des expériences en direct. Nous présentons ici un système de culture améliorée sans coquille avec un bon rapport coût-efficacité, chambre environnementale portables. Les œufs étaient fissurés sur un hamac créé par une membrane de polyuréthane (s&#39;accrocher envelopper) apposé circonférentiellement pour une tasse en plastique partiellement rempli d&#39;eau stérile. Les dimensions de la circonférence et la profondeur du hamac sont à la fois critique pour maintenir la tension de surface, tandis que la mécanique du hamac et eau sous aidé à atténuer les vibrations induites par le transport. Un faible encombrement circulant bain d&#39;eau a également été développé pour permettre un contrôle continu de la température lors de l&#39;expérimentation. Nous démontrons la capacité de la culture des embryons de cette manière pendant au moins 14 jours sans défaut ou retard morphogénique et emploient ce système en microchirurgie plusieurs applications d&#39;imagerie.

Dans cet article, nous présentons une méthodologie simple pour permettre à long terme<em&gt; Ex-ovo-</em&gt; Culture embryon aviaire. Cette technique est idéale pour l&#39;expérimentation longitudinale complète nécessitant l&#39;accessibilité et / ou optiques de transport stériles des embryons aviaires.

Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d&#39;imagerie et de microchirurgie

La compréhension des relations entre les facteurs génétiques et microenvironnementaux qui régissent le développement embryonnaire normal et malformé est fondamentale pour...

Dans le système de culture embryonnaire de poulet *in ovo*, la préparation de cultures embryonnaires de poulet en coquille fendue permet d'étudier l'embryogenèse. La procédure commence par l'obtention et l'incubation d'œufs de poule fécondés à 37,5 degrés Celsius pendant 72 heures. Des hamacs destinés à supporter les jaunes d'œufs contenant les embryons en développement sont ensuite préparés.Ensuite, les jaunes d'œuf peuvent être transférés sur des hamacs, et l'embryogenèse se poursuit à l'extérieur de la coquille. Cette technique peut être utilisée pour des microinjections dans le système vasculaire, des échographies ultrasonores et des microchirurgies, et les résultats peuvent montrer comment les embryons se développent dans des conditions normales ou perturbées. Bonjour, je m'appelle Akshay Shaker et je suis étudiant en master au sein du laboratoire de bio-ingénierie du développement cardiovasculaire dirigé par Jonathan Butcher, dans le département de génie biomédical de l'université Cornell.Et le principal avantage de notre technique par rapport aux méthodes antérieures, comme la culture d'œufs in ovo, est qu'elle offre un accès optique complet à l'embryon ainsi qu'une manipulation facile sans dommage. Bonjour, je m'appelle Char Hin. Je suis chercheur postdoctoral au sein du Laboratoire de bioingénierie du développement cardiovasculaire, laboratoire de Jonathan Chu, du Département de génie biomédical de l'Université Cornell.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, comme la manière dont les malformations cardiaques se développent durant l'embryogenèse. Avant de commencer cette procédure, stérilisez tous les matériaux en les essuyant avec de l'éthanol à 70 %. Pour commencer la procédure, remplissez les trois quarts d'un gobelet en plastique de neuf onces avec de l'eau tiède stérile.Répétez autant de fois que nécessaire. Un gobelet standard de neuf onces a un diamètre supérieur de huit centimètres, ce qui correspond à la taille la plus adaptée à l'application de culture prolongée présentée ici. Ensuite, découpez un morceau de film plastique de 20 centimètres de long.Couvrez le haut du gobelet en plastique de neuf onces rempli d'eau tiède stérile avec un morceau de film plastique adhésif, et utilisez un élastique pour maintenir le film en place. Le film plastique adhésif est le plus approprié pour cette application car il empêche l'adhérence du jaune, ce qui pourrait entraîner sa rupture. Pendant le transport, le film doit être étendu de manière à toucher la surface de l'eau.Coupez le plastique excédentaire autour de la bande et essuyez le plastique. À l’aide de lingettes Kim imbibées d’éthanol à 70 %, les hamacs sont désormais prêts à accueillir les embryons. Les œufs de poulet fécondés peuvent être conservés à 13 degrés Celsius jusqu’à cinq jours avant l’incubation.Sans activer le développement, un réfrigérateur à vin rouge peut maintenir cette température afin d'avoir les œufs prêts pour la culture. Activez le développement de l'embryon en incubant les œufs, côté pointe vers le haut, dans un incubateur à humidité constante de 60 %, avec un mouvement oscillant continu à 37,5 degrés Celsius pendant 72 heures. Lorsque les œufs sont prêts, retirez-les de l'incubateur.Stérilisez les œufs en les essuyant avec des lingettes Kim imprégnées d'éthanol à 70 %. Disposez les œufs horizontalement sur le côté dans un carton à œufs pendant une à deux minutes afin de positionner correctement l'embryon. Manipulez au maximum six œufs à la fois, car il est difficile de casser plus de six œufs simultanément.Peut entraîner un maintien trop prolongé à la température ambiante, ce qui peut affecter la viabilité. Au bout d'une à deux minutes, l'embryon a glissé vers le sommet de l'œuf. Pour transférer chaque embryon dans un hamac, travaillez de manière aseptique sous une hotte à flux laminaire.Tout d'abord, cassez délicatement la partie inférieure de l'œuf à l'aide d'un bord tranchant, comme celui d'un seau en métal ou d'un bécher en verre. Souvenez-vous que l'embryon se trouve du côté supérieur. Séparez doucement les deux moitiés de la coquille en les écartant latéralement à l'aide des deux pouces.Ensuite, placer l'embryon, le vitellus et l'albumen sur le hamac. L'albumen fournit un environnement amortissant autour du vitellus en absorbant les chocs provoqués par le déplacement du système. L'albumen fournit également une nutrition à l'embryon pendant la longue période de culture.Si le transfert de l'embryon est effectué correctement, l'embryon devrait déjà être positionné sur le dessus. Si l'embryon se trouve au fond, utilisez une courbe fermée, de petites ciseaux ou tout autre instrument contondant similaire pour frotter le jaune afin qu'il tourne sur lui-même et que l'embryon remonte vers le haut. Si vous cultivez les embryons au-delà du septième jour embryonnaire, répartissez des morceaux de coquille d'œuf broyés autour de la périphérie de l'embryon comme source de calcium pour le développement et la maturation osseuse.Une fois le transfert de l'embryon terminé, placez une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre sur le dessus du gobelet afin de sceller l'embryon. Placez le hamac dans l'incubateur réglé à 37,5 degrés Celsius. Si un incubateur portable est utilisé, placez également un à deux gobelets de neuf onces remplis d'eau dans l'incubateur.Afin de maintenir l'humidité à environ 60 %, les embryons poursuivent leur développement et peuvent être utilisés pour des microinjections dans des applications de microchirurgie. Cette culture d'embryons convient aux applications de microinjection où des solutions doivent être injectées dans la vascularisation. Préparez d'abord l'appareil d'injection en commençant par les aiguilles, en utilisant une méthode de microtaillage, en tirant des capillaires en verre pour former des micropipettes à extrémité biseautée.La taille de la pointe dépend du débit souhaité. Connectez la seringue munie d'une microneedle à un tube en silicone d'un diamètre intérieur de 0,03 pouce. Remplissez le tube de seringue avec une solution à injecter, puis reliez la microneedle de la seringue au tube.Placer l'aiguille microscopique sur le micromanipulateur et la seringue sur le support de seringue ou la pompe à seringue. Une fois que l'ensemble d'injection est prêt, récupérer les embryons. Une pénétration horizontale de l'aiguille est nécessaire pour une entrée correcte de l'aiguille dans un vaisseau sanguin, tel qu'un vaisseau vital.L'embryon doit donc se trouver au même niveau que les bords du récipient qui le contient. Pour surélever l'embryon, retirez l'élastique maintenant le film plastique qui soutient l'embryon. Soulevez délicatement un côté du film plastique et ajoutez un peu d'eau dans le récipient sans trop déplacer l'embryon.Ensuite, replacez l'élastique sur le plastique. Maintenant que l'embryon est surélevé, la solution peut être injectée dans un vaisseau embryonnaire. Notez que lors de l'injection dans un vaisseau vital, la taille de l'aiguille micrométrique doit être d'environ un dixième du diamètre du vaisseau.Pour maintenir une perfusion efficace sans provoquer de saignement, commencez par pomper la solution dans l'aiguille micrométrique afin qu'aucun air ne soit piégé à l'intérieur. Ensuite, alignez la pointe de l'aiguille micrométrique avec un vaisseau sélectionné pour les vaisseaux essentiels. Le choix d'une zone permet d'obtenir une surface maximale pour cibler le vaisseau.Une fois la zone d'injection définie, avancer l'aiguille vers le vaisseau. Le vaisseau se rétracte d'abord. Dès que l'aiguille pénètre et que la perfusion commence, la couleur du sang en circulation change avec la perfusion.Si le changement de couleur n'est pas observé, l'aiguille a pu traverser le vaisseau. Dans ce cas, retirer lentement la micropipette tout en pompant simultanément la solution jusqu'à ce qu'un changement de couleur soit visible dans le vaisseau. Lorsque la perfusion est terminée, retirer délicatement la micropipette du vaisseau. Cette culture d'embryon convient également à des applications de microchirurgie telles que la ligature de l'oreillette gauche, qui est réalisée le quatrième jour d'incubation.Commencez par préparer les nœuds à utiliser à un diamètre de 0,5 millimètre à partir du fil de suture chirurgicale en nylon 10-0. À l’aide de pinces fines, retirez les membranes choriales et allantoïdes de l’embryon. Soulevez l’embryon par l’arrière et faites-le pivoter verticalement afin que le côté gauche de l’embryon se retrouve maintenant en haut et soit accessible.Ensuite, retirer le péricarde recouvrant l'oreillette gauche. Positionner le nœud au-dessus de l'oreillette gauche et le serrer en le tenant et en le tirant sur les côtés. À l’aide de pinces, le nœud doit être fait de manière à bloquer environ 75 % du débit sanguin initial vers le côté gauche. Couper les extrémités du nœud avec des ciseaux microchirurgicaux et retirer soigneusement puis jeter l’excès de fil de suture.Enfin, faites pivoter l'embryon pour le ramener à son orientation initiale, avec le côté droit en haut. Ci-dessous, des embryons à différents stades cultivés ex ovo, comme vient d'être démontré : un chauffage à circulation d'eau peut maintenir les conditions environnementales pendant de longues périodes, ce qui peut être nécessaire pendant l'acquisition d'images et les applications microchirurgicales.Les embryons de poulet cultivés ex vivo sont adaptés à la microinjection. Dans cette expérience, un colorant fluorescent a été injecté dans la vascularisation d'un embryon de poulet cultivé ex vivo. Les embryons de poulet cultivés ex vivo sont adaptés à la microchirurgie.Dans cette expérience, une ligature de l'oreillette gauche a été réalisée sur un embryon de poulet cultivé in ovo. Une fois la technique maîtrisée, la culture d'embryons de poulet in ovo peut être effectuée en environ cinq minutes par embryon. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer des cultures d'embryons de poulet XO adaptées aux applications d'imagerie et de microchirurgie, ainsi que dans les cas où le transport des cultures est nécessaire.

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Cette vidéo montre la nouvelle culture, une méthode par laquelle les embryons de poulet sont cultivées en dehors de l'œuf jusqu'à 24 heures. Cette méthode permet d'étudier le développement précoce (ligne primitive à 14 soms.), Une période correspondant à E7-9 chez la souris. Les applications de cette technique comprennent l'électroporation, l'hybridation in situ et immunohistochimie.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

La membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM) est un environnement unique et naturellement immunodéficients culture favorable pour étudier l'angiogenèse et de la tumorigenèse. Cet article vidéo montre les différentes étapes de...

Poussin<em&gt; Ovo ex</em&gt; Culture et<em&gt; Ovo ex</em&gt; CAM Test: Comment il fonctionne vraiment

Cette vidéo démontre la culture et l’imagerie ex vivo de tranches oculomoteurs d’embryons de souris transgéniques. Les embryons sont isolés et noyés dans l’agarose. À l’aide d’un vibratome, on obtient des coupes contenant les noyaux oculomoteurs et les yeux. Les coupes sont maintenues en culture et imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Culture ex vivo et imagerie de tranches oculomotrices d’embryons de souris transgéniques

Trancher les cultures de faciliter la manipulation du développement embryonnaire par le gène et les perturbations pharmacologiques. Toutefois, les conditions de culture doivent veiller à ce que le développement normal de procéder à l'intérieur de l'environnement réduit de la tranche. Nous illustrons un protocole qui facilite le développement normal de la moelle épinière se poursuivre pendant au moins 24 heures.

Embryon de poulet moelle épinière culture Tranche Protocole

Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Il peut être difficile de visualiser et d’accéder à l’embryon de poulet pendant le développement. Nous avons développé une méthode ex ovo qui est simple, rentable et qui peut facilement être utilisée dans une salle de classe ou un cadre de recherche. Cette méthode permet d’accéder à l’embryon dans les derniers stades du développement embryonnaire (HH 40).

Optimisé Ex-ovo Culture des embryons de poulet aux stades avancés de développement

Ici, nous présentons une nouvelle technique de culture d’embryons de poussin ex ovo pour l’imagerie en accéléré à l’aide de la lumière transmise et de la microscopie à fluorescence. Le sandwich de papier filtre immergé est une variante de la technique bien établie du support de papier filtre1 qui permet de cultiver des embryons de poussins entièrement immergés dans un milieu de culture liquide.

Un filtre Sandwich de papier Submergé Long terme Ovo Ex Time-lapse Imaging of Early Chick Embryons

Ce protocole décrit trois méthodes sur la façon d’obtenir et d’utiliser des embryons de poulet âgés de 5 à 8 jours et leur membrane chorio-allantoïdienne (CAM) comme modèle in vivo pour étudier l’imagerie par ultrasons à contraste amélioré et l’administration de médicaments médiée par microbulles.

La préparation d’embryons ex ovo de poulet et de vaisseaux membranaires chorio-allantoïdiens comme modèle in vivo pour l’imagerie par ultrasons à contraste amélioré et les études d’administration de médicaments médiées par microbulles

L’objectif global de cet article est de décrire comment effectuer une injection intracellulaire ovo de matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cette approche est très utile pour étudier la biologie du développement des embryons de poulet.

À Ovo Injection intravasculaire dans des embryons de poulet

Ce protocole a été développé pour surveiller longitudinalement les propriétés mécaniques du tissu de la plaque neurale pendant la neurulation de l’embryon de poulet. Il repose sur l’intégration d’un microscope Brillouin et d’un système d’incubation sur scène, permettant l’imagerie mécanique en direct du tissu de la plaque neurale dans des embryons de poussins cultivés ex ovo .

Surveillance de l’évolution mécanique des tissus lors de la fermeture du tube neural d’un embryon de poussin

Apprenez la culture ex-ovo d'embryons de poulet pour l'étude de l'embryogenèse aviaire. Cette méthode permet l'imagerie, la microinjection et la microchirurgie avec accès optique complet.

Une Ex-ovo- Poulet embryonnaire du système de culture approprié pour les applications d'imagerie et de microchirurgie

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