Dosage activité locomotrice d'étudier les rythmes circadiens et le sommeil dans les paramètres Drosophile

L'objectif général de l'expérience suivante est de caractériser les phénotypes circadiens et du sommeil chez la drosophile en analysant les rythmes quotidiens de l'activité locomotrice. Ceci est réalisé en générant des mouches transgéniques, en obtenant des mutants spécifiques ou en réalisant les croisements nécessaires afin de préparer les animaux expérimentaux. Dans un deuxième temps, il est nécessaire de préparer des tubes d'activité en verre contenant une source alimentaire, qui serviront d'habitat aux mouches pendant l'expérience.

Ensuite, des mouches âgées d'un à cinq jours sont placées dans des tubes d'activité, qui sont insérés dans des moniteurs d'activité DAM afin de suivre les rythmes d'activité locomotrice. À l'aide du système DAM, des résultats sont obtenus qui révèlent des anomalies et des variations des paramètres circadiens et du sommeil, basées sur l'analyse des rythmes d'activité locomotrice quotidienne à l'aide de logiciels tels que far sex et insomniac. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie circadienne, comme par exemple quelles protéines et quels mécanismes régulateurs sont impliqués dans la génération de rythmes appropriés, ou encore comment des facteurs environnementaux tels que la lumière et la température modulent les rythmes comportementaux via des voies moléculaires spécifiques.

Le système de surveillance de l'activité locomotrice implique plusieurs équipements, tels que des dispositifs spécialisés de surveillance, des incubateurs environnementaux dotés d'une fonction de contrôle de la lumière diurne, des dispositifs de collecte de données, des ordinateurs et des matériaux périphériques comme des câblages. Choisissez une pièce sombre bien ventilée, à régulation thermique, pour installer le système de surveillance de l'activité locomotrice, afin d'éviter une surcharge excessive des incubateurs et tout risque d'échec dans le maintien de la température. Scellez la pièce hermétiquement contre les sources lumineuses extérieures à l'intérieur de la pièce sombre. Il n'est pas nécessaire de travailler totalement dans l'obscurité, car le système circadien des drosophiles n'est pas sensible à la lumière infrarouge.

Par conséquent, dans les cas où nous devons voir dans une pièce sombre, nous utilisons simplement une lampe de poche standard recouverte d'un filtre rouge, ainsi qu'une unité de secours d'alimentation sans interruption disposant d'une capacité suffisante en wattage pour alimenter les composants du système de surveillance des activités. En cas de surtension ou de panne de courant dans le bâtiment, connectez l'unité de secours UPS au circuit de secours du bâtiment, si disponible. Si le système qui commande l'éclairage de l'incubateur n'est pas directement régulé par l'incubateur, il suffit alors de brancher l'incubateur sur l'alimentation de secours sans utiliser de UPS, car une coupure d'électricité de quelques secondes n'affectera pas la température de l'enceinte.

Ensuite, configurez un ordinateur, PC ou Macintosh, entièrement dédié à la collecte de données ou au contrôle des incubateurs. Organisez manuellement le réseau de lignes téléphoniques de manière ordonnée autour des étagères des incubateurs régulés sur le plan environnemental, afin de faciliter le branchement et le débranchement des appareils. Configurez plusieurs lignes téléphoniques de sorte qu’elles convergent vers une ligne principale et s’étendent hors de l’incubateur pour se connecter à l’ordinateur ; reliez les dispositifs de surveillance à l’intérieur des incubateurs à l’ordinateur via une unité d’interface d’alimentation, qui sert à alimenter le moniteur d’activité par l’intermédiaire de la ligne téléphonique.

Enfin, masquez les sources lumineuses possibles provenant des DEL des appareils électroniques ou d'une porte d'incubateur mal scellée à l'aide de ruban adhésif ou d'un tissu noir. Pour garantir que les rythmes libres soient mesurés en l'absence de lumière indésirable. Il est essentiel d'évaluer ces phénotypes à l'aide d'animaux témoins appropriés, élevés dans les mêmes conditions environnementales et du même âge.

En outre, il existe un dimorphisme sexuel dans la rythmicité circadienne. La pratique générale consiste à utiliser des mouches mâles adultes pour ces tests, élevées à 25 degrés Celsius et âgées de un à cinq jours, car l'activité de ponte des mouches femelles pourrait fausser la mesure réelle de l'activité locomotrice. Lorsqu'on examine les paramètres circadiens et de repos-sommeil de mouches mutantes spécifiques d'intérêt, il est recommandé de croiser la souche mutante avec une souche sauvage de même fond génétique.

Par exemple, W 1118 ou yw. Étant donné qu'il n'y a pas de crossing-over chez les mâles de drosophile, il est préférable de réaliser le croisement en croisant des femelles mutantes avec des mâles de type sauvage, en semant simultanément les mouches témoins de type sauvage et les mouches mutantes. Sur un milieu standard pour drosophiles, pendant environ 10 à 14 jours avant l'expérience sur le rythme d'activité locomotrice, après l'émergence de la descendance, récupérez des mouches mâles âgées de un à cinq jours et mettez-les de côté pour les utiliser dans les expériences.

Les tubes d'activité représentent l'habitat des mouches. Pendant l'expérience, il s'agit de fins tubes en verre de cinq millimètres de diamètre, contenant une substance nutritive à une extrémité et bouchés à l'autre extrémité avec du coton ou un bouchon en plastique. Il est préférable d'utiliser des tubes d'activité récemment préparés.

Ils sont généralement préparés quelques jours à une semaine avant le début de l'expérience. Étant donné que les tubes en verre pour l'activité peuvent être réutilisés plusieurs fois, les procédures de préparation suivantes décrivent l'utilisation de tubes d'activité précédemment utilisés et non nettoyés comme point de départ. Si vous utilisez des tubes d'activité neufs, passez directement à l'autoclavage des tubes comme indiqué plus loin.

Retirez les bouchons des tubes d'activité usagés et placez-les dans un grand bécher en verre. Les tubes doivent remplir le bécher jusqu'à la moitié seulement. Remplissez le bécher avec de l'eau du robinet, en veillant à immerger complètement les tubes.

Faites chauffer au micro-ondes le bécher rempli de tubes en verre jusqu'à ce que l'eau atteigne une ébullition rapide et complète. Pour faire fondre la nourriture à base de cire et d'agar, faites attention car l'eau est chaude. Retirez le bécher du micro-ondes et mélangez les tubes à l'aide d'une spatule ou d'un objet en plastique.

Pipette de 10 millimètres pour permettre à la cire piégée de remonter à la surface. Répéter ensuite l'étape de micro-ondes. Retirer le bécher du micro-ondes et attendre qu'il refroidisse.

Placer le bécher dans la chambre froide accélérera le processus. À mesure que l'eau refroidit, la cire s'accumule à la surface de l'eau et se solidifie progressivement. Retirer la cire solidifiée à la main.

Cela devrait éliminer la majeure partie de la cire sur les tubes. Transférez les tubes d'activité dans un nouveau bécher contenant de l'eau du robinet fraîche et répétez le processus de micro-ondes et d'élimination de la cire. Étant donné que la majeure partie de la cire a déjà été retirée à l'étape précédente, il n'est pas nécessaire d'attendre que la cire durcisse.

Versez simplement l'eau hors du bécher et transférez les tubes dans un nouveau bécher. Procédez avec précaution car l'eau est encore chaude. Répétez le processus de micro-ondes une dernière fois.

Versez l'eau hors du bécher et attendez que les tubes d'activité refroidissent. Ensuite, placez les tubes d'activité verticalement dans des béchers en verre de 250 millilitres ou de 500 millilitres. Assurez-vous qu'ils ne soient pas trop serrés.

Stérilisez-les en utilisant un autoclave avec un cycle à sec ou séchez simplement les tubes dans une étuve afin de préparer la nourriture à charger dans les tubes d'activité. Préparez une solution contenant 5 % de saccharose et 2 % de bacto-agar dans de l'eau distillée ou du robinet, puis stérilisez la solution en autoclave. La nourriture stérilisée peut être utilisée immédiatement ou conservée à quatre degrés Celsius pendant une période prolongée.

Idéalement, la nourriture doit être à environ 65 degrés Celsius lors du remplissage des tubes d'activité. Utilisez une pipette de 10 millilitres pour verser la solution liquide de nourriture le long de la paroi intérieure du bécher en verre, en remplissant les tubes jusqu'à un tiers de leur hauteur, à partir du fond. Faites tourner doucement le bécher pour vous assurer que tous les tubes sont uniformément remplis de solution nutritive.

Attendre que la nourriture se solidifie complètement, soit à température ambiante, soit à quatre degrés Celsius. Une fois que la condensation à l'intérieur des tubes en verre a disparu, les tubes peuvent être retirés du bécher. Pour retirer les tubes d'activité du bécher, pousser les tubes vers le fond du bécher tout en les tournant simultanément afin que la nourriture solidifiée à l'intérieur des tubes se détache du fond du bécher.

Retirez les tubes du bécher, de préférence en un seul groupe. Ensuite, nettoyez les tubes un par un avec des essuie-tout pour éliminer l'excès d'aliment à la surface extérieure des tubes. Placez les tubes de côté dans un récipient propre.

Prenez un chauffe-bloc de laboratoire général sans support de tubes et recouvrez soigneusement le puits de chauffe. À l’aide de plusieurs couches de papier d’aluminium résistant, ajoutez des pastilles de paraffine dans le puits de chauffe doublé d’aluminium afin de les faire fondre, maintenez les tubes à l’extrémité non alimentaire et plongez l’extrémité alimentaire dans la cire fondue. Plongez la partie recouverte de cire dans un bécher en verre rempli d’eau froide pour accélérer la solidification de la cire. Répétez l’opération.

Une fois trempées dans l’eau, les tubes en cire ne colleront plus entre eux. Les tubes peuvent être utilisés immédiatement ou conservés dans un récipient hermétique à quatre degrés Celsius. Une conservation prolongée au-delà d’une semaine entraînera un dessèchement excessif de la nourriture.

Si les tubes sont stockés à quatre degrés Celsius, portez-les à température ambiante en les laissant sur le plan de travail avant utilisation. Avant de charger les mouches dans les tubes d'activité, allumez les incubateurs qui serviront à loger les moniteurs d'activité. Réglez la température à l'aide des commandes de l'incubateur et définissez le régime lumineux et obscur à l'aide du contrôleur lumineux du système DAM ou du système de contrôle lumineux intégré de l'incubateur, selon le protocole expérimental souhaité.

Ensuite, anesthésiez les mouches au dioxyde de carbone. Puis, à l’aide d’un pinceau fin, transférez délicatement une mouche unique dans un tube d’activité. Saisissez le milieu d’un morceau de fil d’environ un demi-pouce à l’aide de pinces fines et insérez le fil dans l’extrémité du tube d’activité opposée à la nourriture afin de boucher l’ouverture et empêcher la mouche de s’échapper pendant l’expérience.

En permettant toutefois la circulation de l'air dans le tube, maintenir le tube sur le côté jusqu'à ce que la mouche se réveille. Pour éviter que la mouche ne reste collée à la nourriture, insérer les tubes dans les moniteurs d'activité. Avec les modèles plus récents et compacts des moniteurs Tri Kinetics, il est nécessaire de maintenir les tubes en place à l’aide d’élastiques afin de garantir que le faisceau infrarouge traverse le tube au niveau de sa position centrale. Enfin, placer les moniteurs d'activité dans les incubateurs et les relier au système de collecte des données à l’aide des câbles téléphoniques pour vérification.

À l'aide du logiciel de collecte du système DAM, vérifiez que tous les moniteurs sont correctement connectés et que les données sont bien recueillies par chacun d'entre eux. Maintenant que les mouches ont été chargées dans les tubes d'activité et que le système de surveillance de l'activité locomotrice est prêt, les données peuvent être enregistrées. Les mouches sont synchronisées et entraînées en les exposant au régime souhaité de lumière, d'obscurité ou de cycles lumière-obscurité (LD) et de température pendant deux à cinq jours complets.

La condition d'entraînement la plus couramment utilisée est un cycle lumière-obscurité de 12 heures de lumière, 12 heures d'obscurité à 25 degrés Celsius. Pour l'étude des rythmes circadiens par rapport à ce protocole, le moment où la lumière s'allume dans l'incubateur est défini comme le temps Zeke GABA zéro, et tous les autres moments sont relatifs à cette valeur. Dans des conditions standard 12 heures lumière / 12 heures obscurité, les roso melano gasta typés présentent généralement deux périodes d'activité, l'une centrée autour de ZT zéro appelée pic du matin, et une autre autour de ZT 12 appelée pic du soir. Les rythmes locomoteurs en conditions libres sont mesurés en l'absence de cycles lumineux et à température constante, après la période d'entraînement.

Le réglage du cycle lumineux peut être modifié à tout moment pendant la phase sombre du dernier jour du cycle LD, de sorte que le jour suivant de l'expérience corresponde au premier jour du cycle DD. Une collecte de données sur sept jours en conditions DD suffit à calculer la période circadienne ainsi que l'amplitude ou la force du rythme des mouches. En général, une taille d'échantillon d'au moins 16 mouches est nécessaire pour obtenir des périodes libres fiables pour un génotype donné.

À la fin de l'expérience, les données brutes binaires collectées à l'aide du logiciel du système DAM sont téléchargées sur un dispositif portable de stockage de données. Par exemple, une clé USB. Les données brutes binaires sont traitées à l'aide de DAM file scan 1 0 2 x et regroupées en intervalles de 15 et 30 minutes lors de l'analyse des paramètres circadiens, ou en intervalles d'une à cinq minutes lors de l'analyse du sommeil.

Paramètres de repos. Actuellement, cinq minutes consécutives d'inactivité constituent la définition standard du repos de sommeil chez la drosophile. Une fois ce protocole terminé, on peut utiliser le même jeu de données pour comparer les paramètres circadiens et de sommeil des animaux expérimentaux et des animaux témoins concernant les paramètres circadiens.

Des graphes d'activité illustrant les activités locomotrices quotidiennes ou les activités moyennes des mouches sur plusieurs jours dans des conditions LD ou DD peuvent être générés à l'aide de fast x oph. Drosophila melanogaster présente généralement deux périodes d'activité, l'une centrée autour de ZT 0, appelée pic du matin, et une autre autour de ZT 12, appelée pic du soir. Ces deux périodes d'activité sont contrôlées par l'horloge endogène et peuvent être observées même en conditions libres DD. Les changements dans le moment de ces pics d'activité peuvent facilement être observés sur les graphes d'induction et peuvent indiquer une modification des propriétés de l'horloge endogène.

Une autre propriété qui indique un fonctionnement adéquat de l’horloge biologique est l’augmentation prévisionnelle de l’activité locomotrice observée lors des cycles LD, survenant avant les transitions réelles entre l’obscurité et la lumière ou entre la lumière et l’obscurité. Ce comportement est clairement observé chez les mouches de type sauvage, mais est absent et arythmique chez les mutants per zéro. Chez ce mutant.

Les pics matinaux et vespéraux observés chez les mouches LD sont des réponses de sursaut dues à des changements brusques des conditions de luminosité. Les mouches sans horloge ne prévoient pas les changements environnementaux, mais y réagissent simplement. La perte de rythmicité comportementale est beaucoup plus marquée en DD et se manifeste généralement par la disparition totale des pics matinaux ou vespéraux d'activité locomotrice, comme on l'observe chez les mouches per zéro.

En plus des graphiques d'induction, les données d'activité locomotrice peuvent être représentées sous forme de double diagramme pour chaque mouche individuelle ou génotype de mouche, où deux jours de données sont tracés séquentiellement sur chaque ligne, mais le profil du dernier jour commence la ligne suivante correspondant à deux jours d'activité. Par exemple, les jours LD un et deux sont tracés sur la première ligne du diagramme ACTO. La ligne suivante commence par une répétition du jour LD deux, suivie du jour LD trois, et ainsi de suite.

Suite à ce format, les données d'activité locomotrice couvrant l'ensemble de l'expérience sont illustrées dans l'actogramme. Un avantage des actogrammes par rapport aux graphiques de réduction réside dans le fait qu'une modification de la durée de la période d'activité quotidienne est facilement observable, en plus de la génération de graphiques d'induction et d'actogrammes.

Les données d'activité locomotrice provenant de la condition DD peuvent être soumises à un logiciel tiers afin de calculer la durée de la période à l'aide de plusieurs programmes différents, notamment Cycle P pour l'analyse des paramètres de sommeil et de repos, défini comme cinq minutes consécutives d'inactivité. On peut analyser les données enregistrées à partir des tests d'activité locomotrice et examiner plusieurs paramètres du sommeil à l'aide d'Insomniac, un programme basé sur MATLAB ; le pourcentage de temps que les mouches passent à dormir peut être calculé selon différents intervalles de temps. Par exemple, le pourcentage de sommeil chaque heure ou toutes les 12 heures.

D'autres paramètres de sommeil plus courants pouvant être examinés incluent la durée moyenne des épisodes de repos, une mesure du degré de consolidation du sommeil qui peut illustrer la qualité du sommeil. Un autre paramètre est le nombre d'activités pendant l'éveil, qui quantifie le taux d'activité lorsque les mouches sont éveillées. Ce paramètre permet de distinguer les mouches véritablement affectées au niveau du sommeil ou des comportements de repos de celles qui sont malades ou hyperactives.

Par exemple, les mouches simplement malades peuvent sembler dormir davantage parce qu'elles sont moins mobiles. Chez ces mouches, l'activité éveillée sera plus faible par rapport aux animaux témoins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment caractériser les phénotypes circadiens et de sommeil chez la drosophile à l'aide de tests. Rythmes quotidiens de l'activité locomotrice.