L'isolement des cellules endothéliales valvulaires

L'isolement de cellules endothéliales interstitielles résidentes et spécifiques aux faces à partir d'une valve aortique cardiaque est démontré dans ce protocole vidéo. La feuillette de la valve est prélevée sur le cœur et placée dans une solution saline froide. La couche endothéliale peut être retirée des deux faces de la feuillette en raclant doucement le tissu immergé dans une solution de collagénase à l'aide d'un coton-tige ; pour un isolement spécifique aux faces, la feuillette de la valve est épinglée sur un lit de paraffine de manière à exposer la surface endothéliale.

Quelques gouttes de collagénase froide sont ensuite ajoutées au feuillet valvulaire, et les feuillets sont incubés de cinq à dix minutes. Après l'incubation avec la collagénase, la couche endothéliale spécifique à chaque face est éliminée par cisaillement doux du tissu. À l’aide d’un écouvillon, les cellules endothéliales libérées sont alors recueillies, lavées et mises en culture.

Les autres feuillets sont ensuite digérés toute la nuit pour isoler les cellules interstitielles, qui sont recueillies et lavées. Toutes les cellules isolées sont mises en culture et peuvent être utilisées pour comprendre leur rôle dans la réparation et le remodelage des valves cardiaques en réponse à des signaux mécaniques et biologiques locaux. Bonjour, je m'appelle Russell Gould.

Je suis actuellement à l’université Cornell, au sein du département de génie biomédical, où je travaille dans le laboratoire de Butcher. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment isoler les cellules endothéliales valvulaires. Les implications de cette technique s’étendent à la compréhension de la manière dont les cellules V résidentes réparent et remodelent en permanence les tissus en réponse à des signaux mécaniques et biologiques.

Commençons donc. Pour commencer, obtenez un porc auprès de votre abattoir local et travaillez de manière aseptique pour exciser la racine aortique. Rincez soigneusement la racine aortique pour éliminer tout sang.

Avec du DPBS froid et stérile, il est impératif d'éliminer tous les composants sanguins le plus rapidement possible afin de limiter la mort des cellules endothéliales valvulaires ou VEC et la contamination bactérienne. Les antibiotiques et antimycosiques ne sont pas recommandés à ce stade, car ils pourraient être nocifs pour les cellules endothéliales. Ensuite, isolez directement la racine trois.

Feuillets valvulaires provenant de chaque valve. Soyez prudent lors de l'isolement du feuillet, car tout tissu annulaire contaminera la population cellulaire. Placez les feuillets isolés dans un tube conique stérile de 15 millilitres contenant 12 millilitres de DPBS froid.

Agiter plusieurs fois pour éliminer les débris et remplir à nouveau avec du DPBS frais. Enfin, transporter les feuillets valvulaires jusqu’au laboratoire sur de la glace. À l’arrivée au laboratoire, placer le récipient contenant le tissu sous la hotte stérile, procéder à l’isolement de la couche endothéliale, et stériliser au autoclave les éléments suivants dans un plateau d’instruments couvert : pinces à tissu dentelées, ciseaux à tissu et cotons-tiges.

Préparez également une solution stérile de collagénase, le milieu endothélial et le milieu interstitiel. Comme indiqué dans le protocole écrit joint. Remplissez une boîte stérile de 35 millimètres avec trois millilitres de solution froide de collagénase par valve, et placez les trois feuillets provenant du tube de 15 millilitres dans la boîte.

Incuber le tissu pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, retirer délicatement la couche endothéliale des deux côtés du feuillet en faisant tourner un écouvillon stérile sec sur la surface. Le sens de rotation et la quantité de cisaillement appliquée sont essentiels pour la pureté de l'échantillon.

La rotation du frottis s'effectue dans un sens opposé au mouvement linéaire de la main tenant le coton-tige. Cela crée un cisaillement contrôlé qui détache les cellules endothéliales du tissu. L'intensité de la force appliquée doit suffire à sentir la résistance du tissu, mais sans pénétrer la membrane basale ; trempez occasionnellement le frottis dans la solution de collagénase afin de détacher les cellules des fibres de l'extrémité.

Une fois le prélèvement terminé, la texture de la couche endothéliale doit sembler légèrement plus lisse qu'auparavant. Recueillir les cellules en suspension dans la solution de collagénase et les transférer dans un nouveau tube stérile de 15 litres. Après avoir prélevé les cellules endothéliales sur les feuillets, placer immédiatement les feuillets dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de solution de collagénase destinée à l'isolement des cellules interstitielles.

Centrifuger les tubes à 1000 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante pour former un culot avec les cellules isolées, puis aspirer le surnageant. Ajouter trois millilitres de milieu endothélial dans les tubes de 15 millilitres. Centrifuger une deuxième fois dans les mêmes conditions qu’auparavant et aspirer le milieu.

Cette deuxième centrifugation permet d'éliminer certains matériaux indésirables, comme les fibres de pipette. Réensemencer les cellules endothéliales dans cinq millilitres de milieu endothélial et mettre les cellules en culture dans un flacon T25 pré-enduit de collagène. En utilisant un flacon par tube de centrifugation, laisser les cellules croître au moins deux à trois jours avant de changer le milieu endothélial.

Cela aide les cellules à se rétablir et à se diviser. Étant donné que le processus d'isolement est assez agressif et que le rendement cellulaire peut être faible, il est essentiel de repiquer les cellules à proximité de la confluence. Puisque l'inhibition par contact pourrait entraîner une transformation cellulaire, les cellules endothéliales peuvent également être isolées à partir d'un côté spécifique.

Pour ce faire, préparez d'abord une boîte de Pétri contenant une ligne de lit de paraffine. Des boîtes de Pétri en verre de 60 millimètres avec du papier d'aluminium. Prévoyez deux boîtes en verre par foliole.

Le papier d'aluminium permet d'éliminer le paraffine afin de réutiliser la boîte de Pétri. Ensuite, placer des billes de paraffine dans les boîtes jusqu'à environ la moitié de leur volume et couvrir pour l'autoclavage. Une fois l'autoclavage terminé et le paraffine fondu, déplacer l'ensemble des boîtes sur une surface plane fraîche.

Lorsque la paraffine refroidit, elle durcit et forme une couche qui supportera les piqûres d'aiguille. Après 60 minutes, la boîte stérilisée peut être utilisée pour immobiliser le tissu valvulaire. Retirer les feuillets isolés de la valve des tubes de 15 millilitres et les placer sur le lit de paraffine.

Manipuler les feuillets de manière à ce que la face ventriculaire soit orientée vers le bas, en contact avec la surface de paraffine, laissant la face fibreuse exposée. Piquer les bords du feuillet afin d'exposer la couche endothéliale. Ensuite, déposer quelques gouttes de collagénase froide sur chaque surface endothéliale orientée vers le haut et incuber le tissu pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius.

Lorsque l'incubation est terminée, retirez délicatement la couche endothéliale comme précédemment en faisant tourner un écouvillon stérile sec sur la surface du feuillet. Tamponnez occasionnellement l'écouvillon dans la solution de collagénase pour détacher les cellules des fibres de l'extrémité. Une fois le prélèvement terminé, la texture de la couche endothéliale doit sembler légèrement plus lisse qu'auparavant.

Prélevez la suspension cellulaire et transférez-la dans un nouveau tube stérile de 15 millilitres. Indiquez la spécificité latérale sur les feuilles d'étiquette : les échantillons provenant de la même valve peuvent être regroupés. Rincez la valve immobilisée à l’aide de quelques gouttes de DPBS froid pour éliminer les cellules ou débris résiduels.

Transférez les feuillets vers une nouvelle boîte de culture de manière à ce que la face ventriculaire soit désormais exposée, puis récupérez les cellules endothéliales comme vient de l'être montré. Une fois le prélèvement des cellules endothéliales effectué sur le feuillet G, placez immédiatement les feuillets dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de solution de collagénase. Lavez les cellules resus, mettez-les en suspension et faites-les croître comme indiqué pour l'isolement non spécifique selon les faces des cellules endothéliales.

Si le rendement cellulaire est très faible, envisagez de passer à un flacon plus petit ou d'utiliser une plaque de culture. Puisque l'adhésion cellule-cellule favorise la croissance cellulaire, pensez à repiquer les cellules à proximité de la confluence. Étant donné que l'inhibition par contact pourrait entraîner une transformation cellulaire, commencez l'isolement des cellules interstitielles pendant la centrifugation des cellules endothéliales et incubez les tubes contenant les feuillets pendant environ 12 à 18 heures.

Dans la solution de collagénase, agiter doucement si désiré. À la fin de la période d'incubation, utiliser une pipette serologique pour mélanger délicatement le tissu digéré jusqu'à ce que la suspension cellulaire devienne homogène. Cette homogénéisation contribue à fragmenter le tissu et à libérer les cellules interstitielles. Centrifuger et laver les cellules comme indiqué pour les cellules endothéliales.

À l'exception de l'utilisation de cinq millilitres de milieu interstitiel resus, suspendez les cellules interstitielles issues de la centrifugation dans 15 millilitres de milieu interstitiel et ensemencez les cellules dans un flacon T75, en utilisant un flacon par tube de centrifugation. Laissez les cellules croître pendant au moins un à deux jours avant de changer le milieu interstitiel, en prévoyant davantage de débris tissulaires qu'avec les cellules endothéliales. De plus, les cellules interstitielles atteignent naturellement la confluence plus rapidement que les cellules endothéliales et offrent des rendements cellulaires plus élevés dans ces images représentatives.

La morphologie des cellules endothéliales valvulaires V Cs cultivées et des cellules interstitielles valvulaires, comparées à celles-ci, est présentée au bout de deux à trois jours. Les BECs présentent une morphologie endothéliale typique dans laquelle les cellules adoptent un motif en pavé et commencent à former des agrégats.

Les VS. présentent une morphologie similaire à celle des myofibroblastes, dans laquelle les cellules sont généralement en forme de fuseau et peu denses lorsqu'elles sont cultivées jusqu'à confluence. Les ECS présentent une morphologie endothéliale typique, dans laquelle les cellules forment un motif en pavés et dont la croissance est inhibée par contact. Les VICS présentent une morphologie similaire à celle des myofibroblastes, dans laquelle les cellules sont généralement en forme de fuseau et ne présentent pas d'inhibition par contact. Les caractéristiques fonctionnelles des VEC et des VIC peuvent être déduites à partir de la coloration. Pour une prise en charge de LDL marquée.

Les cellules VEC sont associées à des taux élevés d'absorption de LDL acétylée. Alors que les cellules VIC sont associées à des taux faibles d'absorption de LDL acétylée, les marqueurs cellulaires des VEC et des VIC sont présentés ici. Les cellules ECS se colorent positivement pour le facteur de von Willebrand, contrairement aux cellules VIC.

Ne pas présenter une coloration du facteur de von Willebrand. De plus, les VCS sont négatives pour l'actine alpha des muscles lisses, tandis que les VCS sont positives pour l'actine alpha des muscles lisses. Eh bien, j'espère que vous avez beaucoup appris grâce à nos isolations d'aujourd'hui.

Il est toutefois important de garder à l'esprit que la membrane basale des cellules endothéliales est très fragile et que toute perturbation de la matrice sous-jacente libère souvent des cellules contaminantes provenant du reste du tissu. Pour confirmer une caractérisation réussie de l'isolement, il est essentiel de CRI évaluer la pureté de vos isolats. Bonne chance.