Name: Évaluer la réponse stomatique à Live cellules bactériennes en utilisant limagerie feuilles entières (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Apprenez à évaluer la réponse stomatique aux bactéries vivantes en utilisant des feuilles intactes et la microscopie à fluorescence. Cette méthode minimise les dommages tissulaires et permet l'observation en temps réel des mouvements des cellules de garde.

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Cette recherche a été soutenue par une subvention du National Institute of Health et l&#39;Université du Texas à Arlington mis en place des fonds à MM.

1. Culture de plantes et bactéries Préparation <ol><li> Pour commencer cette procédure semer des graines d'Arabidopsis sur un v 01:01:01: v: v mélange de milieu de culture (terre, Redi-Plug et mélanger des semis, Sun Gro), la vermiculite fine et de perlite. </li><li> Cultiver les plantes dans une chambre de croissance (22 ° C, 12 heures de lumière de 100 pmol / mm 2 / sec par jour et 65 ± 5% d'humidité) et de l'eau au besoin. Les plantes sont prêtes à utiliser dans 4-6 semaines quand ils ont des jeunes feuilles complètement développées avant boulonnage. </li><li> Deux jours avant de commencer l'expérience de préparer la culture bactérie. Streak Pseudomonas syringae du stock de glycérol sur du milieu LB modifié (10 g / L de tryptone, 5 g / L extrait de levure, 5 g / L de NaCl pH 7,0, et 1,5% de gélose) et incuber pendant 24 heures à 28 ° C. Utilisez culture fraîche pour préparer l'inoculum et commencez toujours des plaques de culture de stocks de glycérol comme des bactéries devient moins virulente après l'Afrique sub-culture. </li><li> Utiliser des bactéries qui poussaient sur ​​la plaque pour démarrer une culture de 10 ml de liquide de P. syringae dans un erlenmeyer de 50 ml. Incuber la culture de la nuit à 28 ° C avec une agitation vigoureuse jusqu'à ce qu'il atteigne la densité optique ou DO à 600 nm entre 0,8 et 1. </li><li> Mesurer la DO à 600 et récolte les cellules par centrifugation à 1360 xg pendant 10 minutes. Resuspendre les cellules dans l'eau distillée de telle sorte que la DO finale est de 0,2. Cette OD correspond à 10 8 unités formant colonie (UFC) / ml. Avec les bactéries prêt, commencer à préparer les feuilles et réaliser le dosage. </li></ol> 2. Coloration Leaf et incubation avec des bactéries <ol><li> Afin de colorer les feuilles d'abord préparer l'iodure de propidium 20 uM ou de la solution PI dans l'eau. 10 ml de solution est suffisante pour colorer les trois petites feuilles à la fois. </li><li> Récupérer les plantes de la chambre de croissance et avec une pince détache trois jeunes, entièrement développé feuilles. Plongez les feuilles entières dans la solution PI pendant 5 minutes. Ensuite, retirer les feuilles et les rincer rapidement à l'eau distillée. </li><li> Ensuite placer une feuille avec la surface inférieure vers le bas sur une lame de microscope. Couper la feuille avec une lame de rasoir en quatre morceaux hors de la veine mi sorte que la feuille à plat sur la diapositive. </li><li> Pour incuber les bactéries avec les feuilles, ajouter 300 ul de suspension bactérienne sous les morceaux de feuilles sur la diapositive. Assurez-vous que la surface inférieure de la feuille est en contact avec l'inoculum. </li><li> Incuber les échantillons dans les mêmes conditions environnementales qui ont été utilisées pour cultiver les plantes. Au moment d'observer les feuilles sous le microscope, le transfert des morceaux de feuilles d'une nouvelle diapositive avec surface inférieure vers le haut. Notez que lamelle n'est pas utilisé lors du montage des lames. L'échantillon même feuille peut être imagée plusieurs fois pendant l'incubation et un cours à temps peut être mis en place en fonction des objectifs de recherche. </li></ol> 3. Analyse au microscope, de mesure et de données <ol><li> Voici un microscope confocal à balayage laser (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc) est utilisée pour examiner les feuilles. Observez la surface inférieure des feuilles pour détecter la fluorescence du PI (excitation 453 nm, émission 543 et 620 nm). </li><li> En utilisant les échantillons de feuilles mêmes de capturer des images de stomates au fil du temps. Enregistrer les images pour mesurer la largeur de l'ouverture des stomates. </li><li> Mesurez la largeur d'ouverture des stomates d'au moins 60 stomates pour chaque traitement à chaque point de l'image en utilisant le navigateur LSM. </li><li> Calculer l'erreur moyenne et standard pour la largeur d'ouverture des stomates. La signification statistique des résultats peut être calculée en utilisant 2-tailed, Student apparié sages t-test. </li></ol> 4. Des images représentatives de réponse stomatique d'incubation avec des bactéries <ol><li> Voici une image typique microscopiques (en utilisant un objectif 20x) d'une surface de la feuille d'Arabidopsis sous microscope confocal à balayage laser en vue champ clair (Figure 1). </li><li> Taches iodure de propidium la paroi cellulaire des cellules viables accroître la visibilité des cellules de garde en plus de permettre l'identification des cellules intactes pour la collecte de données (figure 2). Une gamme d'ouvertures de pores stomatiques peuvent être vus dans ces micrographies, de stomates complètement fermé à la stomates ouverts. </li><li> Stomates complètement fermé sont identifiés par la forme des cellules de garde (figure 3). La largeur d'ouverture est considérée comme 0 um. </li><li> Pour stomates ouverts (figure 4) la largeur d'ouverture affichée est mesurée en utilisant une ligne droite tracée à travers la plus vaste zone du pore stomatique. </li><li> Ces résultats expérimentaux sont typiques de ce dosage stomatique. Arabidopis feuilles ont été incubés dans le noir avec trois différentes souches de Pseudomonas syringae. Seule la bactérie Pst DC3000 a pu ouvrir foncé fermée stomates, telle que mesurée par la largeur d'ouverture de hasard 60 stomates par souche bactérienne (figure 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Micrographie de la surface d'une feuille d'Arabidopsis. Un champ de vision de la surface des feuilles sous microscope confocal à balayage laser (LSCM) en utilisant l'objectif 20x. Notez que l'ouverture des stomates n'est pas aussi évidente par rapport à la vue fluorescentes aidé par coloration iodure de propidium (figure 2). <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Micrographie de la surface d'une feuille d'Arabidopsis iodure de propidium teinté. Un champ de vision de la surface des feuilles sous microscope confocal à balayage laser (LSCM) en utilisant l'objectif 20x. Remarque une gamme d'ouverture des pores stomatiques. Les flèches jaunes sont pointés de fermer complètement les stomates et les flèches vertes sont pointés aux stomates ouverts. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Complètement stomates se ferment identifié par la forme de l'ouverture et entre les cellules de garde. La largeur d'ouverture est considérée comme 0 um. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Stomates ouverts montrant la largeur d'ouverture en um. Les mesures ont été prises par l'aide du navigateur LSCM basé sur une ligne droite tirée à travers la plus vaste zone du pore stomatique. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. L'ouverture des stomates des feuilles d'Arabidopsis incubées avec trois souches de Pseudomonas syringae pv tomate:.. DC3118, DB29, et DC3000 Les plantes ont été maintenus dans l'obscurité pendant le temps de l'expérimentation. Les résultats sont présentés comme la moyenne (n = 50-70) ± erreur standard. La signification statistique a été détecté avec deux queues de Student t-test. L'expérience a été répétée trois fois avec des résultats similaires.

<ol><li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatagiri%2C+F+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).</li>
<li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li>
<li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li>
</ol>

Nous avons présenté une procédure simple pour mesurer l&#39;ouverture des stomates dans les tissus foliaires intacte permettant une évaluation facile de la réponse stomatique à différents traitements. Bien que nous ayons présenté des résultats en utilisant le système modèle Arabidopsis / Pseudomonas syringae, le dosage des feuilles intactes stomatique peut être potentiellement réalisée avec n&#39;importe quelle combinaison de plantes bactérie. Le protocole peut être facilement modifié pour s&#39;adapter aux exigences de croissance des autres plantes et les bactéries pathogènes. Le principe général et la procédure reste la même. En outre, cette méthode peut être bénéfique pour les chercheurs qui désirent étudier sortie fonctionnelle des cellules de garde non seulement de vivre les microbes, mais aussi à d&#39;autres stimuli et des agents chimiques dans des conditions qui maintiennent l&#39;environnement naturel de la feuille. Feuilles entières peuvent être difficiles à l&#39;image due à son épaisseur et sa topographie irrégulière. Ce problème peut être atténué par la suppression de la nervure médiane de la feuille de sorte qu&#39;elle repose à plat sur la lame et en utilisant la microscopie confocale. Toutefois, d&#39;autres types de microscope à fluorescence peut être utilisée pour obtenir des images haute résolution de la surface des feuilles.

<table><tbody><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-1</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Difco Laboratories</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR international</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio Express</td><td>J637-2500G</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de croissance végétale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur agitateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluer la réponse stomatique à live cellules bactériennes en utilisant l&#39;imagerie feuilles entières

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Les stomates sont des ouvertures naturelles dans l&#39;épiderme des plantes responsables de l&#39;échange gazeux entre l&#39;intérieur des plantes et environnement. Ils sont formés par une paire de cellules de garde, qui sont capables de fermer les pores stomatiques en réponse à un certain nombre de facteurs externes, y compris l&#39;intensité lumineuse, la concentration de dioxyde de carbone, et l&#39;humidité relative (HR). Les pores des stomates est aussi la principale voie d&#39;entrée des pathogènes dans les feuilles, une étape cruciale pour le développement de la maladie. De récentes études ont dévoilé que la fermeture du pore est efficace pour minimiser le développement de maladies bactériennes dans des plantes d&#39;Arabidopsis, une partie intégrante de l&#39;immunité innée des plantes. Auparavant, nous avons utilisé les peelings épiderme pour évaluer la réponse des stomates à vivre des bactéries (Melotto et al 2006.), Mais le maintien de conditions environnementales favorables pour les peelings plantes fois l&#39;épiderme et des cellules bactériennes a été difficile. Épiderme des feuilles peut être gardé en vie et en bonne santé avec du tampon MES (10 mM de KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6,15) pour des expériences électrophysiologiques des cellules de garde. Cependant, ce buffer n&#39;est pas appropriée pour l&#39;obtention d&#39;une suspension bactérienne. D&#39;autre part, les cellules bactériennes peuvent être maintenues en vie dans l&#39;eau qui n&#39;est pas appropriée pour maintenir les peelings épiderme pour une longue période de temps. Quand une flotte Peel épidermiques sur l&#39;eau, les cellules de la peau qui sont exposées à l&#39;air sec dans les 4 heures en limitant le moment de mener l&#39;expérience. Une méthode idéale pour évaluer l&#39;effet d&#39;un stimulus particulier sur les cellules de garde doit présenter un minimum d&#39;interférence à la physiologie des stomates et à l&#39;environnement naturel de la plante autant que possible. Nous avons donc développé une nouvelle méthode pour évaluer la réponse des stomates à vivre dans laquelle les bactéries en blessant des feuilles et la manipulation sont grandement minimisés visant à fournir un test facilement reproductible et fiable des stomates. Le protocole est basé sur la coloration des feuilles intactes avec de l&#39;iodure de propidium (PI), l&#39;incubation de la coloration des feuilles avec une suspension bactérienne, et l&#39;observation des feuilles sous microscope confocal à balayage laser. Enfin, cette méthode permet l&#39;observation de l&#39;échantillon de feuille vivent même sur de longues périodes de temps en utilisant des conditions qui simulent étroitement les conditions naturelles dans lesquelles les plantes sont attaquées par des agents pathogènes.

Nous avons développé un protocole simple et reproductible pour accéder à la réponse stomatique bactéries vivantes. Cette méthode minimise blessant et la manipulation de la feuille par rapport à l&#39;utilisation des pelures épidermiques rapportés précédemment.

Évaluer la réponse stomatique à Live cellules bactériennes en utilisant l&#39;imagerie feuilles entières

Les stomates sont des ouvertures naturelles de l'épiderme végétal responsables des échanges gazeux entre l'intérieur de la plante et l'environnement. Ils sont formés par une paire de...

Dans cette procédure, l'imagerie foliaire est utilisée pour évaluer le mouvement des cellules de garde en réponse à des cellules bactériennes vivantes. Premièrement, les bactéries sont repiquées à partir d'un stock de glycérol et un inoculum est préparé. Ensuite, des feuilles jeunes et saines sont récoltées et colorées avec de l'iodure de propidium.Les feuilles colorées sont découpées et les morceaux de feuille sont incubés à la surface d'une suspension bactérienne. Enfin, la surface de la feuille est observée au microscope et les ouvertures stomatiques peuvent être mesurées. Les résultats obtenus à l'aide de la microscopie à fluorescence montrent des modifications de l'ouverture stomatique en réponse aux bactéries.Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation de pelures épidermiques, est que la feuille en contact avec les bactéries reste intacte, ce qui imite les conditions naturelles de pénétration bactérienne dans les feuilles. Pour commencer cette procédure, placez des graines d'Arabidopsis sur un mélange, en volume égal, de milieu de culture et de vermiculite. Faites pousser les plantes en chambre de croissance et arrosez selon les besoins.Les plantes sont prêtes à être utilisées au bout de quatre à six semaines, lorsqu'elles présentent des feuilles jeunes et complètement développées, avant la montée en graine. Deux jours avant le début de l'expérience, préparer la culture bactérienne par striation. Inoculer *Pseudomonas syringae* à partir du stock en glycérol sur un milieu LB modifié, et incuber pendant 24 heures à 28 degrés Celsius.Utilisez une culture fraîche pour préparer l'inoculum et démarrez toujours les boîtes de culture à partir de stocks glycérolés. Comme les bactéries deviennent moins virulentes après sous-culture, utilisez des bactéries ayant poussé sur la boîte pour initier une culture liquide de 10 millilitres de pseudomona singe. Dans un flacon erlenmeyer de 50 millilitres, incubez la culture toute la nuit à 28 degrés Celsius avec agitation vigoureuse jusqu'à ce qu'elle atteigne une densité optique ou od à 600 nanomètres comprise entre 0,8 et 1.Mesurer la DO à 600 et récolter les cellules par centrifugation à 1 360 ×g pendant 10 minutes. Resuspendre les cellules dans de l'eau distillée de manière à obtenir une DO finale de 0,2. Cette DO correspond à 10⁸ unités formant colonies par millilitre.Avec les bactéries prêtes, procédez à la préparation des feuilles et réalisez le test afin de colorer les feuilles. Préparez d'abord une solution de propidium iodure, ou PI, à 20 micromolaire dans de l'eau. Un volume de 10 millilitres de solution suffit pour colorer trois petites feuilles à la fois.Retirez les plantes de la chambre de croissance et, à l’aide de pinces, détachez trois jeunes feuilles complètement déployées. Immergez entièrement les feuilles dans la solution de PI pendant cinq minutes. Ensuite, retirez les feuilles et rincez-les brièvement avec de l’eau distillée.Ensuite, placez une feuille avec la face inférieure tournée vers le bas sur une lame de microscope. Coupez la feuille en quatre morceaux à l’aide d’un scalpel bien aiguisé, en excluant la nervure médiane afin que la feuille repose à plat sur la lame pour incuber les bactéries avec les feuilles. Ajoutez 300 microlitres de suspension bactérienne sous les morceaux de feuille sur la lame, en veillant à ce que la face inférieure de la feuille soit en contact avec l’inoculum.Incubez les échantillons dans les mêmes conditions environnementales que celles utilisées pour la culture des plantes. Au moment d'observer les feuilles au microscope, transférez les morceaux de feuille sur une nouvelle lame en positionnant la face inférieure vers le haut. Notez qu'un couvre-objet n'est pas utilisé lors de la préparation des lames.Le même échantillon de feuille peut être imagé plusieurs fois pendant l'incubation, et un cours temporel peut être établi selon les objectifs de la recherche. Ici, un microscope confocal à balayage laser est utilisé pour examiner les feuilles, observer la surface inférieure des feuilles afin de détecter la fluorescence du PI en utilisant les mêmes échantillons de feuille, et acquérir des images des stomates au fil du temps. Enregistrez les images pour mesurer la largeur de l'ouverture stomatique.Mesurez la largeur de l'ouverture stomatique d'au moins 60 stomates pour chaque traitement à chaque point temporel. À l'aide du navigateur d'images LSM, calculez la moyenne et l'erreur type de la largeur de l'ouverture stomatique. La signification statistique des résultats peut être calculée à l'aide d'un test t de Student apparié bilatéral.Voici une image microscopique typique de la surface d'une feuille d'arabidopsis observée au microscope confocal à balayage laser. En vision champ clair, l'iodure de propidium colore la paroi cellulaire des cellules viables, augmentant ainsi la visibilité des cellules gardiennes tout en permettant l'identification des cellules non endommagées. Une gamme d'ouvertures stomatiques peut être observée sur ces micrographies, allant du stomate complètement fermé au stomate largement ouvert.Les stomates complètement fermés sont identifiés par la forme des cellules gardiennes. La largeur de l'ouverture est considérée comme étant de zéro micromètre pour les stomates ouverts. La largeur d'ouverture indiquée est mesurée à l'aide d'une ligne droite tracée sur la zone la plus large du pore stomatique.Il s'agit de résultats expérimentaux typiques du test d'inoculation sur feuilles vivantes. Des feuilles d'Arabidopsis ont été incubées à l'obscurité avec trois souches différentes de Pseudomonas Cy Ringe ; seule la bactérie P-S-T-D-C 3000 a été capable d'ouvrir les stomates fermés à l'obscurité, comme mesuré par la largeur de l'ouverture de 60 stomates sélectionnés aléatoirement par souche bactérienne. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des interactions entre plantes et bactéries pour explorer les mécanismes de réponse précoce aux agents pathogènes chez les espèces végétales.

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