Évaluer la réponse stomatique à Live cellules bactériennes en utilisant l'imagerie feuilles entières

Dans cette procédure, l'imagerie foliaire est utilisée pour évaluer le mouvement des cellules de garde en réponse à des cellules bactériennes vivantes. Premièrement, les bactéries sont repiquées à partir d'un stock de glycérol et un inoculum est préparé. Ensuite, des feuilles jeunes et saines sont récoltées et colorées avec de l'iodure de propidium.

Les feuilles colorées sont découpées et les morceaux de feuille sont incubés à la surface d'une suspension bactérienne. Enfin, la surface de la feuille est observée au microscope et les ouvertures stomatiques peuvent être mesurées. Les résultats obtenus à l'aide de la microscopie à fluorescence montrent des modifications de l'ouverture stomatique en réponse aux bactéries.

Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation de pelures épidermiques, est que la feuille en contact avec les bactéries reste intacte, ce qui imite les conditions naturelles de pénétration bactérienne dans les feuilles. Pour commencer cette procédure, placez des graines d'Arabidopsis sur un mélange, en volume égal, de milieu de culture et de vermiculite. Faites pousser les plantes en chambre de croissance et arrosez selon les besoins.

Les plantes sont prêtes à être utilisées au bout de quatre à six semaines, lorsqu'elles présentent des feuilles jeunes et complètement développées, avant la montée en graine. Deux jours avant le début de l'expérience, préparer la culture bactérienne par striation. Inoculer *Pseudomonas syringae* à partir du stock en glycérol sur un milieu LB modifié, et incuber pendant 24 heures à 28 degrés Celsius.

Utilisez une culture fraîche pour préparer l'inoculum et démarrez toujours les boîtes de culture à partir de stocks glycérolés. Comme les bactéries deviennent moins virulentes après sous-culture, utilisez des bactéries ayant poussé sur la boîte pour initier une culture liquide de 10 millilitres de pseudomona singe. Dans un flacon erlenmeyer de 50 millilitres, incubez la culture toute la nuit à 28 degrés Celsius avec agitation vigoureuse jusqu'à ce qu'elle atteigne une densité optique ou od à 600 nanomètres comprise entre 0,8 et 1.

Mesurer la DO à 600 et récolter les cellules par centrifugation à 1 360 ×g pendant 10 minutes. Resuspendre les cellules dans de l'eau distillée de manière à obtenir une DO finale de 0,2. Cette DO correspond à 10⁸ unités formant colonies par millilitre.

Avec les bactéries prêtes, procédez à la préparation des feuilles et réalisez le test afin de colorer les feuilles. Préparez d'abord une solution de propidium iodure, ou PI, à 20 micromolaire dans de l'eau. Un volume de 10 millilitres de solution suffit pour colorer trois petites feuilles à la fois.

Retirez les plantes de la chambre de croissance et, à l’aide de pinces, détachez trois jeunes feuilles complètement déployées. Immergez entièrement les feuilles dans la solution de PI pendant cinq minutes. Ensuite, retirez les feuilles et rincez-les brièvement avec de l’eau distillée.

Ensuite, placez une feuille avec la face inférieure tournée vers le bas sur une lame de microscope. Coupez la feuille en quatre morceaux à l’aide d’un scalpel bien aiguisé, en excluant la nervure médiane afin que la feuille repose à plat sur la lame pour incuber les bactéries avec les feuilles. Ajoutez 300 microlitres de suspension bactérienne sous les morceaux de feuille sur la lame, en veillant à ce que la face inférieure de la feuille soit en contact avec l’inoculum.

Incubez les échantillons dans les mêmes conditions environnementales que celles utilisées pour la culture des plantes. Au moment d'observer les feuilles au microscope, transférez les morceaux de feuille sur une nouvelle lame en positionnant la face inférieure vers le haut. Notez qu'un couvre-objet n'est pas utilisé lors de la préparation des lames.

Le même échantillon de feuille peut être imagé plusieurs fois pendant l'incubation, et un cours temporel peut être établi selon les objectifs de la recherche. Ici, un microscope confocal à balayage laser est utilisé pour examiner les feuilles, observer la surface inférieure des feuilles afin de détecter la fluorescence du PI en utilisant les mêmes échantillons de feuille, et acquérir des images des stomates au fil du temps. Enregistrez les images pour mesurer la largeur de l'ouverture stomatique.

Mesurez la largeur de l'ouverture stomatique d'au moins 60 stomates pour chaque traitement à chaque point temporel. À l'aide du navigateur d'images LSM, calculez la moyenne et l'erreur type de la largeur de l'ouverture stomatique. La signification statistique des résultats peut être calculée à l'aide d'un test t de Student apparié bilatéral.

Voici une image microscopique typique de la surface d'une feuille d'arabidopsis observée au microscope confocal à balayage laser. En vision champ clair, l'iodure de propidium colore la paroi cellulaire des cellules viables, augmentant ainsi la visibilité des cellules gardiennes tout en permettant l'identification des cellules non endommagées. Une gamme d'ouvertures stomatiques peut être observée sur ces micrographies, allant du stomate complètement fermé au stomate largement ouvert.

Les stomates complètement fermés sont identifiés par la forme des cellules gardiennes. La largeur de l'ouverture est considérée comme étant de zéro micromètre pour les stomates ouverts. La largeur d'ouverture indiquée est mesurée à l'aide d'une ligne droite tracée sur la zone la plus large du pore stomatique.

Il s'agit de résultats expérimentaux typiques du test d'inoculation sur feuilles vivantes. Des feuilles d'Arabidopsis ont été incubées à l'obscurité avec trois souches différentes de Pseudomonas Cy Ringe ; seule la bactérie P-S-T-D-C 3000 a été capable d'ouvrir les stomates fermés à l'obscurité, comme mesuré par la largeur de l'ouverture de 60 stomates sélectionnés aléatoirement par souche bactérienne. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des interactions entre plantes et bactéries pour explorer les mécanismes de réponse précoce aux agents pathogènes chez les espèces végétales.