Estimation des taux de production de virus dans les systèmes aquatiques

L'objectif général de cette procédure est de déterminer le taux de production des virus dans les communautés microbiennes aquatiques. Cela est réalisé en réduisant d'abord l'abondance des virus libres dans l'échantillon d'intérêt, tout en préservant la communauté microbienne native. La deuxième étape de la procédure consiste à incuber des échantillons dans des conditions induisant une activité virale et à prélever des sous-échantillons toutes les deux à trois heures pendant une période maximale de 10 heures.

La troisième étape de la procédure consiste à dénombrer les virus présents dans les sous-échantillons recueillis à chaque point temporel. La dernière étape de la procédure est de déterminer le taux d'augmentation de l'abondance des particules virales dans l'échantillon et d'évaluer les taux de production virale. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les taux de production des virus au sein de la communauté microbienne à partir des dénombrements, permettant aux chercheurs d'inférer les taux de mortalité microbienne dus à l'activité virale.

Bonjour à tous. Je m'appelle Audrey Madison, et je travaille au laboratoire du Dr Steven Milham et au Département de microbiologie de l'Université du Tennessee. Aujourd'hui, avec l'aide de Charles Budoff et de Claire Campbell, nous allons vous montrer une procédure permettant d'analyser les taux de production des virus dans les systèmes aquatiques.

Pour ce faire, nous réduisons le nombre de virus libres dans les échantillons et quantifions la fréquence à laquelle ils réapparaissent suite à la lyse de micro-organismes infectés par des virus. Nous utilisons actuellement cette procédure dans notre laboratoire afin d'étudier l'écologie des virus et leur rôle potentiel dans la structuration des communautés microbiennes. Maintenant que nous avons présenté cette méthode, passons sans plus tarder à sa mise en œuvre.

Avant de commencer cette procédure, collectez environ 20 litres d'eau de mer de manière aussi aseptique que possible. Une fois l'échantillon prélevé, filtrez préalablement l'eau à l'aide d'un filtre de 142 millimètres de diamètre et de 0,8 micron. Pour les systèmes biologiquement productifs, on peut préalablement effectuer une filtration à l'aide d'un filtre à pores plus larges ou en fibre de verre.

Pour obtenir de l'eau ultrafiltrée, mettez en place un système d'ultrafiltration tel que le système AmCon M 12 équipé d'une cartouche de membrane enroulée en spirale afin d'éliminer tous les virus. Les virus présents dans l'échantillon sont alors retirés et concentrés à environ 25 % de la vitesse maximale avec une pression rétrograde de 15 à 16 kilopascals. Le rétentionat, d'environ 500 millilitres, contient la communauté virale désormais concentrée, qui peut être conservée pour d'autres études, tandis que le perméat dépourvu de virus sera utilisé pour les dosages de production virale.

Après chaque journée d'utilisation, nettoyez le système Omicron M 12 afin d'éviter d'endommager la membrane de la cartouche de filtration. Lorsque vous travaillez avec de l'eau de mer, rincez la membrane avec au moins six litres d'eau Milli Q, puis effectuez un lavage avec une solution d'hydroxyde de sodium 0,1 molaire pendant 30 à 45 minutes. Rincez ensuite la cartouche avec au moins six autres litres d'eau Milli Q.

Lorsqu'il est terminé, le cartouche spiralé peut être conservé dans une solution d'acide phosphorique 0,05 molaire à quatre degrés Celsius. Pour commencer la méthode de réduction virale, 500 millilitres d'échantillon d'eau de mer provenant du même endroit que notre eau sans virus sont placés dans une unité de filtration stérile équipée d'un filtre à faible liaison aux protéines, dont la taille nominale des pores est de 0,2 micromètre. À ce stade, prélève également un sous-échantillon afin de déterminer l'abondance totale des virus et des bactéries dans l'eau initiale.

Appuyez doucement sur la pression du vide à moins de 200 millimètres de mercure tout en resuspendant continuellement l'échantillon à l'aide d'une pipette de transfert stérile afin d'empêcher les cellules bactériennes de se concentrer sur le filtre. Ajoutez lentement trois volumes de 500 millilitres de l'ultrafiltrat à la suspension bactérienne pour réduire l'abondance des virus libres dans l'échantillon tout en maintenant les populations bactériennes à une densité constante. Enfin, diluez la fraction bactérienne jusqu'à un volume final de 500 millilitres avec de l'eau ultrafiltrée exempte de virus. Ensuite, divisez-la en trois réplicats de 150 millilitres et placez les réplicats dans des bouteilles en polycarbonate transparentes de 250 millilitres.

Ceci représente votre jeu d'échantillons au temps zéro. Prélevez des échantillons pour l'estimation de l'abondance bactérienne et virale à partir de vos échantillons au temps zéro. Transférez les échantillons dans des tubes cryogéniques avec une concentration finale de 2,0 à 2,5 % de glutaraldéhyde stérile.

En tant qu'agent de fixation, congeler immédiatement ces échantillons par trempe à l'azote liquide et les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur traitement. Alternativement, un système d'écoulement tangentiel peut être utilisé pour concentrer les microbes marins. Pour utiliser la méthode de filtration tangentielle (TFF), prélever environ 500 millilitres de l'échantillon naturel.

Concentrez cet échantillon à l’aide d’un système de filtration tangentielle dont la taille nominale des pores est de 0,2 micron, jusqu’à ce que la fraction bactérienne soit réduite à environ 10 à 15 millilitres dans de l’eau ultrafiltrée exempte de virus, comme décrit pour la méthode de réduction virale, puis incubez les bouteilles résultantes dans des conditions in situ. À l’aide de chambres environnementales en mer, nous utilisons des incubateurs alimentés par de l’eau de mer en circulation, raccordés à une source d’eau de surface qui maintient des températures ambiantes. Les niveaux de lumière peuvent être ajustés pour correspondre aux conditions en surface en utilisant un acrylique teinté en bleu ou un filet filtrant de densité neutre afin de réduire l’intensité lumineuse.

Lorsqu'on travaille à partir d'une station de terrain ou d'un laboratoire, ou lorsqu'il n'est pas possible d'obtenir de l'eau de mer, on peut utiliser un incubateur de croissance éclairé. Continuer à prélever des sous-échantillons toutes les 2,5 heures pendant au moins 10 heures selon la méthode utilisée pour l'échantillon à temps zéro. En plus des échantillons destinés à la microscopie, certains chercheurs souhaiteront prélever de l'eau pour une analyse par PCR quantitative de virus spécifiques.

Pour les échantillons de PCR quantitative, ajouter cinq millilitres de l'échantillon dans un flacon cryogénique sans agent fixateur et congeler immédiatement par trempe dans de l'azote liquide en vue de la production virale. Décongeler les échantillons congelés sur de la glace et préparer fraîchement les solutions comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, placer un filtre en disque de 25 millimètres de diamètre et de 0,02 micron de taille de pore sur un filtre de soutien cellulosique de 0,45 micron. Puis ajouter 850 microlitres de l'échantillon fixé sur le dessus du filtre Anadi et appliquer une aspiration sous vide inférieure à 20 kilopascals jusqu'à complète dessiccation.

Une fois que le filtre à disque ano est sec, pipetez 100 microlitres de solution working de cyber green dans une boîte de Pétri stérile. Puis, sous vide toujours activé, retirez soigneusement le disque ano de la tour de filtration et placez-le sur le cyber green. Incubez les échantillons à l'abri de la lumière, à température ambiante, pendant 20 minutes.

Retirez délicatement le filtre de la solution au vert cyber et absorbez l'excès de colorant à l'arrière du filtre à l'aide d'un essuie-tout Kim. Ajoutez ensuite une petite goutte de solution Antifa sur une lame de microscope et posez une lamelle par-dessus. Retirez la lamelle et ajoutez le filtre desséché sur la lame de microscope.

À nouveau, ajoutez une petite quantité de solution Antifa sur la lame couvre-objet et placez-la lentement sur le filtre, en veillant à éliminer toute bulle pouvant se former. Dénombrer les virus par microscopie à fluorescence avec un filtre bleu large, en comptant au moins 20 champs pour chaque filtre, en s'assurant de quantifier le nombre total de virus de chaque champ de la grille afin de garantir une répartition uniforme des virus sur la membrane du filtre. Calculez les taux moyens de réapparition virale à partir des trois réplicats indépendants et déterminez l'écart type des taux de production. Enfin, corrigez ces taux en tenant compte de la dilution des micro-organismes, depuis l'abondance initiale jusqu'à l'abondance diluée dans l'échantillon appauvri en virus.

L'ensemble de données principal résultant de cette étude correspond aux taux de récurrence de l'abondance virale dans les sous-échantillons provenant des incubations. Ces résultats constituent des régressions indépendantes de l'abondance virale en fonction du temps pour chacun des échantillons. La production de particules de type viral a été suivie pendant une incubation de 10 heures dans des conditions en mer à l’aide de la microscopie par fluorescence en épifluorescence.

Ces échantillons ont été prélevés lors d'une floraison de phytoplancton au large des côtes de la Nouvelle-Zélande en septembre 2008. Nous venons de vous montrer comment estimer les taux de production virale. Cela inclut l'utilisation de différents systèmes d'ultrafiltration et la réalisation d'expériences visant à mesurer les taux de production virale.

De plus, nous vous avons montré comment dénombrer ces virus par microscopie en épifluorescence. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous rappeler d'utiliser un matériel propre, de manipuler les virus marqués, de réduire l'exposition à la lumière, de traiter rapidement vos échantillons et de nettoyer correctement vos cartouches d'ultrafiltration après chaque utilisation. Voilà donc tout ce qu'il faut savoir.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.