Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à l'aide d'un vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les cellules positives au VIH à l'aide d'un vecteur lentiviral dépendant de la protéine Rev du VIH-1 et portant la protéine fluorescente verte. Cela est réalisé en produisant d'abord des particules lentivirales dépendantes de Rev par transfection concomitante. La deuxième étape de la procédure consiste à infecter des cellules T CD4 humaines avec le VIH-1.

Ensuite, les cellules T CD4 humaines positives pour le VIH sont superinfectées par les particules lentivirales portant le gène GFP. La dernière étape consiste à identifier les cellules positives pour le VIH en mesurant les cellules positives pour GFP par cytométrie en flux. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant le pourcentage de cellules positives pour GFP par cytométrie en flux.

Les implications de cette technique s'étendent au traitement de l'infection par le VIH, car le vecteur dépendant de Rev peut également délivrer et exprimer de façon sélective des gènes thérapeutiques dans les cellules infectées par le VIH afin d'induire la mort des cellules positives au VIH. La procédure sera démontrée par Gi, professeur adjoint de recherche de notre laboratoire. Pour produire des particules lentivirales dépendantes de Rev, des cellules HEK 293T sont transfectées avec trois plasmides : le vecteur lentiviral GFP dépendant de Rev, le construct d'emballage du VIH-1 et un plasmide portant la glycoprotéine VSV-G. Un jour avant le transfection, ensemencer deux fois 10 puissance six cellules HEK 293T dans 10 millilitres de milieu.

Dans une boîte de Pétri de 100 millimètres, faire croître les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, remplacer le surnageant des cellules par cinq millilitres de milieu frais.

Ensuite, poursuivre la culture des cellules pendant quatre heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Préparer les réactifs de transfection avant la fin de l'incubation de quatre heures. Les cellules HEK 293T seront transfectées avec les trois plasmides selon un ratio de 10 microgrammes de vecteur lentiviral GFP dépendant de Rev, 7,5 microgrammes de construct d'emballage du VIH-1 et 2,5 microgrammes de glycoprotéine VSVG.

Pré-mélangez d'abord les trois ADN plasmidiques selon le ratio souhaité. Préparez ensuite deux tubes en polystyrène de cinq millilitres. Ajoutez 480 microlitres de tampon HBS deux fois concentré dans le premier tube et dans le second tube.

Ajouter 60 microlitres de tampon de chlorure de calcium à deux molar aux ADN plasmatiques et au tampon de transfection, pour un volume total de 480 microlitres. Ensuite, ajouter le mélange d'ADN plasmatique et de chlorure de calcium. Goutte à goutte, dans le tube HPS deux fois, puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Un précipité fin apparaîtra progressivement. Ajoutez maintenant les 960 microlitres du mélange goutte à goutte à l’aide d’une pipette aux cellules HEK 2 9 3 T. Incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant toute la nuit.

Le lendemain, retirez le surnageant S et ajoutez 10 millilitres de milieu frais. Incubez les cellules à nouveau à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit. À 48 heures post-transfection, récoltez le virus en éliminant le surnageant et en le transférant dans un tube stérile de 50 millilitres.

Ajoutez 10 millilitres de milieu frais dans la boîte de Pétri et poursuivez la culture pendant la nuit. Conservez le virus en position supine à quatre degrés Celsius. Poursuivez la récolte à 72 heures post-transfection en collectant le surnageant SUP et en le combinant avec le surnageant récolté précédemment.

Ensuite, centrifuger le surnageant S à 500 × g pendant 15 minutes pour former un culot et éliminer les débris cellulaires. Après la centrifugation, récupérer le surnageant S et le transférer dans un nouveau tube. Puis filtrer le surnageant à travers un filtre Millipore de 0,22 micromètre.

Le virus sera davantage concentré à l’aide d’une colonne de filtration par gel, dont la démonstration suivante illustre la concentration des particules virales. Chargez le surnageant viral sur une colonne de filtration par gel et centrifugez à 6 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Récupérez le surnageant viral concentré, en mettant de côté environ 100 microlitres pour la détermination du titre viral.

Aliquotez le reste et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. La détermination du titre viral est l'un des aspects les plus critiques de cette procédure. Une multiplicité de contamination plus élevée est nécessaire pour une surinfection de cellules avec le vecteur viral GFP.

Afin d'obtenir un pourcentage de cellules positives pour la GFP détectables par cytométrie en flux pour déterminer le titre viral, une lignée cellulaire de chat positive pour le VIH-1 traitée à la TNF sera infectée avec le surnageant viral. Ces cellules positives pour le VIH-1 sont cultivées.

Dans une plaque de 96 puits, à 2,5 × 10⁵ cellules par millilitre, pour un volume total de 100 microlitres. Préparez six dilutions sérielles dix fois décroissantes des particules lentivirales dépendantes de Rev pour infecter les cellules positives pour le VIH-1 ; ajoutez 100 microlitres de chaque dilution sérielle du virus dans chaque puits contenant des cellules. Incubez pendant sept jours dans une étuve à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.

Le titrage des particules est estimé en observant les cellules positives pour la GFP au microscope à fluorescence. Les calculs sont effectués selon la méthode de Reid et MU, et le titre est déterminé comme le point de dilution permettant d'obtenir des puits positifs pour la GFP. Dans 50 % des puits infectés jusqu'au stade IV, on observe des cellules positives avec les particules lentivirales dépendantes de Rev.

Une lignée de cellules T CD quatre humaines sera d'abord infectée par le VIH-1. Nous utilisons deux fois 10 à la puissance cinq cellules pour chaque infection. Deux heures avant l'infection.

Ajouter du polybrain aux cellules pour obtenir une concentration finale de quatre microgrammes par millilitre. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, infecter les cellules en déposant la solution de VIH dans l'un des tubes de cinq millilitres.

Les deux autres tubes de cellules ne sont pas infectés et serviront de témoins. Incuber toutes les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, centrifuger les cellules à 300 ×g pendant 10 minutes, éliminer le virus en phase libre en jetant le surnageant et resuspendre les cellules dans un milieu frais à une concentration de 2 × 10⁵ cellules par millilitre de culture à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après 48 heures, les cellules infectées par le VIH sont prêtes à être infectées. Avec les particules lentivirales dépendantes de Rev, utilisez deux fois 10 à la puissance cinq cellules pour l'infection avec 100 microlitres de particules lentivirales ajoutés aux cellules humaines CD4 T infectées par le VIH V1 comme contrôle ; les cellules humaines CD4 T non infectées par le VIH V1 sont également infectées avec 100 microlitres de particules lentivirales. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit et le jour suivant.

Remplacez le milieu usé par du milieu frais et resuspendez les cellules à une concentration de deux fois 10 puissance cinq cellules par millilitre. 48 heures après l'infection, récupérez les cellules par centrifugation, puis resuspendez-les dans 500 microlitres de paraformaldéhyde à 1 % ; transférez les cellules resuspendues dans un tube de cytométrie en flux pour analyse par cytométrie en flux. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, les cellules peuvent être analysées sur un analyseur FACS pour détecter la positivité au GFP.

Si les expériences sont correctement réalisées, le vecteur lentiviral dépendant de Rev V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A permettra la détection hautement spécifique du VIH en cours de réplication dans des populations cellulaires vivantes, par mesure de l'expression de la protéine fluorescente verte GFP. Dans cet exemple, les cellules C-E-M-S-S récoltées ont été marquées avec un anticorps monoclonal de rat marqué au PE dirigé contre la molécule murine CD 24 HSA, puis analysées en cytométrie en flux pour l'expression de HSA et de GFP, comme illustré ici. Une population GFP importante a été détectée dans les cellules infectées par le VIH-1 et superinfectées avec V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.

En revanche, aucune cellule positive pour la GFP n’a été détectée ni dans les cellules C-E-M-S-S non infectées par le VIH V sans surinfection lentivirale, ni dans les cellules non infectées par le VIH-1 avec surinfection lentivirale. N’oubliez pas que le travail avec le VIH peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le respect des niveaux de biosécurité par des pratiques appropriées doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.