Name: Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à laide dun vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Découvrez le marquage spécifique des cellules VIH-1 positives à l'aide d'un vecteur lentiviral Rev-dépendant exprimant la GFP. Cette méthode permet d'identifier l'infection par cytométrie en flux et ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement du VIH.

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Le travail a été soutenu en partie par Service de santé publique accorde 1R01AI081568 du NIAID à YW et par les dons généreux des donateurs et des cavaliers du Carrousel 2009 NYCDC sida organisée par M. Rosen et Day2 Inc

1. La transfection de plasmides pour la production des particules Rev-dépendante lentiviraux Mettre en place: Le Rev-dépendante GFP lentiviraux vecteur, PNL-GFP-RRE-SA, a été décrit précédemment 4,5,6. Pour assembler dans une particule virale, le plasmide a été contransfected dans les cellules HEK293 T avec le VIH-1 construit emballage, pCMVΔ8.2 (aimablement fourni par le Dr Didier Trono), et un plasmide portant la glycoprotéine de VSV-G (pHCMV-G) . La transfection a été réalisée en utilisant la méthode au phosphate de calcium. Préparation des tampons: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) a été préparée en dissolvant 5 g de Hepes, 8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 1 g de dextrose, 0,103 g de Na 2 HPO 4 (anhydre) dans 100 ml de H 2 O. Aliquoter the10 X tampon HBS en aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C. Au moment de la transfection, de convertir les 10 X 2 X pour HBS HBS avec H 2 O (1: 5 dilution), et ajuster le pH entre 7.5 à 7.12. (Pour 10 ml de HBS 2 X, il faut habituellement environ 50 uL de NaOH 1M). Stériliser par filtration le tampon HBS 2X en passant par un filtre Millipore 0,22 um. CaCl 2 tampon a été faite en dissolvant CaCl 2 dans 10 mM Hepes à une concentration finale 2M. Ajuster le pH à 5,8, stériliser par filtration le tampon et stocker à 4 ° C. Procédure: <ol><li> Un jour avant la transfection, les graines de 2 x 10 6 cellules HEK293T dans un 100 mm boîte de Petri, et cultiver des cellules pendant la nuit dans 10 ml de FBS DMEM + 10% à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Le lendemain, retirer le surnageant des cellules et la remplacer par 5 ml DMEM frais FBS + 10%, les cellules de culture en continu pendant 4 heures. </li><li> Dans un tube en polystyrène de 5 mL, ajouter 480 uL du tampon HBS 2X. </li><li> Dans un deuxième tube de 5 ml en polystyrène, ajouter 60 uL 2M CaCl 2 tampon, l'ADN plasmidique, et la transfection de tampon TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) à un volume total de 480 ul. Pour chaque boîte de Petri, les plasmides devrait être ajouté dans le rapport de 10 ug de PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 ug d'pCMVΔR8.3, et 2,5 mg de pHCMV-G. </li><li> Ajouter l'ADN plasmidique-CaCl2 mélange goutte à goutte au tube 2 X HBS, et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Un fin précipité se forme. </li><li> Ajoutez les 960 uL du mélange goutte à goutte à la pipette pour les cellules. Incuber à 37 ° C CO, 5% 2 la nuit. </li><li> Le lendemain, retirer le surnageant et ajouter 10 ml DMEM frais + 10% de FBS, et continuellement incuber les cellules à 37 ° C CO, 5% 2 la nuit. </li><li> À 48 heures après la transfection, la récolte du virus en supprimant le surnageant et le transférer dans des tubes de 50 ml stérile. Ajouter 10 ml douce fraîcheur FBS DMEM + 10% dans chaque boîte de Petri et de continuer à la culture pendant la nuit. Stocker le surnageant de virus à 4 ° C. </li><li> Continuez à récolter moins 72 heures après la transfection par la collecte du surnageant. Mélanger tous les surnageants, et centrifuger le surnageant à 500 xg pendant 15 minutes à granulés et à éliminer les débris cellulaires. </li><li> Le surnageant ont été collectées et filtrées à travers un filtre Millipore 0,22 um. Le virus a été davantage concentrées dans les colonnes d'exclusion de taille. </li></ol> 2. Concentrer les particules virales et de déterminer le titre viral <ol><li> Les particules virales ont été concentrés par une colonne d'exclusion de taille (100 000 MW coupés, Centricoin). Surnageant viral a été chargée dans la colonne, et centrifugé à 6000 xg à 4 ° C pendant 15 minutes. </li><li> Concentrée surnageant viral ont été recueillis, aliquotés et conservés à -80 ° C. </li><li> Le titre viral a été déterminé par infection d'un TNF-traitée, le VIH-1 en ligne Veste de cellules positives, J1.1 7. Les cellules ont été cultivées dans une plaque 96 puits à 2,5 x 10 5 cellules par ml (100 ml de volume total), et infectées avec 100 ml d'dilué en série VNL-GFP-RRE-SA pour une semaine. Le titre (DICT50) de la particule a été estimée en comptant le puits GFP-positives en suivant la méthode de Reed et Muench 8. </li></ol> 3. Marquage au VIH-1 des cellules positives avec la particule lentiviraux, VNL-GFP-RRE-SA Mettre en place: une lignée humaine de cellules CD4 T, CEM-SS, a d'abord été infectées par le VIH-1. À 48 heures après l'infection, les cellules sont surinfectées avec les particules lentiviraux, VNL-GFP-RRE-SA. Suite à une surinfection par une autre deux jours, GFP-positives cellules ont été analysées par cytométrie en flux. Comme contrôle, le VIH-1 CEM-SS infectées cellules ont été infectées par l'identique VNL-GFP-RRE-SA. Seul le VIH-1-CEM-SS infectées cellules ont donné naissance à des cellules GFP-positives mais pas le VIH-1 non infecté les cellules CEM-SS. Procédure: <ol><li> Deux heures avant l'infection, ajouter polybrane à une concentration finale de 4 mg / ml. Compter les cellules et de prendre 2 x 10 5 cellules pour chaque infection. Infecter les cellules avec 200 ng (p24) du VIH-1 NL4-3 pendant 2 heures. </li><li> Lavage des cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 minutes, resuspendrecellules en 2 x 10 5 cellules / ml, et la culture à 37 ° C pendant 48 heures. </li><li> Compter les cellules et de prendre 2 x 10 5 cellules par infection avec VNL-GFP-RRE-SA. Ajouter 100 ml de VNL-GFP-RRE-SA et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Laver les cellules et remettre en 2 x 10 5 cellules / ml. </li><li> Effectuer une analyse de cytométrie en flux à 48 heures après la surinfection. Les cellules infectées ont été sédimentées et remises en suspension dans 500 ml paraformaldehede 1%, incubées à température ambiante pendant 20 minutes, puis analysés sur un analyseur FACScan (Becton Dickinson). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Si les expériences sont réalisées avec succès, une population importante GFP sera détecté par le VIH-1-CEM-SS infectées cellules par le cytomètre en flux, alors que, dans le contrôle, les cellules GFP-positives ne seront pas détectés par le VIH-1 infectées CEM-SS cellules. Si les expériences sont réalisées avec succès, le vecteur lentiviral Rev-dépendante, VNL-GFP-RRE-SA, permettra la détection hautement spécifique de la réplication du VIH dans la vie des populations de cellules, grâce à la mesure de la protéine verte (GFP) l'expression de fluorescence. Dans cet exemple, la récolte des cellules CEM-SS ont été colorées avec un anticorps de rat PE-étiquetées monoclonaux contre la souris CD24, HSA, puis analysés sur un cytomètre en flux pour les deux HSA et expression de la GFP. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Comme le montre ici, une population importante GFP a été détecté dans le VIH-1 aux cellules infectées surinfectées VNL-GFP-RRE-SA (figure 1c). En revanche, les cellules GFP-positives n'ont pas été détectés dans les deux non infectés au VIH-1 des cellules CEM-SS, sans surinfection lentiviraux (figure 1a) ou du VIH-1 aux cellules non infectées surinfection lentiviraux (figure 1b).

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

Comme avec les vecteurs d&#39;expression précédemment développés Tat-dépendants, le système Rev décrit ici est une exploitation d&#39;un procédé évolué VIH. L&#39;inclusion de Rev-dépendance rend le vecteur d&#39;expression LTR-base dépend fortement de la présence de répliquer le VIH. L&#39;application de ce vecteur tel que rapporté ici, un virus VIH-journaliste à charge, offre une nouvelle approche pour identifier de nouveaux séropositifs cellules. Le vecteur permet l&#39;examen des cellules vivantes, peuvent exprimer n&#39;importe quel gène d&#39;expérimentation fondamentale ou clinique, et comme un lentivirus pseudo tapé a accès à la plupart des types de cellules et les tissus.

<table><tbody><tr><td>Hotte de sécurité biologique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à 37&amp;#x00B0;C et 5 %CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur à 4&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur à -20&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur à -80&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>Ligne cellulaire HEK293T</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligne cellulaire CEM-SS</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligne cellulaire Jurkat J1.1</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>SFB inactivé par la chaleur (HI FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>préparé par transfection de cellules HeLa avec de l'ADN proviral cloné</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>suppression complète de tous les ORF du VIH dans pNL4-3</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>Insertion des séquences A5 et D4 du VIH-1 dans pNL-GFP-RRE</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>fourni par le Dr Dider Trono</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée à l'Hepes (HBS) 10 x</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2 M</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde à 1 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>Tubes ronds de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Millipore de 0,45&amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Millipore de 0,20&amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de filtration par exclusion de taille (coupure à 100 000 MW)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>Tubes congelés de 2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de 96 puits</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuge de 1,7 mL</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

marquage spécifique du vih-1 des cellules positives à l&#39;aide d&#39;un vecteur rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

La plupart des vecteurs d&#39;expression du VIH-réactive sont basées sur le promoteur du VIH, la longue répétition terminale (LTR). Alors que réactive à une protéine précoce du VIH, Tat, le LTR est également sensible aux états d&#39;activation cellulaire et à l&#39;activité locale chromatine où l&#39;intégration a eu lieu. Cela peut aboutir à VIH est élevée indépendante activité, et a restreint l&#39;utilité de la LTR-journaliste basée à marquer les cellules séropositifs 1,2,3. Ici, nous avons construit un vecteur d&#39;expression lentiviral qui possède, en plus de la LTR-Tat réactive, de nombreuses séquences d&#39;ADN du VIH qui inclut l&#39;élément Rev-réponse et des sites d&#39;épissage du VIH 4,5,6. Le vecteur a été incorporée dans un virus journaliste lentiviraux, permettant une détection très spécifique de répliquer le VIH dans les populations de cellules vivantes. L&#39;activité du vecteur a été mesurée par l&#39;expression de la protéine à fluorescence verte (GFP). L&#39;application de ce vecteur comme indiqué ici, propose une approche nouvelle alternative aux méthodes existantes, telles que la PCR in situ ou la coloration antigène du VIH, d&#39;identifier les séropositifs cellules. Le vecteur peut également exprimer des gènes thérapeutiques pour l&#39;expérimentation fondamentale ou clinique pour cibler le VIH-positives cellules.

Nous avons développé un vecteur lentiviral qui possède, en plus de la LTR-Tat réactif, l&#39;élément de réponse Rev-(RRE) qui peuvent réguler l&#39;expression du gène rapporteur de façon à VIH-1 Tat et Rev-dépendante. Le vecteur permet la détection spécifique de la réplication du VIH dans les cellules vivantes via l&#39;expression de la GFP.

Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à l&#39;aide d&#39;un vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte

La plupart des vecteurs d'expression répondant au VIH sont basés sur le promoteur du VIH, la répétition terminale longue (LTR). Bien qu'ils répondent à une protéine précoce du VIH, Tat, ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les cellules positives au VIH à l'aide d'un vecteur lentiviral dépendant de la protéine Rev du VIH-1 et portant la protéine fluorescente verte. Cela est réalisé en produisant d'abord des particules lentivirales dépendantes de Rev par transfection concomitante. La deuxième étape de la procédure consiste à infecter des cellules T CD4 humaines avec le VIH-1.Ensuite, les cellules T CD4 humaines positives pour le VIH sont superinfectées par les particules lentivirales portant le gène GFP. La dernière étape consiste à identifier les cellules positives pour le VIH en mesurant les cellules positives pour GFP par cytométrie en flux. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant le pourcentage de cellules positives pour GFP par cytométrie en flux.Les implications de cette technique s'étendent au traitement de l'infection par le VIH, car le vecteur dépendant de Rev peut également délivrer et exprimer de façon sélective des gènes thérapeutiques dans les cellules infectées par le VIH afin d'induire la mort des cellules positives au VIH. La procédure sera démontrée par Gi, professeur adjoint de recherche de notre laboratoire. Pour produire des particules lentivirales dépendantes de Rev, des cellules HEK 293T sont transfectées avec trois plasmides : le vecteur lentiviral GFP dépendant de Rev, le construct d'emballage du VIH-1 et un plasmide portant la glycoprotéine VSV-G. Un jour avant le transfection, ensemencer deux fois 10 puissance six cellules HEK 293T dans 10 millilitres de milieu.Dans une boîte de Pétri de 100 millimètres, faire croître les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, remplacer le surnageant des cellules par cinq millilitres de milieu frais.Ensuite, poursuivre la culture des cellules pendant quatre heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Préparer les réactifs de transfection avant la fin de l'incubation de quatre heures. Les cellules HEK 293T seront transfectées avec les trois plasmides selon un ratio de 10 microgrammes de vecteur lentiviral GFP dépendant de Rev, 7,5 microgrammes de construct d'emballage du VIH-1 et 2,5 microgrammes de glycoprotéine VSVG.Pré-mélangez d'abord les trois ADN plasmidiques selon le ratio souhaité. Préparez ensuite deux tubes en polystyrène de cinq millilitres. Ajoutez 480 microlitres de tampon HBS deux fois concentré dans le premier tube et dans le second tube.Ajouter 60 microlitres de tampon de chlorure de calcium à deux molar aux ADN plasmatiques et au tampon de transfection, pour un volume total de 480 microlitres. Ensuite, ajouter le mélange d'ADN plasmatique et de chlorure de calcium. Goutte à goutte, dans le tube HPS deux fois, puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Un précipité fin apparaîtra progressivement. Ajoutez maintenant les 960 microlitres du mélange goutte à goutte à l’aide d’une pipette aux cellules HEK 2 9 3 T. Incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant toute la nuit.Le lendemain, retirez le surnageant S et ajoutez 10 millilitres de milieu frais. Incubez les cellules à nouveau à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant la nuit. À 48 heures post-transfection, récoltez le virus en éliminant le surnageant et en le transférant dans un tube stérile de 50 millilitres.Ajoutez 10 millilitres de milieu frais dans la boîte de Pétri et poursuivez la culture pendant la nuit. Conservez le virus en position supine à quatre degrés Celsius. Poursuivez la récolte à 72 heures post-transfection en collectant le surnageant SUP et en le combinant avec le surnageant récolté précédemment.Ensuite, centrifuger le surnageant S à 500 × g pendant 15 minutes pour former un culot et éliminer les débris cellulaires. Après la centrifugation, récupérer le surnageant S et le transférer dans un nouveau tube. Puis filtrer le surnageant à travers un filtre Millipore de 0,22 micromètre.Le virus sera davantage concentré à l’aide d’une colonne de filtration par gel, dont la démonstration suivante illustre la concentration des particules virales. Chargez le surnageant viral sur une colonne de filtration par gel et centrifugez à 6 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Récupérez le surnageant viral concentré, en mettant de côté environ 100 microlitres pour la détermination du titre viral.Aliquotez le reste et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. La détermination du titre viral est l'un des aspects les plus critiques de cette procédure. Une multiplicité de contamination plus élevée est nécessaire pour une surinfection de cellules avec le vecteur viral GFP.Afin d'obtenir un pourcentage de cellules positives pour la GFP détectables par cytométrie en flux pour déterminer le titre viral, une lignée cellulaire de chat positive pour le VIH-1 traitée à la TNF sera infectée avec le surnageant viral. Ces cellules positives pour le VIH-1 sont cultivées.Dans une plaque de 96 puits, à 2,5 × 10⁵ cellules par millilitre, pour un volume total de 100 microlitres. Préparez six dilutions sérielles dix fois décroissantes des particules lentivirales dépendantes de Rev pour infecter les cellules positives pour le VIH-1 ; ajoutez 100 microlitres de chaque dilution sérielle du virus dans chaque puits contenant des cellules. Incubez pendant sept jours dans une étuve à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.Le titrage des particules est estimé en observant les cellules positives pour la GFP au microscope à fluorescence. Les calculs sont effectués selon la méthode de Reid et MU, et le titre est déterminé comme le point de dilution permettant d'obtenir des puits positifs pour la GFP. Dans 50 % des puits infectés jusqu'au stade IV, on observe des cellules positives avec les particules lentivirales dépendantes de Rev.Une lignée de cellules T CD quatre humaines sera d'abord infectée par le VIH-1. Nous utilisons deux fois 10 à la puissance cinq cellules pour chaque infection. Deux heures avant l'infection.Ajouter du polybrain aux cellules pour obtenir une concentration finale de quatre microgrammes par millilitre. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, infecter les cellules en déposant la solution de VIH dans l'un des tubes de cinq millilitres.Les deux autres tubes de cellules ne sont pas infectés et serviront de témoins. Incuber toutes les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, centrifuger les cellules à 300 ×g pendant 10 minutes, éliminer le virus en phase libre en jetant le surnageant et resuspendre les cellules dans un milieu frais à une concentration de 2 × 10⁵ cellules par millilitre de culture à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.Après 48 heures, les cellules infectées par le VIH sont prêtes à être infectées. Avec les particules lentivirales dépendantes de Rev, utilisez deux fois 10 à la puissance cinq cellules pour l'infection avec 100 microlitres de particules lentivirales ajoutés aux cellules humaines CD4 T infectées par le VIH V1 comme contrôle ; les cellules humaines CD4 T non infectées par le VIH V1 sont également infectées avec 100 microlitres de particules lentivirales. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit et le jour suivant.Remplacez le milieu usé par du milieu frais et resuspendez les cellules à une concentration de deux fois 10 puissance cinq cellules par millilitre. 48 heures après l'infection, récupérez les cellules par centrifugation, puis resuspendez-les dans 500 microlitres de paraformaldéhyde à 1 % ; transférez les cellules resuspendues dans un tube de cytométrie en flux pour analyse par cytométrie en flux. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, les cellules peuvent être analysées sur un analyseur FACS pour détecter la positivité au GFP.Si les expériences sont correctement réalisées, le vecteur lentiviral dépendant de Rev V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A permettra la détection hautement spécifique du VIH en cours de réplication dans des populations cellulaires vivantes, par mesure de l'expression de la protéine fluorescente verte GFP. Dans cet exemple, les cellules C-E-M-S-S récoltées ont été marquées avec un anticorps monoclonal de rat marqué au PE dirigé contre la molécule murine CD 24 HSA, puis analysées en cytométrie en flux pour l'expression de HSA et de GFP, comme illustré ici. Une population GFP importante a été détectée dans les cellules infectées par le VIH-1 et superinfectées avec V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.En revanche, aucune cellule positive pour la GFP n’a été détectée ni dans les cellules C-E-M-S-S non infectées par le VIH V sans surinfection lentivirale, ni dans les cellules non infectées par le VIH-1 avec surinfection lentivirale. N’oubliez pas que le travail avec le VIH peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le respect des niveaux de biosécurité par des pratiques appropriées doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Immunologie et infection

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Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

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Depuis la découverte du gène de la protéine fluorescente verte, les protéines fluorescentes ont eu un impact sur la biologie cellulaire moléculaire. Ce protocole décrit comment l’expression de protéines fluorescentes distinctes par génie génétique est utilisée pour coder des cellules individuelles. La procédure permet de suivre des populations distinctes dans un mélange de cellules, ce qui est idéal pour les applications multiplexées.

Code-barres génétique avec protéines fluorescentes pour des applications multiplexés

Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

Un protocole de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de la réactivation efficace du VIH et de la clairance du provirus latentes est décrite et appliqué en testant l’impact des interventions sur la transcription de VIH et d’épissage. Des résultats représentatifs de l’effet de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage sont fournis.

Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage

La cible ADN épigénome édition représente une approche thérapeutique efficace. Ce protocole décrit la production, purification et concentration des vecteurs lentiviraux all-in-one, hébergeant le transgène CRISPR-dCas9-DNMT3A pour applications d’édition épigénome dans les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC)-dérivé de neurones.

Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

Imagerie par fluorescence multiplexée unicellulaire pour visualiser les acides nucléiques et les protéines virales et surveiller l’infection par le VIH, le VHB, le VHB, le VHC, le virus Zika et la grippe

Nous démontrons un protocole étape par étape pour l’étude de la fonction des gènes dans les macrophages résidents du tissu péritonéal in vivo, en utilisant des vecteurs lentiviraux.

Préparation de vecteur lentiviral pour une modulation efficace des gènes et des microARN de macrophages résidents dans les tissus de la cavité péritonéale in vivo chez la souris

Découvrez le marquage spécifique des cellules VIH-1 positives à l'aide d'un vecteur lentiviral Rev-dépendant exprimant la GFP. Cette méthode permet d'identifier l'infection par cytométrie en flux et ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement du VIH.

Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à laide dun vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte (Vidéo) | JoVE Journal

Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à l'aide d'un vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte

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