Préparation de coeur de rat fortement couplées Mitochondries

Je m’appelle Dr.Ska. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment isoler les mitochondries du cœur rouge. Les étapes clés de l’isolement des mitochondries des tissus sont d’abord la perturbation des tissus et des cellules par un traitement mécanique ou enzymatique.

Deuxièmement, la centrifugation différentielle à basse vitesse pour éliminer les débris et les cellules et noyaux cassés. Et troisièmement, une centrifugation à plus grande vitesse pour collecter les mitochondries. Les instruments et les solutions ont été préparés et stockés à l’avance dans la chambre froide.

Plusieurs conditions doivent être respectées pendant l’isolement. Mitochondries d’abord, perturbation tissulaire complète car elle affecte directement le rendement des mitochondries. Deuxièmement, maintenez la température basse pendant toutes les étapes, mais faites attention aux solutions de surgel, en particulier pendant la centrifugation.

Troisièmement, plus vous opérez vite, meilleure est la qualité des mitochondries obtenues. Les animaux ont été éliminés conformément à la loi britannique sur les procédures scientifiques animales et toutes les opérations suivantes ont été effectuées dans la chambre froide. Préparez trois béchers contenant 40 mils de tampon de lavage.

Refroidissez-le dans le bain de glace pendant trois à cinq minutes avant de passer à l’étape suivante. Assurez-vous de ne pas trop les congeler et utilisez-les immédiatement, juste après que des nuages de cristaux de glace ont commencé à apparaître, ouvrez rapidement le thorax du rouge décapité et extrayez le cœur. Faites de petites incisions, puis transférez immédiatement le cœur dans la solution glacée.

Dans le premier bécher, pressez le cœur pour enlever le sang et mettez-le dans le deuxième bécher. Répétez cette opération pour chaque cœur. Le refroidissement et le lavage rapides des cœurs retirés sont essentiels pour obtenir une préparation standard exempte d’hémoglobine, d’érythrocytes et d’adas.

Séchez les cœurs sur le papier filtre. Retirez toute la graisse, le sang coagulé rapidement et l’artère. Et tirez le tissu ventriculaire.

Ensuite, cela signifie tirer le tissu avec de petits ciseaux incurvés sur la boîte de Pétri Pendant cinq minutes, mettez le tissu du MIT dans le tissu. Appuyez et passez-le. Après la presse à tissus, transférez le matériau dans le bécher avec 50 ml de tampon de lavage et dirigez-le.

Filtrez ensuite la suspension à travers un filtre en îlot. Lavez trois fois le mouchoir pour hommes sur le filtre avec le tampon de lavage et jetez le filtre. Transférez le papier toilette dans 20 mils de tampon de lavage et placez-le dans le bain de glace à l’extérieur magnétique.

Ajoutez des voyages en solution sous une direction constante et démarrez la minuterie à la quatrième minute d’incubation. Homogénéiser brièvement la suspension portion par portion, petit à petit, à l’aide d’un petit homogénéisateur en téflon en verre mal ajusté. Après homogénéisation, transférez la suspension dans un autre bécher sur un deuxième bouvillon.

Répétez la procédure à la neuvième minute, de sorte que vous fassiez l’homogénéisation deux fois au total après la deuxième homogénéisation. À la 15e minute d’incubation, ajoutez 10 ml de tampon isolant contenant un inhibiteur de trypsine et incubez pendant une minute supplémentaire, filtrez à nouveau la suspension à travers un filtre en nylon. Mais dans ce cas, conservez le filtrat, transférez le reste du tissu dans l’homogénéisateur et homogénéisez.

Pendant une minute de plus, combinez l’homogénat avec le filtrat dans le tube de centrifugation. Assurez-vous que les tubes sont équilibrés de manière égale et effectuez une centrifugation à basse vitesse pendant 15 minutes. À 600 g, filtrez soigneusement le surnageant obtenu dans un nouveau tube à centrifuger.

Essayez d’éviter la contamination par une pastille et centrifugez-la à nouveau pendant 15 minutes à 8 500 g.Après une centrifugation à grande vitesse, jetez le surnageant et rincez la pastille avec un tampon en essayant de jeter la couche extérieure blanche et duveteuse. Ajouter un mâle de tampon d’isolement. Inclinez le tube d’un côté à l’autre et retirez le reste de la mémoire tampon.

Cassez la pastille avec l’ula en essayant d’éviter la tache rouge des érythrocytes au fond, resp, suspendez la pastille avec un petit homogénéisateur ou alternativement par une douce ine, diluez la suspension avec plus de tampon isolant et centrifugez à nouveau pendant 15 minutes à 8, 500 G.Jetez le surnageant S Resus. Suspendre la pastille dans le tampon de suspension Resus et centrifuger à nouveau à 8 500 G.La pastille brune obtenue contient des mitochondries intactes lavées. Resus suspend le granulé dans un très petit volume de tampon de suspension resus.

Plus le volume que vous utilisez est faible, plus la préparation des mitochondries sera stable. Habituellement, 200 microlitres de tampon par cœur suffisent. Le rendement attendu des mitochondries préparées est d’environ 10 à 15 milligrammes de protéines mitochondriales par cœur.

Et le rapport de contrôle respiratoire sur les substrats complexes d’une telle préparation doit être compris entre huit et 12. Bonne chance pour votre préparation.