Une cellule à cellule essai de transport macromoléculaire In planta Utilisant bombardement biolistique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser l'ampleur du déplacement cellule à cellule d'une protéine marquée par un fluorochrome dans l'épiderme végétal. Ceci est réalisé en utilisant des particules d'or recouvertes d'ADN afin d'exprimer de façon transitoire la protéine de fusion d'intérêt dans l'épiderme végétal. Dans une deuxième étape, l'ADN est introduit dans l'épiderme végétal, permettant ainsi l'expression et la migration de la protéine de fusion testée.

Ensuite, la protéine de fusion exprimée est observée au microscope confocal afin de suivre l'expression et la localisation des protéines testées marquées par fluorescence. Les résultats obtenus montrent l'ampleur du transport de cellule à cellule de la protéine marquée par fluorescence, en se basant sur l'analyse de la distribution du signal fluorescent par microscopie confocale. Bonjour, je suis Ben Myers du laboratoire de KY, du Département de biochimie et biologie cellulaire de l'Université d'État de New York à Stony Brook.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'analyser le degré de déplacement intercellulaire d'une protéine marquée par un fluorophore dans l'épiderme végétal. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le transport intercellulaire des protéines de mouvement de virus végétaux dans divers fonds génétiques végétaux et pour comparer la mobilité intercellulaire de différents types de protéines. Commençons donc.

Pour commencer ce protocole, faire pousser une plante d'arabidopsis sur du Promix bx. Dans un pot de taille appropriée, utiliser une enceinte à conditions contrôlées avec une courte photopériode et une humidité relative de 40 à 65 % pour les plantes de nicotiana, hamana et tabac nicotiana ; faire pousser chaque plante sur du Promix BX dans un pot plus grand. À nouveau, fournir une enceinte à conditions contrôlées avec une longue photopériode et une humidité relative de 40 à 65 %.

Engraisser occasionnellement la plante avec des produits disponibles dans le commerce, comme décrit précédemment. Après avoir fait pousser la plante Opsis pendant six à huit semaines, sélectionner les feuilles destinées à l'expérience dont la taille est supérieure à 15 millimètre sur 35 millimètre, la mesure de la longueur incluant le pétiole pour les plantes benanna et NAC ; faire pousser les plantes pendant sept à dix semaines. Ensuite, sélectionner des feuilles de taille supérieure à 50 millimètre sur 70 millimètre pour les plantes end benanna et de 100 millimètre sur 125 millimètre pour les plantes nac.

Dans ces cas, les mesures de longueur n'incluent pas les pétales. Avant de commencer la livraison par BIC de microparticules recouvertes d'ADN, préparez la cartouche du fusil à gènes avec des microparticules d'or recouvertes d'ADN comme décrit précédemment en détail. Ensuite, retirez les feuilles du même stade de développement à l'aide d'une lame de rasoir bien aiguisée, puis placez-les immédiatement avec leurs faces AAL orientées vers le haut sur une surface plane en polystyrène.

Le côté ABA de la feuille constitue un meilleur substrat pour le bombardement en raison de sa densité de stomates plus faible et de sa cuticule plus mince. Les petites feuilles, comme celles du rapid opsis, peuvent être immobilisées en les recouvrant d'un morceau de treillis de moustiquaire, fixé à la surface en polystyrène à l'aide d'épingles. Maintenez les feuilles à plat afin d'augmenter l'efficacité de l'acheminement des particules et de minimiser les dommages aux tissus pendant le microbombardement.

Insérez ensuite la cartouche contenant les microparticules revêtues d'ADN dans le pistolet. Pour un opsis de lapin. Effectuez le tir à des pressions comprises entre 140 et 160 psi pour des microparticules de 0,6 micron.

Bombarder l'échantillon en utilisant une cartouche par feuille afin de répartir les microparticules sur une surface de 10 à 12 millimètres de diamètre. Pour end benanna et end baum. Réaliser le tir à des pressions comprises entre 160 et 180 psi pour des microparticules de 0,6 micron, avec des feuilles plus grandes d'end benanna et de tabac.

Il est possible d'effectuer plusieurs bombardements sur la même feuille ; toutefois, ils doivent être réalisés en des positions symétriques de chaque côté de la nervure médiane afin de cibler des zones foliaires au même stade de développement. Le signal fluorescent des protéines marquées exprimées de façon transitoire est visualisé par microscopie confocale. Il convient de prendre soin de déterminer les paramètres optimaux de microscopie pour la détection de chaque protéine testée.

Utilisez un objectif 40 x pour observer les protéines présentant une accumulation intracellulaire limitée avec des intensités de signal faibles, comme la localisation au niveau de la membrane plasmique de la protéine de mouvement du virus de la mosaïque du tabac, ou T-M-V-M-P. Cela permet d’obtenir une résolution plus élevée et une sensibilité accrue. Toutefois, un objectif 10 x équipé d’une fonction de zoom confocal peut être utilisé pour une imagerie plus rapide des protéines présentant une distribution cytoplasmique avec des intensités de signal fortes, comme la protéine fluorescente jaune libre ou YFP. Un transport simple est déduit de l’apparition d’amas multicellulaires contenant le signal fluorescent.

Le nombre de ces agrégats et le nombre de cellules dans chaque agrégat indiquent l'importance du transport de cellule à cellule. Pour obtenir des données fiables, enregistrez au moins 100 expressions. Par système expérimental, veillez à réaliser les expériences simultanément.

Lorsque des comparaisons seront effectuées. Ici, le transport simplifié de protéines marquées par un fluorophore a été détecté. Des images typiques de microscopie confocale obtenues après microbombardement d'une feuille d'end hamana avec un construct exprimant A TMV mp YFP sont présentées.

Un déplacement simpliste du TMV MP YFP est observé en fonction de l'apparition d'agglomérats multicellulaires du signal YFP. Toutefois, tout le TMV MP YFP exprimé de façon transitoire n'est pas capable de se déplacer, comme en témoigne le signal observé dans une seule cellule. Dans certains cas de microbombardement.

Statistiquement, dans moins de 40 % des groupes de signaux comptabilisés, la protéine TMV MP-YFP est incapable de se déplacer entre les cellules. En revanche, dans plus de 60 % des groupes, la protéine se déplace de deux à cinq cellules. La propagation à deux cellules étant la plus fréquente, les protéines de taille moléculaire relativement petite et dépourvues d'une activité de déplacement intrinsèque peuvent diffuser à travers la SMA plasmique pour passer d'une cellule à l'autre.

Par exemple, le YFP libre ou un XYFP se propage entre plusieurs cellules et concerne plus de 30 % des amas comptabilisés. En revanche, cette diffusion non spécifique n'a pas lieu pour un dimère traductionnel de YFP ou deux XYFP, dont la taille est comparable à celle de la protéine de fusion TMV MP-YFP, et qui est entièrement autonome au niveau cellulaire. Nous venons de vous montrer comment analyser le déplacement de protéines marquées par un fluorophore d'une cellule à l'autre en utilisant une expression transitoire par un système de canon à gènes dans l'épiderme végétal.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer des plantes saines et vigoureuses, des particules d'or recouvertes d'ADN de haute qualité pour la livraison de l'ADN, et d'analyser un nombre suffisant de groupes d'expression afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.