L'isolement des cellules souches rétiniennes de l'Oeil de la souris

Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'oeil de la souris et les faire grandir dans la culture pour former clonale sphères de la rétine. Les sphères qui sont isolées possèdent les propriétés cardinales des cellules souches: l'auto-renouvellement et multipotentiality.

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules souches rétiniennes de l’épithélium ciliaire de l’œil. Ceci est accompli en nettoyant et en coupant d’abord l’œil en deux, en commençant par le nerf optique, en coupant à travers la cornée et en rejoignant le nerf optique, puis en retirant la rétine neurale et le cristallin. La deuxième étape de la procédure consiste à couper l’épithélium ciliaire en coupant l’iris de la cornée et l’épithélium pigmenté de la rétine.

La troisième étape de la procédure consiste à traiter enzymatiquement l’épithélium ciliaire, à retirer la sclérotique et à dissocier mécaniquement l’épithélium en cellules uniques. La dernière étape de la procédure consiste à remettre les cellules en suspension dans des milieux exempts de sérum et à les placer dans des plaques de culture tissulaire contenant des milieux libres de sérum avec des facteurs de croissance. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent de manière prospective le nombre de cellules souches trouvées dans l’épithélium ciliaire de l’œil par le biais de la sphère clonale, formation in vitro.

Bonjour, je m’appelle Brenda Coles. Notre laboratoire a d’abord mis au point cette méthode lorsque nous faisions des recherches sur les capacités de régénération des amphibiens et des poissons dans leurs yeux, et a émis l’hypothèse qu’il y avait peut-être une cellule dans l’œil des mammifères avec les mêmes capacités. L’isolement des cellules souches rétiniennes est effectué dans une salle stérile spécifique dédiée aux expériences de culture primaire.

Avant de commencer cette procédure, installez le microscope de dissection et la source de lumière froide, puis disposez les instruments de dissection stériles. Chaque hotte est équipée d’un stérilisateur à rythme chaud pour stériliser les instruments entre les étapes. Nous isolerons des cellules souches rétiniennes à partir d’yeux qui ont été placés immédiatement dans une boîte de Pétri stérile contenant du liquide céphalo-rachidien artificiel Après le retrait de souris sacrifiées selon des protocoles d’éthique animale approuvés, l’aspect le plus difficile de cette procédure est de disséquer un objet rond au microscope.

Un grand soin doit être pris pour ne pas détruire le tissu d’intérêt Sous le microscope de dissection, nettoyez l’œil avec une pince. Débarrassez-vous des cheveux et du tissu connecté qui est attaché à la bordure sclérale de la cornée. Transférez ensuite l’œil dans une nouvelle boîte avec un LCR tout en maintenant l’œil immobile avec une pince dentée.

Utilisez des micro-ciseaux de dissection inclinés pour retirer les muscles oculaires. Retirez également le nerf optique s’il est toujours attaché à l’œil, essayez de ne pas écraser l’œil pendant ce processus. Transférez les yeux dans une nouvelle boîte avec un LCR.

Ensuite, utilisez des ciseaux de micro-dissection incurvés pour couper l’œil en deux. Commencez par le nerf optique et coupez au milieu de la cornée pour revenir au nerf optique où la coupe a été initiée. L’idéal est que les deux morceaux de l’œil soient à peu près de taille équivalente, car cela facilitera l’étape suivante.

En tenant les cornées à l’aide de deux pinces, séparez doucement les deux moitiés des yeux. Retirez et jetez les viscères du cristallin et la rétine neurale des coquilles oculaires. Transférez les coquilles dans un nouveau plat avec un LCR.

Nous sommes maintenant prêts à isoler l’épithélium ciliaire. Pour commencer, orientez la coquille de l’œil de manière à ce que la cornée soit à votre droite et l’épithélium pigmenté rétinien à votre gauche. Fixez doucement la coquille de l’œil avec une pince droite du côté de l’EPR.

Ensuite, utilisez le scalpel pour couper la cornée et l’iris loin de l’épithélium ciliaire de l’œil en appuyant doucement sur le scalpel plutôt que d’utiliser des mouvements de sciage. Après cela, coupez l’épithélium ciliaire loin de l’EPR. À l’aide d’une pince non dentelée, transférez la bande d’épithélium ciliaire dans une nouvelle boîte de 35 millimètres contenant un LCR.

De la même manière, isolez l’épithélium ciliaire de l’autre coquille de l’œil. Une fois que les bandelettes d’épithélium ciliaire ont été recueillies, transférez les bandes dans une boîte de 35 millimètres contenant deux millilitres d’espace. Placez le plat avec les bandes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après 10 minutes, transférez les bandes de l’espace dans un plat contenant deux millilitres de gouttes filtrées dans Halle ur haase et de l’acide réique. Placez le plat à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Revenez maintenant au microscope de dissection tout en maintenant la sclérotique vers le bas avec une pince droite.

Utilisez le bas de la pince non nominale pour gratter doucement l’épithélium ciliaire loin de la sclère. Retirez la sclérotique du plat. Tout cela doit être laissé dans le plat.

Viennent maintenant les cellules d’intérêt et la solution enzymatique. À l’aide d’une pipette en coton poli au feu, transférez la solution dans un tube de 14 litres. Tritrate cette solution 30 fois pour briser les cellules épithéliales en forçant doucement la solution à entrer et sortir de la pipette, centrifuger le tube pendant cinq minutes à 1500 tr/min.

Une fois la centrifugation terminée, retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse. Étant donné que les cellules ont tendance à se détacher du fond du tube. À ce stade, aspirez doucement la majorité du SuperNet à l’aide d’une pipette polie au feu, puis ajoutez un millilitre d’inhibiteur de trypsine dans un milieu exempt de sérum aux cellules.

À l’aide d’une petite pipette bouchée de coton, triturez l’échantillon environ 50 fois jusqu’à ce qu’il s’agisse d’une suspension unicellulaire. Centrifugez à nouveau le tube pendant cinq minutes. À 1500 tr/min, retirez le surnageant et remplacez-le par un millilitre de votre placage.

Réfrigérer doucement à l’aide d’une pipette en verre poli au feu pour remettre les cellules en suspension. Après avoir compté les cellules, disposez-les à la densité souhaitée. Dans une plaque à 24 puits, nous plaquons généralement 10 cellules par microlitre en remplissant d’abord chaque puits avec du milieu, puis en ajoutant la suspension cellulaire pour obtenir un volume final de 500 microlitres de média.

Placez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius où elle ne sera pas déplacée jusqu’à ce que vous comptiez les sphères qui se forment après sept jours lorsque cette procédure est effectuée avec succès. Les cellules épithéliales ciliaires disséquées devraient ressembler à ceci après avoir été dissociées et plaquées à faible densité. Après sept jours de culture, les sphères de cellules souches rétiniennes qui se forment sont comptées.

Une sphère doit avoir un diamètre de plus de 75 microns et flotter librement pour être comptée comme une sphère dérivée de cellules souches. Cependant, certaines cellules auront une prolifération limitée et formeront des PHE qui ne répondent pas au critère de taille et ne seront pas comptées comme des sphères dérivées de cellules souches. Un exemple d’un tel astéroïde est montré ici Après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des sciences de la vision pour explorer la possibilité d’utiliser les cellules souches rétiniennes dans le traitement des maladies rétiniennes.