Name: Analyse de Schwann-astrocytes interactions à laide In Vitro Tests (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Découvrez les tests in vitro pour analyser les interactions entre cellules de Schwann et astrocytes. Ces méthodes permettent d'étudier la migration cellulaire et d'améliorer les stratégies de réparation des lésions de la moelle épinière.

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Nous tenons à remercier Philippe Warren pour son aide genre.

1. Assay limites: <ol><li> Préparation de base: diapositives Chambre sont recouvertes de poly-D-Lysine lames de verre la nuit et stériles sont préparés avant de commencer l'expérience. Milieu est préparé en utilisant un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), supplémenté avec 10% sérum de veau foetal (FCS), et 1% de pénicilline-streptomycine-Fungizon (FSP). Aussi une bouteille de calcium / magnésium libre solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) est préparé. </li><li> Primaire des cellules de Schwann de rat en culture dans le flacon sont trypsinisées pendant 3 minutes en utilisant 0,1% de trypsine. Primaire de la culture des astrocytes rat est trypsinisées pendant 5 minutes en utilisant 0,1% de trypsine. La trypsine est inactivé par l'ajout de DMEM supplémenté avec 10% de SVF et 1% PSF. </li><li> Trypsinisées cellules de Schwann et les astrocytes sont transférés à séparer 15 ml tubes Falcon et centrifugés à 300G pendant 5 minutes. </li><li> Les cellules de Schwann et les astrocytes sont remis en suspension à la densité de 2 x 10 6 (voir la section des résultats représentatifs des variations de densité cellulaire). </li><li> 50 déposer uL de suspension de cellules de Schwann est placé à une extrémité du PDL puits recouverts de glisser chambre. Une bande de verre a été utilisé pour salir la chute vers le centre de la chambre de générer un bord droit. (Utilisation d'un coupe-verre, un des lamelles de verre rectangulaires sont coupées longitudinalement afin qu'il s'adapte à la largeur de la chambre de diapositives utilisées pour des essais de la frontière) </li><li> Une deuxième baisse de 50 pi de la suspension des astrocytes a été placé à l'extrémité opposée du même puits et barbouillé vers le centre pour créer une arête droite parallèle à la première goutte frottis avec un petit écart de 0,2 mm entre eux. </li><li> La chambre de diapositives contenant les gouttes sont placées dans l'incubateur à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Après 2 heures, les cultures ont été lavées avec du DMEM pour enlever non-inscrits débris cellulaires et du milieu frais contenant du DMEM / FCS à 10% / 1% PSF ajouté. Remarque: DMEM / FCS à 10% / 1% PSF peut être complétée par la forskoline (2 pm) et extrait pituitaire bovin (BPE) (10 pg / mL) stimulent la prolifération de cellules de Schwann. BPE fournir les facteurs de croissance nécessaires pour permettre à long terme de culture de cellules de Schwann et la forskoline augmente le taux adénosine monophosphate cyclique dans les cellules de Schwann à induire la prolifération </li><li> Les cellules sont cultivées pendant environ 8-10 jours à 37 ° C, 7% de CO 2 incubateur. Le milieu nécessite d'être changée tous les 3 jours. Les deux fronts de cellule finira par atteindre l'autre et d'une limite nette se forme entre les deux types cellulaires. A ce stade, les expériences peuvent être réalisées analyser les facteurs impliqués dans la formation de frontière. </li><li> Co-culture peut être fixé à l'aide de formaldéhyde 4% et les cellules de Schwann peuvent être immunocolorés avec des anti-P75 anticorps et les astrocytes avec des anticorps anti-GFAP pour identifier les cellules de co-culture. P75 anticorps reconnaît peu d'affinité sur des récepteurs du NGF cellules de Schwann qui astrocytes manque. Anti-GFAP anticorps reconnaît gliales firbrillary protéine acide qui localise au cytoplasme d'astrocytes. (S'il vous plaît voir la Figure 1A pour la limite de son représentant) </li></ol> 2. Essai de migration: <ol><li> 4 assiettes bien (15mm puits) sont PDL couché la nuit et préparées pour la création de monocouches d'astrocytes. </li><li> Primaire de la culture des astrocytes sont trypsinisées pendant 5 minutes en utilisant 0,1% de trypsine. La trypsine est inactivée par l'ajout de DMEM supplémenté avec 10% de SVF et 1% de cellules PSF et centrifugés à 300G pendant 5 minutes. (Voir Figure 2) </li><li> Les astrocytes sont re-suspendue à 1x10 5 cellules / ml. 1 ml de cette solution est ajoutée à chaque revêtement PDL bien dans 4 assiettes bien. Les astrocytes sont cultivés pendant 24-48 heures jusqu'à ce que la monocouche est complètement confluentes. </li><li> Afin d'évaluer la migration des cellules de Schwann sur des monocouches d'astrocytes, parallèlement à la création de monocouches d'astrocytes, circulaire lamelles de verre enduit de PDL sont placés dans un tube de 50 ml et écrasés à l'aide d'une pipette en plastique pour créer de petits fragments de verre. </li><li> Des fragments de verre sont transférés dans un puits dans 6 assiette à bien et l'aide de pinces appropriées fragments de taille sont choisis et placés dans d'autres puits. 5 fragments de verre sont placés dans chaque puits de plaque de 6 puits. </li><li> Primaire des cellules de Schwann cultivées en flacon sont trypsinisées pendant 3 minutes en utilisant 0,1% de trypsine. Trypsinisées cellules de Schwann sont transférés à séparer le tube Falcon de 15 ml et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Les cellules de Schwann sont remis en suspension à 2x 10 6 cellules / ml dans DMEM/10% SVF / 1% PSF. </li><li> 20 ul de gouttelettes cellules de Schwann suspension est ajoutée sur chaque lamelle 5 fragments placés dans 6 assiettes bien et les cellules sont incubées à 37 ° C CO, 7% 2 pendant 2 heures. </li><li> Après 2 heures, les cellules de Schwann sont attachés à la lamelle et fragments DMEM/10% SVF / 1% PSF (Complété avec 2 pm de la forskoline et de 10 pg / mL de BPE est ajouté à chaque puits afin que les fragments sont complètement couverts de moyenne) . </li><li> La plaque de 6 puits contenant les fragments sont ensuite placés dans l'incubateur pendant 24-48 heures jusqu'à ce que les fragments de verre sont complètement concouramment avec des cellules de Schwann. </li><li> Une fois les fragments sont confluentes avec des cellules de Schwann, chaque fragment est ramassé avec soin en utilisant une pince forte et trempée dans du HBSS pour enlever les cellules seules et ensuite le visage inversé vers le bas sur monocouche d'astrocytes. </li><li> Chaque puits est ensuite recouvert avec 1 ml d'DMEM/10% SVF / 1% de cellules de Schwann PSF et sont autorisés à migrer pendant 24 à 48 période. Durant cette période réactifs expérimentales telles que les facteurs de croissance peuvent être ajoutés afin d'évaluer leur effet sur le nombre et la distance de migration des cellules de Schwann. </li><li> Après la période de migration, les fragments de verre sont fixés au fond de chaque puits en ajoutant 4% de paraformaldéhyde (PFA) pour 30 minutes. Après fixation, les cellules de Schwann immunocoloration pour la p75 (reconnaissant des récepteurs de faible affinité du NGF), puis les colorer à l'aide ABC strepavidine kit-diaminobenzidine (DAB), pour permettre la visualisation des cellules de Schwann au microscope optique. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Après 8-10 jours de Schwann-astrocytes co-cultures montrent une frontière nette entre les deux types cellulaires. Cette limite est plus prononcé si la forskoline et BPE est utilisé dans la culture comme la prolifération des cellules de Schwann est renforcée. Si aucune limite n'est constatée pendant la période de 10 jours, le temps de la culture peut être encore augmenté jusqu'à la frontières sont établies. Changer le rapport de la densité cellulaire est une autre façon d'augmenter la formation de frontière. Un ratio de 3:1 de Schwann: la densité des cellules astrocytaires peuvent être utilisés lors de la préparation des suspensions cellulaires 8,18. Après immunomarquage pour identifier les cellules de Schwann et les astrocytes, des cellules d'évaluer entremêlement une ligne peut être établi où la limite est établie et le nombre de cellules de Schwann migrant sur le territoire des astrocytes peuvent être comptés sous microscope à fluorescence. Voici deux exemples d'images obtenues frontières, l'un avec le bien-formé la ségrégation des cellules de Schwann et les astrocytes (figure 1A) et une où les cellules ne sont pas séparés et dans des territoires différents en raison de mauvaise technique (figure 1B). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Test Boundary. Figure 1: Schwann-astrocytes interaction. A) Une journée 10 co-culture de dosage, en présence de forskoline et BPE à stimuler la prolifération de cellules de Schwann démontre une frontière nette entre les deux types de cellules (rouge = P75, vert = GFAP). B) Une journée 10 co-culture où la limite de dosage n'est pas formé et les deux fronts de cellules mixtes. Cela est dû au mélange des deux gouttelettes tout en plaçant les gouttelettes de cellules de Schwann et des astrocytes côté de l'autre lors de la préparation de la frontière (rouge = P75, vert = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Image représentative de monocouche d'astrocytes confluents Migration des dosages d'évaluer le mouvement d'un seul type de cellules sur la surface d'un autre type de cellule et donc d'évaluer un phénomène différent de celui de la formation de frontière. La pratique est nécessaire pour assurer inversant les lamelles sur des monocouches ne conduit pas à des dommages à l'cellule de Schwann couvert de fragments de verre et des monocouches d'astrocytes par la pince forte. Afin d'évaluer la migration des cellules de Schwann, la distance maximale de migration et le nombre de cellules qui migrent depuis le bord de la lamelle peut être mesurée au microscope optique. Ci-dessous est à l'image de cellules de Schwann colorés avec des anticorps P75 utilisant une coloration DAB sur la surface des monocouches d'astrocytes (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Test de migration figure 3. Utilisant test lamelle inversé. A) Les cellules de Schwann (brun, immunocolorées avec p75 anticorps) migrer loin du bord de la lamelle. La flèche indique la direction de la migration cellulaire loin de la lamelle.

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<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

Les tests décrits ci-dessus ont été utilisés dans différentes études démontrant le rôle de multiples facteurs impliqués dans la formation frontière entre les astrocytes et Schwann limitées de migration de cellules de Schwann dans l&#39;environnement astrocytaire. Comprendre les mécanismes sous-jacents de ces événements est essentielle car elle permettrait le développement de stratégies visant à optimiser et améliorer l&#39;intégration des greffes de cellules de Schwann suivant la transplanta...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskoline</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-objets</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-objets (rectangle)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>Plaques avec chambres</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 4 puits, plaques 6 puits</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>Plaques 4 puitsPlaques 6 puits</td></tr><tr><td>Anticorps anti-p75 de rat</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaires (conjugués à l’Alexa)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>Chèvre anti-souris 568Chèvre anti-lapin 488</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires biotinylés</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>Chèvre anti-souris</td></tr><tr><td>Comprimés de DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>Kit ABC elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Pinces fines</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de schwann-astrocytes interactions à l&#39;aide in vitro tests

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Les cellules de Schwann sont l&#39;une des cellules couramment utilisés dans les stratégies de réparation suite à des blessures de la moelle épinière. Les cellules de Schwann sont capables de supporter la régénération axonale et la germination par les facteurs de croissance et en fournissant 1,2 sécrétant de promotion de croissance trois molécules d&#39;adhésion et des molécules de la matrice extracellulaire 4. En outre, ils myéliniser les axones démyélinisées au site de la lésion 5. Toutefois, suite à la transplantation, les cellules de Schwann ne migrent pas à partir du site de l&#39;implant et ne se mêlent avec les astrocytes hôte 6,7. Il en résulte la formation d&#39;une frontière nette entre les cellules de Schwann et les astrocytes, créant un obstacle pour les axones en croissance essayant de quitter l&#39;arrière du greffon dans le tissu hôte proximale et distale. Les astrocytes en contact avec les cellules de Schwann subissent également une hypertrophie et jusqu&#39;à réguler les molécules inhibitrices 8-13. Dans des essais in vitro ont été utilisées pour modéliser la cellule de Schwann-astrocytes interactions et ont été importantes dans la compréhension du mécanisme qui sous-tendent le comportement cellulaire. Ces tests in vitro comprennent test frontière, où une co-culture est faite en utilisant deux cellules différentes à chaque type de cellule d&#39;occupation des territoires différents avec seulement un petit écart qui sépare les deux fronts cellule. Comme les cellules se divisent et migrent, les deux fronts cellulaires se rapprocher les uns aux autres et finalement en collision. Cela permet au comportement des deux populations cellulaires à analyser à la frontière. Une autre variante de la même technique est de mélanger les deux populations cellulaires dans la culture et au fil du temps les deux types cellulaires séparer avec des cellules de Schwann groupées comme des îles dans entre les astrocytes ainsi que la création de plusieurs Schwann-astrocytes limites. Le second test utilisé dans l&#39;étude de l&#39;interaction des deux types cellulaires est le dosage de la migration cellulaires où le mouvement peut être suivi sur la surface de l&#39;autre type cellulaire monocouche 14,15. Ce dosage est communément appelé test lamelle inversé. Les cellules de Schwann sont cultivées sur des petits fragments de verre et ils sont inversés face cachée sur la surface de monocouches d&#39;astrocytes et de la migration est évaluée à partir du bord de la lamelle. Les deux dosages ont joué un rôle dans l&#39;étude des mécanismes sous-jacents impliqués dans l&#39;exclusion cellulaires et la formation de frontière. Certaines des molécules identifiées en utilisant ces techniques incluent le N-cadhérines 15, chondroïtine sulfate protéoglycanes (CSPG) 16,17, le FGF / Héparine 18, Eph / éphrines 19. Cet article vise à décrire de dosage et le dosage limite de migration en mode pas à pas et d&#39;élucider les éventuels problèmes techniques qui pourraient survenir.

Cet article vise à décrire de manière progressive l&#39;couramment utilisés<em&gt; In vitro</em&gt; Essais utilisés dans l&#39;étude de cellules de Schwann-asrtocyte interactions.

Analyse de Schwann-astrocytes interactions à l&#39;aide In Vitro Tests

Les cellules de Schwann sont parmi les cellules les plus couramment utilisées dans les stratégies de réparation suite à des lésions de la moelle épinière. Les cellules de Schwann sont capables de soutenir la croissance axonale...

Les cellules de Schwann sont des cellules gliales du système nerveux périphérique utilisées dans la réparation des lésions de la moelle épinière. Elles produisent essentiellement des facteurs de croissance qui favorisent la régénération axonale et fournissent des molécules d'adhésion et de matrice extracellulaire propices à la croissance. En outre, elles myélinisent les axones au niveau de la lésion.Malheureusement, les cellules de cygne transplantées ne migrent pas à partir du site des implants et ne se mêlent pas aux astrocytes de l'hôte. Cela entraîne la formation d'une limite nette et empêche les axones en croissance de s'intégrer au tissu hôte. Dans cette vidéo, deux méthodes sont utilisées pour étudier les interactions entre les cellules de cygne et les astrocytes in vitro.Tout d'abord, un essai de limite est démontré, dans lequel les territoires des cellules de type swan et des astrocytes sont établis sur une lame et cultivés. Différents réactifs sont ensuite ajoutés sur la lame, suivis d'une culture supplémentaire. Les lames sont ensuite observées et analysées afin de déterminer l'effet des réactifs sur la migration des cellules de type swan vers le territoire astrocytaire, ou inversement.Ensuite, un test de migration est démontré, dans lequel des fragments de lamelles recouverts de nids de cellules de Schwan sont inversés sur des monocouches d'astrocytes. Là encore, différents réactifs sont ajoutés au milieu de culture, puis une imagerie de la culture est réalisée afin d'évaluer l'importance et la distance de la migration des cellules de Schwan sur les monocouches d'astrocytes. En définitive, ce type de test devrait faciliter l'élaboration de stratégies visant à optimiser et à améliorer l'intégration des greffes de cellules de Schwan après transplantation.L'avantage de ces tests in vitro par rapport aux méthodes existantes, où la migration sur des substrats purs est évaluée, réside dans leur plus grande pertinence par rapport aux tests in vivo, dans lesquels les cellules transplantées entrent en contact avec les astrocytes. En outre, ces tests in vitro peuvent être utilisés dans d'autres domaines tels que la biologie cellulaire afin de répondre à des questions clés telles que l'invasion et la migration des cellules tumorales. Avant de commencer le test, préparez les éléments suivants : des lamelles-chambre revêtues de poly-D-lysine, des lamelles en verre stériles, du milieu de culture cellulaire et une bouteille de calcium.Commencez la solution équilibrée de Hanks sans magnésium en traitant les cellules de Schwann primaires avec de la trypsine pendant trois minutes et les astrocytes primaires de rat pendant cinq minutes. Une fois que les cellules se sont détachées, arrêtez l'action de la trypsine en ajoutant du milieu de culture cellulaire. Ensuite, transférez les cellules de Schwann et les astrocytes dans des tubes Falcon de 15 millilitres séparés et centrifugez-les à 300 ×g pendant cinq minutes.Pendant ce temps, utilisez un coupe-verre pour découper longitudinalement des lamelles de verre rectangulaires afin qu’elles s’ajustent à la largeur des lames à chambre utilisées pour les essais de frontière et facilitent l’étalage de la goutte de suspension cellulaire. Après la centrifugation et la resuspension, suspendez les cellules de Schwann et les astrocytes à une densité de deux fois dix puissance six cellules par millilitre. À une extrémité d’une lame à chambre revêtue de polylysine, déposez une goutte de 50 microlitres de suspension de cellules de Schwann.Utilisez une lame en verre pour étaler la goutte vers le centre de la chambre afin de créer un bord droit. Ensuite, placez une deuxième goutte de 50 microlitres de suspension d'astrocytes à l'extrémité opposée du même puits et étalez-la vers le centre. Pour obtenir un bord droit parallèle au premier, il doit y avoir un espace de 0,2 millimètre entre les deux.Placer la lame à chambre contenant les gouttes dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, laver les cultures avec du DMEM pour éliminer tous les débris cellulaires non attachés.Pour stimuler la prolifération des cellules de schwan, ajoutez du milieu dans les lamelles-chambre. Ce milieu est supplémenté avec quatre galin et un extrait d'hypophyse de bovin. Les quatre galin augmentent les niveaux d'AMP cyclique dans les cellules de schwan afin d'induire la prolifération, et l'extrait d'hypophyse de bovin fournira les facteurs de croissance nécessaires à une culture à long terme.Incuber la lame pendant huit à dix jours. Les deux fronts cellulaires finiront par se rejoindre et une limite nette se formera entre les deux types cellulaires. À ce stade, des expériences peuvent être réalisées.Analyser les facteurs impliqués dans la formation de la limite afin d'examiner cette dernière, fixer la co-culture avec du formaldéhyde à 4 %. Pour distinguer les cellules de Schwann et les astrocytes, réaliser une immunomarquage avec un anticorps anti-P75 et un anticorps anti-GFAP respectivement. L'anticorps anti-P75 reconnaît le récepteur de faible affinité pour le NGF sur les cellules de Schwann, que les astrocytes n'ont pas ; l'anticorps anti-GFAP reconnaît la protéine acide fibrillaire gliale, localisée dans les astrocytes, afin de réaliser un test de migration.Commencez mon ensemencement. Ajoutez une fois dix puissance cinq astrocytes dans un millilitre de milieu dans chaque puits d'une plaque de quatre puits ayant des puits de 15 millimètres. Placez la plaque dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures jusqu'à ce que la monocouche soit complètement confluente.Entre-temps, pour préparer les cellules Swan afin d'évaluer leur migration sur des monocouches d'astrocytes, placez des lamelles circulaires en verre recouvertes de polylysine dans un tube de 50 millilitres et utilisez un pistolet en plastique pour les broyer, créant ainsi de petits fragments de verre. Transférez les fragments de verre dans un puits d'une plaque à six puits à l’aide de pinces. Choisissez des fragments d’environ cinq millimètres de diamètre et transférez-en cinq dans chacun des autres puits.Incuber les cellules de swan avec la trypsine pendant trois minutes. Ensuite, transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et les centrifuger à 300 ×g pendant cinq minutes. Résuspender les cellules de swan à deux fois 10⁶ cellules par millilitre dans le milieu de culture.Ensuite, ajouter 20 microlitres de la suspension de cellules de Schwann au-dessus de chaque fragment et incuber à 37 degrés Celsius et 7 % de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après deux heures, retirer les cellules de Schwann de l’incubateur. Ajouter dans chaque puits un volume suffisant de milieu de culture supplémenté avec deux micromolaires, quatre échelles in et 10 microgrammes par millilitre de BPE.Ainsi, les fragments avec les cellules attachées sont entièrement recouverts de milieu et incubés pendant 24 à 48 heures jusqu'à ce que les fragments de verre soient complètement confluents avec les cellules de type « swan ». Une fois que les fragments sont confluents avec les cellules de type « swan », retirez à la fois les cellules de type « swan » et les astrocytes de l'incubateur. Utilisez une pince pour prélever soigneusement chaque fragment portant les cellules de type « swan » attachées.Trempez le fragment dans du HBSS pour éliminer les cellules non attachées, puis retournez-le face vers le bas sur la monocouche d'astrocytes. Une fois tous les fragments transférés, ajoutez un millilitre de milieu de culture cellulaire dans chaque puits.Si les effets de réactifs expérimentaux tels que les facteurs de croissance doivent être évalués, ils doivent être inclus dans le milieu. Remettez la plaque dans l'incubateur et laissez les cellules de Schwann migrer pendant 24 à 48 heures après la période de migration. Les fragments de verre sont fixés au fond de chaque puits en ajoutant du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes après la fixation.Immunomarquer les cellules de Schwann pour la P 75, puis les colorer à l'aide du kit A BC Strept ADIN fourni avec la diaminobenzidine afin de permettre la visualisation des cellules de Schwann au microscope optique après 10 jours. La co-culture cellules de Schwann-astrocytes présente une limite nette entre les deux types cellulaires. Ici, les cellules de Schwann sont identifiées par la P 75.La coloration du récepteur de faible affinité pour le NGF est indiquée en rouge et les astrocytes sont identifiés par la coloration de la GFAP, montrée en vert. La limite entre ces cellules est plus marquée lorsque le forskoline et l'extrait de tissu embryonnaire de bœuf (BPE) sont utilisés dans la culture, car la prolifération des cellules de Schwann est renforcée. En revanche, dans cet essai de co-culture de 10 jours, les cellules ne se sont pas bien séparées en territoires distincts.Cela était dû à une technique inadéquate et au mélange des deux types cellulaires. Lors de la préparation du test de limite, les tests de migration évaluent le déplacement d'un type cellulaire à la surface d'un autre type cellulaire, et analysent donc un phénomène différent de celui de la formation de la limite. Cette image montre des cellules de type swan qui migrent à partir du bord de la lame, la flèche indiquant la direction de la migration cellulaire.Lors de la réalisation de ces essais in vitro, il est important de garder à l'esprit que l'effet des réactifs peut porter soit sur les astrocytes, soit sur les cellules de Schwann, et que des expériences ultérieures sont donc nécessaires afin de déterminer exactement quel type cellulaire est responsable de la migration observée, augmentée ou diminuée. En outre, d'autres techniques telles que l'immunochimie peuvent être réalisées, notamment dans le cadre du test de limite, afin de montrer quelles molécules sont surexprimées ou sous-exprimées à la frontière entre les cellules de Schwann et les astrocytes.

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