Le maintien de Wolbachia dans la cellule sans moyen

Je m'appelle Courtney Ston. Je travaille à la faculté de santé publique Johns Hopkins Bloomberg, dans le laboratoire du Dr Jason Rascon. Aujourd'hui, nous allons effectuer une purification bactérienne à partir de cellules d'insectes en culture.

Il s'agit en réalité d'une procédure très simple. Nous commençons par récolter nos cellules, puis nous rompons physiquement les membranes des cellules hôtes eucaryotes par lyse avec des billes de verre. Ensuite, nous utilisons une centrifugation différentielle pour séparer les bactéries des débris cellulaires de l'hôte.

Ensuite, nous utilisons une série d'étapes de filtration pour éliminer davantage les particules des cellules hôtes afin que, à la fin, il ne reste que le culot bactérien purifié. C'est en réalité l'une des principales exigences. Il s'agit d'une hotte de culture cellulaire, utilisée pour maintenir des conditions stériles, car les cultures cellulaires sont particulièrement sensibles à la contamination.

Nous avons également besoin de milieu de culture cellulaire, des cellules elles-mêmes que nous cultivons dans des flacons en plastique. Nous avons également besoin de billes de soufflage de trois millimètres, de tubes coniques de 50 ml, et d'une centrifugeuse capable d'effectuer une centrifugation à haute vitesse, d'environ 18 000 G, afin de former un culot de nos bactéries, mais aussi capable d'atteindre environ 3 000 G ou 2 500 G pour former un culot de nos cellules hôtes. La première étape consiste donc à partir de nos cellules cultivées.

Elles sont bien cultivées, n'est-ce pas ? Ce sont des flacons T75. Ils contiennent 15 ml de milieu de culture, tout comme nous.

La première étape consiste à interrompre la couche cellulaire et à récolter les cellules dans un tube conique de 50 ml. Il suffit alors de passer la pipette de haut en bas sur la couche cellulaire afin de détacher toutes les cellules et de les disperser dans le milieu. Une fois les cellules en suspension dans le milieu, on les aspire délicatement à l’aide d’une pipette pour les transférer dans le tube conique.

À présent, nous allons ajouter des billes de verre de trois millimètres à chacune des deux suspensions cellulaires. Ces billes ont été autoclavées et peuvent en réalité être réutilisées. Elles peuvent être lavées, trempées dans de l'eau de Javel, puis autoclavées avant une nouvelle utilisation.

Vous versez simplement en veillant à ne pas toucher l'embout du flacon B avec l'embout du tube de centrifugation. Nous ajoutons environ jusqu'au trait de 5 millilitres de billes de verre dans chaque tube de centrifugation. Ensuite, nous devons rompre physiquement les cellules eary afin de libérer nos bactéries dans la suspension.

Nous utilisons un vortex, que nous réglons à la vitesse maximale, puis nous vortexons pendant cinq minutes. Nous vortexons maintenant les cellules avec les billes de verre de trois millimètres pendant cinq minutes, puis nous pipetons le surnageant à l’aide d’une pipette propre dans un tube de centrifugation propre et stérile de 50 mL. Nous recueillons notre suspension nouvellement créée, qui contient les bactéries libérées en solution ainsi que les débris cellulaires entiers.

La prochaine étape consiste donc à effectuer une centrifugation à basse vitesse afin de faire précipiter les débris cellulaires tout en maintenant les bactéries en suspension. Nous allons utiliser une centrifugeuse, à 2 500 ×g pendant 10 minutes. Nous effectuerons également la centrifugation à quatre degrés Celsius afin de favoriser la formation du culot au fond des tubes.

Nous le plaçons simplement ici, nous assurons son équilibre, fermons le récipient, puis centrifugeons pendant 10 minutes. J'ai maintenant centrifugé notre surnageant contenant les débris des cellules hôtes ainsi que les bactéries purifiées. J'ai effectué la centrifugation à 2 500 ×g pendant 10 minutes.

Et comme vous pouvez le voir, j'ai un culot au fond de mon tube qui consiste en des débris de cellules végétales. Mes bactéries nouvellement libérées se trouvent toujours dans le surnageant, car la centrifugation n'a pas été suffisamment forte pour les faire précipiter également. La prochaine étape consistera donc à prélever le surnageant et à le filtrer à travers un filtre de cinq microns.

Il s'agit donc d'un filtre de cinq microns qui peut s'adapter à n'importe quelle seringue. J'utilise ici une seringue de 30 ml, mais vous devez simplement tirer le piston vers le haut, puis, sans toucher le filtre lui-même, en particulier la partie située ici en bas, qui doit rester stérile, fixer la seringue au filtre en la vissant, avant de comprimer doucement le piston pour faire passer le surnageant à travers le filtre et dans notre tube.

Ne pas appuyer trop fort, car vous pourriez endommager le filtre et l'empêcher de fonctionner. Si vous devez exercer une pression importante, vous devez retirer votre filtre et le remplacer, car cela signifie qu'il est obstrué par des débris cellulaires. À ce stade, selon le volume obtenu, et comme méthode supplémentaire pour obtenir une culture bactérienne très pure, nous ajoutons habituellement 250 millimoles de solution de saccharose, stérilisée par filtration, dans notre tube de centrifugation à grande vitesse.

Remplir la bouteille à environ au moins 80 % de sa capacité. Nous la remplissons habituellement jusqu’au col. Ces tubes doivent être remplis à ce niveau afin qu’ils n’implosent pas à l’intérieur de notre centrifugeuse à grande vitesse.

Très bien, maintenant nous allons centrifuger notre surnageant et concentrer nos bactéries purifiées à 18 000 ×g dans cette centrifugeuse à grande vitesse. Nous devons donc veiller à placer nos tubes de manière équilibrée, bien sûr, puis nous la fermons. Nous allons la régler sur 10 minutes.

Et nous aimons effectuer cette opération à 10 degrés Celsius ou moins, température qui est réglée ici. Ensuite, notre vitesse angulaire pour ce rotor spécifique dans la centrifugeuse est de 12,5 tours par minute. Nous disposons d'un tableau de conversion, de sorte qu'elle tournera à environ 18 670 fois G. Nous avons donc effectué notre rotation à grande vitesse en centrifugeuse afin d'obtenir un culot de nos bactéries purifiées.

Maintenant, comme vous pouvez le constater, nous avons un bel agrégat bactérien au fond de notre tube à grande vitesse. Ce que nous allons faire maintenant, c'est transférer tout le surnageant dans un contenant pour déchets liquides. Ce que nous devons faire à ce stade, c'est remettre en suspension nos bactéries.

Je vais la resuspendre dans deux millilitres de notre milieu de culture, c'est-à-dire le milieu pour insectes de Schneider, complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur. Je vais simplement resuspendre le culot en aspirant et en rejetant la solution plusieurs fois jusqu'à ce que toutes les bactéries soient redevenues en suspension. Maintenant que nos bactéries sont de nouveau en suspension, nous allons effectuer une étape supplémentaire de purification afin d'éliminer tout débris éventuel de cellules hôtes.

Pour cela, nous allons utiliser un filtre de 2,7 micromètre. Ce que j'aime faire, c'est utiliser le boîtier en plastique de notre filtre de cinq micromètres comme support. Nous pouvons ainsi prélever notre solution, visser la seringue sur le filtre de 2,7 micromètre, puis filtrer dans un tube destiné au stockage à long terme.

Comme pour l'autre filtre, appuyez doucement sur le piston. Nous obtenons ainsi notre solution de bactéries purifiées. La prochaine étape que je vais vous montrer est la manière dont nous évaluons la viabilité.

Nous utilisons le kit de viabilité bactérienne « live dead » avec rétroéclairage de Molecular Probes. Ce kit comprend deux colorants : l'iodure de propidium et le cyto neuf. L'iodure de propidium est rouge, il fluoresce en rouge et colore uniquement les bactéries dont la membrane n'est pas complètement intacte, tandis que le cyto neuf colore toutes les bactéries.

Ainsi, lorsque vous observez ces bactéries au microscope équipé d'optiques à fluorescence, toutes les bactéries émettront une fluorescence verte, tandis qu'un sous-ensemble, constitué des bactéries mortes, émettra une fluorescence rouge. Nous prélevons un petit aliquot de notre échantillon purifié et, dans ce cas, je vais prélever seulement 10 microlitres, juste assez pour réaliser une lame. Et je vais en distribuer une partie dans deux autres.

Ensuite, je vais ajouter nos deux autres colorants, juste un microlitre du mélange d'iodure de propidium et de cyto nine, à notre suspension bactérienne. Puis vous pouvez laisser incuber à l'obscurité pendant 15 minutes. Nous constatons toutefois qu'il est en réalité possible de monter l'échantillon et de l'observer presque immédiatement pour voir vos résultats.

Très bien, maintenant je vais observer au microscope mon prélèvement contenant les bactéries colorées avec la solution de coloration rétroéclairée pour cellules mortes. Je vais en déposer une goutte sur ma lame, poser une lamelle par-dessus, puis procéder à l’observation. J’utiliserai notre filtre mixte rouge et vert afin d’évaluer la viabilité de mes bactéries.

Donc, lorsque j'ouvre l'obturateur, j'observe mes bactéries, qui apparaissent plus ou moins comme de minuscules points. Mais je constate ici qu’environ 90 à 95 % des bactéries sont vertes, alors que seulement environ 5 % sont rouges. Nous avons donc un taux de viabilité très élevé, n'est-ce pas ?

J'ai donc terminé de vous présenter la purification de Akia viable à partir de cellules d'insectes en culture. Ce protocole comprenait la lyse physique des cellules hôtes eucaryotes, suivie d'une centrifugation différentielle pour isoler les bactéries purifiées, ainsi que plusieurs étapes de filtration afin de garantir la qualité des bactéries purifiées et d'éliminer complètement tous les composants des cellules hôtes. Ensuite, nous avons décrit le test d'évaluation de viabilité « live/dead » par microscopie en contre-éclairage, qui utilise deux colorants pour évaluer la viabilité des bactéries.

Et vous pouvez utiliser, dès maintenant, vos bactéries purifiées dans diverses applications, notamment l'infection d'autres systèmes cellulaires en culture afin d'augmenter l'infection d'un système spécifique. Vous pouvez également réaliser des études métaboliques ou de nombreuses autres études à l'aide de vos bactéries purifiées vivantes.