Name: Le maintien de Wolbachia dans la cellule sans moyen (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Découvrez la purification de Wolbachia pipientis à partir de cellules d'Anopheles gambiae par lyse aux billes de verre et centrifugation différentielle. Cette méthode permet d'obtenir des bactéries viables pour des études en biologie des vecteurs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

le maintien de wolbachia dans la cellule sans moyen

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

Dans ce protocole vidéo, des procédures sont mises en évidence (1) d&#39;épurer les symbiotes Wolbachia hors des cellules de moustique cultivé, (2) utiliser un test de fluorescence pour déterminer la viabilité de la bactérie Wolbachia purifiée et (3) maintenir les Wolbachia désormais extracellulaire dans la cellule du milieu sans . Purifié par Wolbachia rester en vie dans la phase extracellulaire mais ne répliquent pas jusqu&#39;au re-inoculée dans les cellules eucaryotes. Wolbachia extracellulaires purifiés de cette manière restera viable pour au moins une semaine à température ambiante, et peut-être plus. Purifié par Wolbachia sont adaptés à la micro-injection, extraction d&#39;ADN et d&#39;autres applications.

Cette vidéo décrit un procédé de purification Wolbachia pipientis partir d&#39;une ligne de cellules Anopheles gambiae et la culture de la endosymbiote dans la cellule sans moyen. Un test pour la viabilité de la bactérie est démontrée.

Le maintien de Wolbachia dans la cellule sans moyen

Dans ce protocole vidéo, les procédures sont démontrées pour (1) purifier les symbiontes Wolbachia à partir de cellules de moustiques cultivées, (2) utiliser un essai fluorescent pour...

Je m'appelle Courtney Ston. Je travaille à la faculté de santé publique Johns Hopkins Bloomberg, dans le laboratoire du Dr Jason Rascon. Aujourd'hui, nous allons effectuer une purification bactérienne à partir de cellules d'insectes en culture.Il s'agit en réalité d'une procédure très simple. Nous commençons par récolter nos cellules, puis nous rompons physiquement les membranes des cellules hôtes eucaryotes par lyse avec des billes de verre. Ensuite, nous utilisons une centrifugation différentielle pour séparer les bactéries des débris cellulaires de l'hôte.Ensuite, nous utilisons une série d'étapes de filtration pour éliminer davantage les particules des cellules hôtes afin que, à la fin, il ne reste que le culot bactérien purifié. C'est en réalité l'une des principales exigences. Il s'agit d'une hotte de culture cellulaire, utilisée pour maintenir des conditions stériles, car les cultures cellulaires sont particulièrement sensibles à la contamination.Nous avons également besoin de milieu de culture cellulaire, des cellules elles-mêmes que nous cultivons dans des flacons en plastique. Nous avons également besoin de billes de soufflage de trois millimètres, de tubes coniques de 50 ml, et d'une centrifugeuse capable d'effectuer une centrifugation à haute vitesse, d'environ 18 000 G, afin de former un culot de nos bactéries, mais aussi capable d'atteindre environ 3 000 G ou 2 500 G pour former un culot de nos cellules hôtes. La première étape consiste donc à partir de nos cellules cultivées.Elles sont bien cultivées, n'est-ce pas ? Ce sont des flacons T75. Ils contiennent 15 ml de milieu de culture, tout comme nous.La première étape consiste à interrompre la couche cellulaire et à récolter les cellules dans un tube conique de 50 ml. Il suffit alors de passer la pipette de haut en bas sur la couche cellulaire afin de détacher toutes les cellules et de les disperser dans le milieu. Une fois les cellules en suspension dans le milieu, on les aspire délicatement à l’aide d’une pipette pour les transférer dans le tube conique.À présent, nous allons ajouter des billes de verre de trois millimètres à chacune des deux suspensions cellulaires. Ces billes ont été autoclavées et peuvent en réalité être réutilisées. Elles peuvent être lavées, trempées dans de l'eau de Javel, puis autoclavées avant une nouvelle utilisation.Vous versez simplement en veillant à ne pas toucher l'embout du flacon B avec l'embout du tube de centrifugation. Nous ajoutons environ jusqu'au trait de 5 millilitres de billes de verre dans chaque tube de centrifugation. Ensuite, nous devons rompre physiquement les cellules eary afin de libérer nos bactéries dans la suspension.Nous utilisons un vortex, que nous réglons à la vitesse maximale, puis nous vortexons pendant cinq minutes. Nous vortexons maintenant les cellules avec les billes de verre de trois millimètres pendant cinq minutes, puis nous pipetons le surnageant à l’aide d’une pipette propre dans un tube de centrifugation propre et stérile de 50 mL. Nous recueillons notre suspension nouvellement créée, qui contient les bactéries libérées en solution ainsi que les débris cellulaires entiers.La prochaine étape consiste donc à effectuer une centrifugation à basse vitesse afin de faire précipiter les débris cellulaires tout en maintenant les bactéries en suspension. Nous allons utiliser une centrifugeuse, à 2 500 ×g pendant 10 minutes. Nous effectuerons également la centrifugation à quatre degrés Celsius afin de favoriser la formation du culot au fond des tubes.Nous le plaçons simplement ici, nous assurons son équilibre, fermons le récipient, puis centrifugeons pendant 10 minutes. J'ai maintenant centrifugé notre surnageant contenant les débris des cellules hôtes ainsi que les bactéries purifiées. J'ai effectué la centrifugation à 2 500 ×g pendant 10 minutes.Et comme vous pouvez le voir, j'ai un culot au fond de mon tube qui consiste en des débris de cellules végétales. Mes bactéries nouvellement libérées se trouvent toujours dans le surnageant, car la centrifugation n'a pas été suffisamment forte pour les faire précipiter également. La prochaine étape consistera donc à prélever le surnageant et à le filtrer à travers un filtre de cinq microns.Il s'agit donc d'un filtre de cinq microns qui peut s'adapter à n'importe quelle seringue. J'utilise ici une seringue de 30 ml, mais vous devez simplement tirer le piston vers le haut, puis, sans toucher le filtre lui-même, en particulier la partie située ici en bas, qui doit rester stérile, fixer la seringue au filtre en la vissant, avant de comprimer doucement le piston pour faire passer le surnageant à travers le filtre et dans notre tube.Ne pas appuyer trop fort, car vous pourriez endommager le filtre et l'empêcher de fonctionner. Si vous devez exercer une pression importante, vous devez retirer votre filtre et le remplacer, car cela signifie qu'il est obstrué par des débris cellulaires. À ce stade, selon le volume obtenu, et comme méthode supplémentaire pour obtenir une culture bactérienne très pure, nous ajoutons habituellement 250 millimoles de solution de saccharose, stérilisée par filtration, dans notre tube de centrifugation à grande vitesse.Remplir la bouteille à environ au moins 80 % de sa capacité. Nous la remplissons habituellement jusqu’au col. Ces tubes doivent être remplis à ce niveau afin qu’ils n’implosent pas à l’intérieur de notre centrifugeuse à grande vitesse.Très bien, maintenant nous allons centrifuger notre surnageant et concentrer nos bactéries purifiées à 18 000 ×g dans cette centrifugeuse à grande vitesse. Nous devons donc veiller à placer nos tubes de manière équilibrée, bien sûr, puis nous la fermons. Nous allons la régler sur 10 minutes.Et nous aimons effectuer cette opération à 10 degrés Celsius ou moins, température qui est réglée ici. Ensuite, notre vitesse angulaire pour ce rotor spécifique dans la centrifugeuse est de 12,5 tours par minute. Nous disposons d'un tableau de conversion, de sorte qu'elle tournera à environ 18 670 fois G. Nous avons donc effectué notre rotation à grande vitesse en centrifugeuse afin d'obtenir un culot de nos bactéries purifiées.Maintenant, comme vous pouvez le constater, nous avons un bel agrégat bactérien au fond de notre tube à grande vitesse. Ce que nous allons faire maintenant, c'est transférer tout le surnageant dans un contenant pour déchets liquides. Ce que nous devons faire à ce stade, c'est remettre en suspension nos bactéries.Je vais la resuspendre dans deux millilitres de notre milieu de culture, c'est-à-dire le milieu pour insectes de Schneider, complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur. Je vais simplement resuspendre le culot en aspirant et en rejetant la solution plusieurs fois jusqu'à ce que toutes les bactéries soient redevenues en suspension. Maintenant que nos bactéries sont de nouveau en suspension, nous allons effectuer une étape supplémentaire de purification afin d'éliminer tout débris éventuel de cellules hôtes.Pour cela, nous allons utiliser un filtre de 2,7 micromètre. Ce que j'aime faire, c'est utiliser le boîtier en plastique de notre filtre de cinq micromètres comme support. Nous pouvons ainsi prélever notre solution, visser la seringue sur le filtre de 2,7 micromètre, puis filtrer dans un tube destiné au stockage à long terme.Comme pour l'autre filtre, appuyez doucement sur le piston. Nous obtenons ainsi notre solution de bactéries purifiées. La prochaine étape que je vais vous montrer est la manière dont nous évaluons la viabilité.Nous utilisons le kit de viabilité bactérienne « live dead » avec rétroéclairage de Molecular Probes. Ce kit comprend deux colorants : l'iodure de propidium et le cyto neuf. L'iodure de propidium est rouge, il fluoresce en rouge et colore uniquement les bactéries dont la membrane n'est pas complètement intacte, tandis que le cyto neuf colore toutes les bactéries.Ainsi, lorsque vous observez ces bactéries au microscope équipé d'optiques à fluorescence, toutes les bactéries émettront une fluorescence verte, tandis qu'un sous-ensemble, constitué des bactéries mortes, émettra une fluorescence rouge. Nous prélevons un petit aliquot de notre échantillon purifié et, dans ce cas, je vais prélever seulement 10 microlitres, juste assez pour réaliser une lame. Et je vais en distribuer une partie dans deux autres.Ensuite, je vais ajouter nos deux autres colorants, juste un microlitre du mélange d'iodure de propidium et de cyto nine, à notre suspension bactérienne. Puis vous pouvez laisser incuber à l'obscurité pendant 15 minutes. Nous constatons toutefois qu'il est en réalité possible de monter l'échantillon et de l'observer presque immédiatement pour voir vos résultats.Très bien, maintenant je vais observer au microscope mon prélèvement contenant les bactéries colorées avec la solution de coloration rétroéclairée pour cellules mortes. Je vais en déposer une goutte sur ma lame, poser une lamelle par-dessus, puis procéder à l’observation. J’utiliserai notre filtre mixte rouge et vert afin d’évaluer la viabilité de mes bactéries.Donc, lorsque j'ouvre l'obturateur, j'observe mes bactéries, qui apparaissent plus ou moins comme de minuscules points. Mais je constate ici qu’environ 90 à 95 % des bactéries sont vertes, alors que seulement environ 5 % sont rouges. Nous avons donc un taux de viabilité très élevé, n'est-ce pas ?J'ai donc terminé de vous présenter la purification de Akia viable à partir de cellules d'insectes en culture. Ce protocole comprenait la lyse physique des cellules hôtes eucaryotes, suivie d'une centrifugation différentielle pour isoler les bactéries purifiées, ainsi que plusieurs étapes de filtration afin de garantir la qualité des bactéries purifiées et d'éliminer complètement tous les composants des cellules hôtes. Ensuite, nous avons décrit le test d'évaluation de viabilité « live/dead » par microscopie en contre-éclairage, qui utilise deux colorants pour évaluer la viabilité des bactéries.Et vous pouvez utiliser, dès maintenant, vos bactéries purifiées dans diverses applications, notamment l'infection d'autres systèmes cellulaires en culture afin d'augmenter l'infection d'un système spécifique. Vous pouvez également réaliser des études métaboliques ou de nombreuses autres études à l'aide de vos bactéries purifiées vivantes.

maintaining-wolbachia-in-cell-free-medium

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wolbachia infection bactérienne chez la drosophile

Isolation vampirique de fluide extracellulaire d&#39;<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Cette vidéo présente une méthode permettant d’isoler et de cultiver stérilement des cellules embryonnaires de C. elegans  in vitro.

Digestion enzymatique et dissociation manuelle : une méthode pour préparer les embryons de C. elegans pour la culture cellulaire

C. elegans est généralement cultivées sur des plaques de gélose solide ou dans des cultures liquides ensemencés avec E. coli. Pour éviter des sous-produits bactériens de confondre les études toxicologiques et nutritionnels, nous avons utilisé un milieu liquide axénique, CEHR, de croître et de synchroniser un grand nombre de vers pour une gamme d'applications en aval.

Culture Caenorhabditis elegans En Axenic Liquid Media et création d'transgéniques Worms par bombardement de microparticules

Les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia sont libérés dans les populations naturelles de supprimer la transmission des arbovirus. Nous décrivons des méthodes arrière Ae. aegypti Wolbachia infections en laboratoire pour des expériences et sortie de terrain, prendre des précautions pour réduire au minimum la sélection et l’adaptation de laboratoire.

Maintenir les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia

Ce protocole décrit comment établir une infection virale in vivo chez Drosophila melanogaster en utilisant la méthode de nano-injection et les techniques de base pour analyser l’interaction virus-hôte.

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Quatre méthodes ont été utilisées pour détecter les Wolbachia intracellulaires, qui se complétaient et amélioraient la précision de la détection de l’infection à Wolbachia de aa23 dérivé d’Aedes albopictus et de l’Aa23-T guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques.

Détection de la souche wAlbB de Wolbachia dans les lignées cellulaires d’Aedes albopictus

Les nématodes entomopathogènes vivent en symbiose avec les bactéries et, ensemble, ils infectent avec succès les insectes en sapant leur système immunitaire inné. Pour promouvoir la recherche sur la base génétique de l’infection par les nématodes, des méthodes de maintien et de manipulation génétique des nématodes entomopathogènes sont décrites.

Cultiver et manipuler génétiquement des nématodes entomopathogènes

Un protocole optimisé pour la culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits microfabriqués est présenté ici. Cette approche permet de surveiller chaque animal tout au long de sa vie pour une variété de phénotypes liés au vieillissement et à la santé, y compris l’activité, la taille et la forme du corps, la géométrie du mouvement et la survie.

Culture à long terme et surveillance de Caenorhabditis elegans isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits

Ici, nous présentons un protocole de culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides pour le suivi des paramètres physiologiques tout au long de la vie et la quantification de la fluorescence. Ce système de culture comprend une barrière d’acide palmitique autour des puits à ver unique pour empêcher les animaux de fuir, ce qui permet l’utilisation d’interventions aversives, y compris des bactéries pathogènes et des facteurs de stress chimiques.

Culture à long terme de Caenorhabditis elegans individuelle sur milieu solide pour la surveillance longitudinale de la fluorescence et les interventions aversives

Les lignées cellulaires sont utiles dans les études sur les organismes intracellulaires qui ne peuvent pas être cultivés en dehors de leurs cellules hôtes. Bien que les lignées infectées par Wolbachia aient permis de nombreuses découvertes, l’hétérogénéité au sein de ces lignées peut conduire à des résultats expérimentaux variables. Nous présentons un protocole pour générer des clones unicellulaires et des cultures continues à partir de cellules JW18 infectées par Wolbachia.

Génération de cultures monoclonales à partir de la lignée cellulaire de Drosophila melanogaster JW18 infectée par Wolbachia

Découvrez la purification de Wolbachia pipientis à partir de cellules d'Anopheles gambiae par lyse aux billes de verre et centrifugation différentielle. Cette méthode permet d'obtenir des bactéries viables pour des études en biologie des vecteurs.

Le maintien de Wolbachia dans la cellule sans moyen

Explorer plus de vidéos