Name: Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à laide complète dalimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Apprenez à adapter et maintenir des cellules iPS humaines en culture sans couche nourricière en utilisant le milieu KnockOut Serum Replacement. Cette méthode améliore la reproductibilité et la croissance cellulaire.

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Remarque: Pour maintenir des conditions de culture stérile, toutes les procédures dans ce protocole sont réalisées en utilisant des pratiques de laboratoire stérile et réalisée sous hotte à flux laminaire. Avant de commencer, s'assurer que tout média est équilibré à 37 ° C et de manière appropriée gazés. Préparation des boîtes de culture Geltrex enduits Note: voir l'annexe pour l'utilisation de plats CELLstart culture revêtues <ol><li> Dégeler un tube de Geltrex (1 ml) lentement à 2-8 ° C et diluer 1:100 c'est dans 99 ml de Knockout D-MEM/F-12. Mélanger délicatement la solution. Remarque: Certaines des lignées de cellules iPS peuvent nécessiter une dilution différente Geltrex pour une croissance optimale. Voir l'annexe pour des dilutions alternatives. </li><li> Couvrir toute la surface de chaque boîte de culture avec la solution Geltrex (1 ml pour un plat de 35 mm, 1,5 ml pour un plat de 60 mm). </li><li> Sceau chaque plat avec du Parafilm pour éviter le dessèchement et incuber les plats pendant 1 heure à 37 ° C. Remarque: À ce stade, vous pouvez stocker les boîtes de culture Geltrex enduits à 4 ° C jusqu'à un mois. Sceau chaque plat avec du Parafilm pour empêcher la Geltrex de se dessécher. </li><li> Avant d'utiliser, de transférer les plats Geltrex enduits d'une hotte à flux laminaire et de leur permettre de s'équilibrer à température ambiante (environ 1 heure). </li></ol> Préparation complète d'alimentation sans SR KnockOut Medium <ol><li> Pour préparer 1 mL de 10 ug / ml solution FGF basique, de façon aseptique mélanger les composants énumérés ci-dessous. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C jusqu'à 6 mois. <table border="0"><tbody><tr><td> FGF basique </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 uL </td></tr><tr><td> 10% de BSA </td><td> 10 uL </td></tr></tbody></table> Remarque: BSA peut être substitué avec HSA ou SR Knockout à la même concentration. </li><li> Pour préparer 50 ml de solution 2 Dispase mg / mL, de façon aseptique mélanger les composants énumérés ci-dessous. Filtre stériliser la solution et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Pour préparer 100 ml de SR KnockOut complète Feeder-Free (KSR-FF) moyennes aseptiquement combiner les composants répertoriés dans le tableau ci-dessous. <table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Concentration Stock </td><td> Concentration finale </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Cat. no. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 ml </td></tr><tr><td> Glutamax-I (cat. n ° 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR (Cat. no. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (Cat. no. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. n. PHG0024) </td><td> 10 ug / ml </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 uL </td></tr></tbody></table> Vous pouvez ranger le support KSR-FF à 2-8 ° C jusqu'à une semaine. </li><li> Juste avant la pré-équilibration du milieu complet à la température et de gaz, ajouter aseptiquement le volume requis de 2 mercaptoéthanol (55 mM de concentration des stocks) pour une concentration de 0,1 mM final. Par exemple, pour préparer 100 ml de KSR-FF moyennes ajoutez 182 uL de 55 mM de 2-mercaptoéthanol (1:550 dilution) Alternativement, le 2-mercaptoéthanol peuvent être ajoutés au milieu de 1X terminé et stocké à 2-8 ° C pour jusqu'à une semaine. </li></ol> S'adapter aux iPSCs KSR-FF Medium <ol><li> Avant de commencer, pré-équilibrer votre vaisselle Geltrex revêtement à la température ambiante dans la hotte. </li><li> Culture du iPSCs sur des cellules nourricières MEF jusqu'à ce qu'elles soient confluentes à 70-80%. S'il vous plaît se référer au manuel de fibroblastes de souris embryonnaires GIBCO pour les protocoles de culture à base MEF. </li> Pré-chauffer le volume requis de Dispase dans un bain d'eau à 37 ° C. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis. <li> Pré-équilibrer le volume requis de KSR-FF dans un bain à 37 ° C pendant 15 min de l'eau. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis. </li><li> Aspirer le support des boîtes de culture, et d'ajouter une quantité appropriée de solution Dispase. Incuber les boîtes à 37 ° C pendant 3-5 minutes. </li><li> Aspirer la solution Dispase de chaque navire de la culture et de laver les cellules nourricières MEF doucement avec du D-PBS (2 à 3 fois). </li><li> Ajouter une quantité appropriée de milieu KnockOut SR complets pour chaque navire de la culture. Utilisez un grattoir cellulaire ou une pipette de 5 ml à gratter délicatement les cellules de la surface du récipient de culture. Note: voir l'annexe pour l'adaptation des protocoles alternatifs pour les lignes dures cellule de s'adapter iPS, </li><li> Recueillir la suspension de cellules de chaque boîte de culture en tubes séparés 15 ml conique. Rincer chaque récipient de culture avec une quantité appropriée de milieu KnockOut SR complets, et ajouter le D-PBS rincez moyenne dans les 15 ml tubes coniques contenant la suspension cellulaire. Soyez prudent de ne pas briser les mottes de cellules dans des cellules individuelles </li><li> Centrifuger les tubes coniques 15 ml à 200 xg pendant 5 minutes pour culotter les iPSCs. </li><li> Aspirer le surnageant du culot IPSC. Reprendre le culot dans une quantité appropriée de KSR-FF moyennes selon le rapport de split (tableau 1). Ne pas casser les mottes de cellules d'une taille plus petite, parce que les amas plus petits de ne pas attacher ainsi à la surface. Remarque: Nous recommandons un rapport de division de 1:2 pour les 3 premiers passages après la iPSCs ont été repiquées directement du milieu iPSC Culture MEF à KSR-FF moyenne. Normalement, un rapport de split 1:03-1:05 est approprié, mais au repiquage 01h02 assure la plus grande densité de cellules nécessaires lors de l'adaptation à une culture nourricier libre. </li><li> Avant de plaquer les iPSCs sur les plats Geltrex revêtement, aspirer résiduelle solution Geltrex de l'antenne de pré-enduit, et ajoutez lentement une quantité appropriée de suspension cellulaire à chaque boîte de culture. Remarque: ne pas rincer la vaisselle avant le placage. </li><li> Déplacer la boîte de culture avant en arrière et côté à l'autre à plusieurs reprises pour disperser les cellules sur la surface du plat. Placez délicatement la boîte de culture dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère humidifiée de 4 à 6% de CO 2 dans l'air. Remplacez le support passé avec KSR-FF tous les jours. </li></ol> Le repiquage de cellules iPS humaines utilisant KSR-FF <ol start="13"><li> Respecter les iPSCs humaine de plus en plus complète KSR-FF sous le microscope pour confirmer que les cellules sont confluentes à 70-80% et prêt à être repiquées. Se reporter à la figure 1. Remarque: Si les colonies deviennent trop dense ou trop grande, une différenciation accrue survient. </li><li> Découper et retirer toutes les colonies différenciées iPSC avant repiquage de la culture. </li><li> Pré-chauffer le volume requis de Dispase dans un bain d'eau à 37 ° C. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis. </li><li> Pré-équilibrer le volume requis de KSR-FF dans un bain à 37 ° C pendant 15 min de l'eau. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis. </li><li> Aspirer le milieu épuisé du récipient de culture à l'aide d'une pipette, et rincer les cellules deux fois avec du D-PBS. </li><li> Ajouter délicatement solution de dispase préchauffée à la cuve de culture (par exemple, 1 ml de solution de dispase par boîte de culture de 60 mm). Agiter le récipient de culture pour enrober la surface des cellules entières. </li><li> Incuber le récipient de culture à 37 ° C pendant 3 minutes. </li><li> Retirez le récipient de l'incubateur, aspirer la solution Dispase, et laver délicatement les cellules avec du D-PBS. </li><li> Gratter délicatement les cellules de la surface de la boîte de culture cellulaire à l'aide d'un grattoir, et le transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml stérile. </li><li> Rincer la boîte de culture à deux reprises avec KSR-FF, doucement "pulvériser off" toutes les cellules qui n'ont pas détaché. Piscine de rinçage moyenne avec des cellules dans le tube de 15ml. </li><li> Centrifuger le tube à 200 xg pendant 5 minutes à température ambiante pour un culot cellulaire. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire et le jeter. </li><li> Tapotez doucement le tube pour bien déloger le culot cellulaire du fond du tube. </li><li> Doucement remettre les cellules en pré-équilibrée KSR-FF aide d'une pipette 5mL sérologique. Ne pas triturer. Remarque: il est essentiel à l'étape pour remettre les cellules en douceur, sans utiliser la force pour éviter tout dommage. </li><li> Transférer les cellules d'une nouvelle de 60 mm Geltrex revêtement plat à rapport de division désiré et déplacer la boîte de culture avant en arrière et côté à l'autre à plusieurs reprises pour disperser les cellules à travers sa surface. </li><li> Placez la boîte de culture dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère humidifiée de4 à 6% de CO 2 dans l'air. </li><li> Le lendemain, doucement remplacer le milieu passé avec KSR-FF pour éliminer les débris cellulaires. Remplacez le support passé tous les jours par la suite. Observez les cellules iPS quotidienne et le passage au besoin (environ tous les 4-5 jours). Le repiquage est recommandé lorsque les cellules atteignent 70-80% de confluence. Pour la cryoconservation de cellules iPS et de dégel, reportez-vous à notre protocole intitulé «cryoconservation et récupération des cellules iPS humaines à l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium". </li></ol> Résultats attendus <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Culture cellulaire au microscope ; étude de la croissance cellulaire ; l’imagerie microscopique ; la recherche biologique." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. L'image en contraste de phase ci-dessous montre iPSCs cultivés sur des boîtes de culture Geltrex revêtement à l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum moyenne. Les CISP présentent une morphologie similaire aux CSEh, caractérisé par de gros noyaux et cytoplasme. (Grossissement 40x) <table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Plat 35mm </td><td> Plat 60mm </td><td> Plat 100mm </td></tr><tr valign="top"><td> Remplissez KnockOut SR moyennes </td><td> 2 ml </td><td> 4 ml </td><td> 10 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Solution Geltrex </td><td> 1 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 ml </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr valign="top"><td> D-PBS pour le rinçage </td><td> 2 ml </td><td> 4 ml </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Volumes recommandés <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">S'il vous plaît cliquer ici pour voir l'appendice</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 sans gène</td><td></td><td>Cat. n° 12660-012</td><td>Remarque : voir l'annexe pour l'utilisation de produits DMEM alternatifs</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. n° 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Remplacement sérique KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR, n° de catalogue 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de facteurs de croissance de remplacement sérique KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, n° de catalogue A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF basique, protéine recombinante humaine, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, n° de catalogue PHG0024</td><td>Remarque : voir l'annexe pour les autres tailles d'emballage du bFGF.</td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol&amp;#8211;éthanol</td><td></td><td>Cat. n° 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>N° de catalogue 17105-041</td><td>Remarque : voir l'annexe pour des méthodes alternatives de relèvement.</td></tr><tr><td>Geltrex matrice basale à facteurs de croissance réduits, qualifié pour cellules souches embryonnaires humaines, 1 mL</td><td></td><td>Cat. no. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) sans calcium ni magnésium </td><td></td><td>Cat. n° 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Hotte stérile pour culture de tissus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur réglé à 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie réglé à 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire traitées de 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chargeur sans adaptation, de la culture et de repiquage des cellules ips humaines à l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement knockout sérum medium

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

La découverte en 2006 que les fibroblastes humains et de souris pouvaient être reprogrammées pour produire des cellules iPS 1-3 avec des qualités remarquablement similaires aux cellules souches embryonnaires a créé une nouvelle source précieuse de cellules pluripotentes pour la découverte de médicaments, la thérapie cellulaire, et la recherche fondamentale. Les médias et les réactifs GIBCO ont été à la pointe de la recherche de cellules souches pluripotentes pendant des années. Knockout DMEM supplémenté avec remplacement Knockout sérum est le média de choix pour la croissance des cellules souches embryonnaires et maintenant la culture de cellules iPS 3-9. Cet or média standard du système peut maintenant être utilisé pour le chargeur sans la culture avec l&#39;ajout de SR Knockout facteur de croissance cocktail. Traditionnelle ES humaines et des méthodes de culture de cellules iPS nécessite l&#39;utilisation de la souris ou humains couches nourricières de fibroblastes, ou le chargeur milieu conditionné. Ces méthodes de culture sont une main-d&#39;œuvre, dur à l&#39;échelle et il est difficile de maintenir les cellules indifférenciées hanches à cause des conditions indéfini. Invitrogen a développé SR Knockout facteur de croissance cocktail pour vous permettre de passer facilement vos cultures hanches cellule d&#39;alimentation sans tout en conservant votre utilisation du SR Knockout.

Le protocole suivant fournit des instructions pour l&#39;adaptation humaine souches pluripotentes induites (iPS) à la desserte de culture sans l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement KnockOut Sérum moyennes (KSR-FF). Une fois adaptée, des instructions pour l&#39;entretien continu sont également fournis.

Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

La découverte, en 2006, que des fibroblastes humains et murins pouvaient être reprogrammés pour générer des cellules iPS 1-3 présentant des qualités remarquablement similaires à celles des cellules souches embryonnaires...

L'objectif général de cette procédure est d'adapter et de maintenir des cellules souches pluripotentes induites humaines en culture sans cellules nourricières, en utilisant un milieu sans sérum complété par un substitut de sérum knockout. Cette adaptation s'effectue en préparant tout d'abord des plaques recouvertes de gelt, de TRX ou de CellStart. La deuxième étape de la procédure consiste à repiquer vos IPS depuis des MEF vers un milieu sans cellules nourricières en utilisant l'espace de disque.La dernière étape de la procédure consiste à maintenir continuellement vos cellules IPS sans cellules nourricières. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une croissance cellulaire et une pluripotence similaires à celles observées avec les cultures sur fibroblastes de souris, grâce à une immunomarquage avec des marqueurs de pluripotence. Bonjour, je suis Kate Wagner sur le site GIB co de Life Technologies.L'avantage principal de cette technique par rapport aux techniques existantes est que vous pouvez gagner du temps et améliorer la reproductibilité de votre culture cellulaire en utilisant un substitut de sérum sans sérum tout au long de votre flux opératoire. Aujourd'hui, la gamme des produits Knockout comprend une liste complète de milieux et de réactifs pour des conditions avec cellules nourricières, sans cellules nourricières et sans composants xénogènes destinées aux cellules souches embryonnaires humaines, aux cellules souches embryonnaires murines et aux cellules souches pluripotentes induites. Le KSR peut être utilisé pour l'établissement, la croissance, l'expansion, la cryoconservation et les premières étapes de la différenciation.La vidéo suivante vous montrera comment adapter et conditionner vos cellules en utilisant du KSR dans des conditions sans cellules nourricières. Des boîtes de culture revêtues de Gel TRX sont nécessaires pour adapter et conditionner les cellules souches pluripotentes induites humaines dans des conditions sans cellules nourricières. Un jour avant la préparation de ces boîtes revêtues, décongelez lentement un tube de gelt TRX en le laissant toute la nuit au réfrigérateur. Le jour suivant, diluez le tube de gelt TRX décongelé au 1/100 dans du milieu basal en transférant un millilitre de gel Rex dans un flacon contenant 99 millilitres de milieu basal. Mélangez délicatement la solution.Nous recommandons d'utiliser le milieu basal D-M-E-M-F 12 sans sérum, mais veuillez consulter le texte du protocole pour d'autres options. Recouvrez entièrement la surface de chaque boîte de culture avec la solution Gel Rex. Pour chaque boîte de 60 millimètres, ajoutez 1,5 millilitre de solution Gel Trek.Incuber les boîtes pendant une heure à 37 degrés Celsius. D'autres plaques peuvent être enveloppées dans du papier paraffiné et conservées au réfrigérateur jusqu'à quatre semaines. Un supplément de gelt TRX dilué peut être prélevé et stocké entre -20 et -80 degrés Celsius, mais il faut éviter plusieurs cycles de congélation-décongélation avant utilisation.Transférez les plaques revêtues de TRX gelt dans un hotte à flux laminaire ou une hotte de sécurité et laissez-les équilibrer à température ambiante. En outre, préparez tous les autres réactifs nécessaires et assurez-vous que tous les milieux sont équilibrés à 37 degrés Celsius et correctement gazéifiés. Pour adapter les IPC humaines à un milieu sans cellules nourricières, commencez par la première culture.Les CIP sont cultivées sur des cellules nourricières à base de méthylcellulose jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 70 à 80 %. Aspirez le milieu de chaque boîte de culture de 60 millimètres et ajoutez une quantité appropriée de solution de dispase, soit un millilitre. Incubez ensuite les boîtes à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.Aspirez la solution dispa de chaque boîte de culture et rincez délicatement les cellules nourricières au méthanol avec du DPBS deux à trois fois. Ensuite, ajoutez une quantité appropriée de milieu complet avec supplémentation sérique dans chaque boîte de culture. À l’aide d’un grattoir à cellules, détachez délicatement les cellules de la surface de la boîte.Recueillir la suspension cellulaire de chaque boîte dans des tubes coniques séparés de 15 millilitres. Rincer chaque boîte de culture avec une quantité appropriée de milieu de remplacement sérique complet et ajouter le milieu de rinçage aux tubes coniques de 15 millilitres contenant la suspension cellulaire. Centrifuger les tubes coniques de 15 millilitres à 200 ×g pendant cinq minutes à température ambiante pour former un culot cellulaire.Après la centrifugation, aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Secouez doucement le tube pour détacher complètement le culot cellulaire du fond du tube. Ajoutez une quantité appropriée de milieu complet sans sérum ni cellules nourricières, selon le ratio de fractionnement souhaité.Et redisperser délicatement le culot. Ne pas fragmenter les agrégats cellulaires en éléments plus petits, car les petits agrégats s'attachent mal à la surface. Aspirer toute solution résiduelle de gel TRE des boîtes de culture préalablement recouvertes de gel Rex et ajouter lentement une quantité appropriée de suspension cellulaire dans chaque boîte de culture.Déplacez la boîte de culture plusieurs fois d'avant en arrière et de côté à côté afin de répartir les cellules sur toute la surface de la boîte. Placez délicatement les boîtes de culture dans une étuve à 37 degrés Celsius avec une atmosphère humidifiée contenant 4 à 6 % de CO2 dans l'air. Remplacez le milieu usé quotidiennement par la suite jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence d'environ 70 à 80 %.Lorsque les cellules souches pluripotentes induites humaines, cultivées dans un milieu sans sérum et sans cellules nourricières, atteignent une confluence de 70 à 80 %, elles sont prêtes à être repiquées. Si des cellules différenciées sont présentes, éliminez-les avant le repiquage. Aspirez le milieu usé à l’aide d’une pipette depuis la boîte de culture de 60 millimètres et rincez les cellules deux fois.Ajouter délicatement un millilitre de solution préchauffée à base de disque dans la boîte de culture à l’aide de DPBS. Agiter doucement la boîte de culture afin d’enduire toute la surface cellulaire. Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.Ensuite, aspirez la solution d'espace de dissociation et lavez doucement les cellules deux fois avec du DPBS, ajoutez le milieu de remplacement sérique complet, sans cellules nourricières, puis détachez délicatement les cellules de la surface de la boîte de culture. À l’aide d’un grattoir à cellules, transférez les cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Rincez la boîte de culture deux fois avec le milieu de remplacement sérique complet.Projeter doucement le milieu sans agents nourriciers pour éliminer les cellules qui ne se sont pas détachées. Récupérer le milieu à partir des deux rinçages avec les cellules dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 200 ×g pendant cinq minutes à température ambiante afin de former un culot cellulaire sans perturber le culot. Aspirez soigneusement et jetez le surnageant. Secouez doucement le tube pour détacher complètement le culot cellulaire du fond du tube. Remettez délicatement les cellules en suspension dans le supplément sérique complet.Milieu sans cellules nourricières à l’aide d’une pipette serologique de cinq millilitres. Ne pas trier. Transférer les cellules dans une nouvelle boîte de 60 millimètres revêtue de gelt TRX au ratio de division souhaité.Déplacez la boîte de culture plusieurs fois vers l’avant et l’arrière, puis de côté à côté afin de répartir les cellules sur toute sa surface. Placez la boîte de culture dans une étuve à 37 degrés Celsius avec une atmosphère humidifiée contenant 4 à 6 % de dioxyde de carbone dans l’air, le jour suivant. Remplacez délicatement le milieu usé par un milieu complet avec remplacement sérique.Alimentez avec du milieu sans agents sériques pour éliminer les débris cellulaires. Remplacez le milieu usé chaque jour par la suite. Cette image en contraste de phase montre des cellules souches pluripotentes induites humaines cultivées sur des boîtes de culture revêtues de gelt TRX, en utilisant un milieu complet de remplacement sérique sans cellules nourricières.Les CPI présentent une morphologie similaire à celle des cellules souches embryonnaires humaines, caractérisée par de grands noyaux et un cytoplasme restreint. La coloration immunohistochimique montre que les CPI cultivées dans un milieu contenant un substitut sérique de type « knockout » et un cocktail de facteurs de croissance expriment les marqueurs de pluripotence OCT4 et SSEA4. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment adapter et maintenir vos CPI dans des conditions sans sérum « knockout » et sans cellules nourricières. Voilà, c'est terminé.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Ce protocole décrit la procédure détaillée pour la cryoconservation de cellules iPS humaines dans un milieu de cryoconservation KnockOut SR et la récupération de ces cellules en complète KnockOut Feeder SR gratuit (KSR-FF) moyen ou le chargeur milieu à base de SR huitièmes de finale.

Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen

La qualité de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est dicté par la souche de souris droit tel que CF-1. Pluripotence-soutien MEF et des milieux conditionnés (CM) obtenu à partir de ceux-ci devraient contenir des concentrations optimales de l'activine A, Gremlin et Tgfβ1 nécessaires pour la activine / Nodal et des voies FGF à la co-opératoire de maintenir l'auto-renouvellement et la pluripotence.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

Malgré les efforts en cours pour les cultures de transition vers d'alimentation sans conditions, la dérivation et la culture de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) restent largement tributaires des co-cultures avec mangeoires embryonnaires de souris (MEF). Ici, nous montrons une nouvelle méthodologie pour éliminer rapidement départs à partir de cultures de CSEh avant l'expérimentation.

Suppression des fibroblastes rapide de haute densité embryonnaires humaines cultures de cellules souches

Crête neurale (NC) des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation du développement humain et de la maladie et des thérapies de remplacement cellulaire. Ici, une adaptation libre-alimentation de l'a largement...

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Ce protocole fournit une méthode pour la collecte de cellules souches embryonnaires de souris (MESC) de moyenne Climatisé (MESC-CM) dérivé de sérum (sérum fœtal bovin, FBS) - et d'alimentation (fibroblastes embryonnaires de souris, MEF) conditions sans gluten pour une cellule approche -free. Il peut être applicable pour le traitement du vieillissement et de maladies associées au vieillissement.

Collection de Serum et libre Feeder-Mouse Embryonic Stem Cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule

La caractérisation régulière des cellules souches pluripotentes induites (CSPi), afin de déterminer le maintien de leur état pluripotent, est une étape importante avant que ces cellules ne soient utilisées pour d’autres applications. Nous décrivons ici une méthode de propagation à petite échelle des iPSC humaines, spécialement conçue pour permettre leur caractérisation facile et routinière par immunocytochimie.

Propagation à petite échelle des CSPi humaines dans des conditions sans sérum pour la caractérisation immunocytochimique Routine

La production de cellules spécialisées de la rétine de cellules souches pluripotentes est un tournant dans le développement de la thérapie à base de cellules souches pour les maladies de la rétine. Le présent document décrit une méthode simple pour une génération efficace d’organoïdes rétinienne et l’épithélium pigmentaire rétinien pour la recherche fondamentale, translationnelle et clinique.

Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC

Nous présentons ici un protocole pour la différenciation des cellules souches humaines pluripotentes induites dans chaque dérivé du somite (myotome, sclérotome, dermatome et syndetome) dans des conditions définies chimiquement, qui trouve des applications dans la modélisation de maladies éventuelles et thérapies basées sur les cellules en chirurgie orthopédique.

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

Afin d’éviter les limitations associées au passage enzymatique ou mécanique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPhi) cultivées sur des cellules nourricières, nous avons mis au point une méthode rapide, efficace, rentable et à haut rendement pour la récolte de colonies de CSEh ou de CSPhi, maintenues sur une couche de cellules nourricières de fibroblastes de prépuce humain en utilisant la désadhésion médiée par l’EDTA.

Passage rapide, rentable et sans enzyme de cellules souches pluripotentes humaines sur des cellules nourricières par désadhérence médiée par l’acide éthylènediaminetétraacétique

Ici, nous présentons une méthode pour différencier et étendre les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) humain dérivé de l’iPSC avec une meilleure destruction contre diverses tumeurs malignes. Ce protocole démontre la différenciation et l’expansion des cellules CAR-NK dérivées d’iPSC optimisées pour les tueurs naturels (NK) et la mesure de l’activité antitumorale contre diverses lignées cellulaires tumorales.

Progrès dans les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique dérivé de cellules souches pluripotentes humaines induites

Apprenez à adapter et maintenir des cellules iPS humaines en culture sans couche nourricière en utilisant le milieu KnockOut Serum Replacement. Cette méthode améliore la reproductibilité et la croissance cellulaire.

Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à laide complète dalimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium (Vidéo) | JoVE Journal

Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

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