Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

L'objectif général de cette procédure est d'adapter et de maintenir des cellules souches pluripotentes induites humaines en culture sans cellules nourricières, en utilisant un milieu sans sérum complété par un substitut de sérum knockout. Cette adaptation s'effectue en préparant tout d'abord des plaques recouvertes de gelt, de TRX ou de CellStart. La deuxième étape de la procédure consiste à repiquer vos IPS depuis des MEF vers un milieu sans cellules nourricières en utilisant l'espace de disque.

La dernière étape de la procédure consiste à maintenir continuellement vos cellules IPS sans cellules nourricières. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une croissance cellulaire et une pluripotence similaires à celles observées avec les cultures sur fibroblastes de souris, grâce à une immunomarquage avec des marqueurs de pluripotence. Bonjour, je suis Kate Wagner sur le site GIB co de Life Technologies.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux techniques existantes est que vous pouvez gagner du temps et améliorer la reproductibilité de votre culture cellulaire en utilisant un substitut de sérum sans sérum tout au long de votre flux opératoire. Aujourd'hui, la gamme des produits Knockout comprend une liste complète de milieux et de réactifs pour des conditions avec cellules nourricières, sans cellules nourricières et sans composants xénogènes destinées aux cellules souches embryonnaires humaines, aux cellules souches embryonnaires murines et aux cellules souches pluripotentes induites. Le KSR peut être utilisé pour l'établissement, la croissance, l'expansion, la cryoconservation et les premières étapes de la différenciation.

La vidéo suivante vous montrera comment adapter et conditionner vos cellules en utilisant du KSR dans des conditions sans cellules nourricières. Des boîtes de culture revêtues de Gel TRX sont nécessaires pour adapter et conditionner les cellules souches pluripotentes induites humaines dans des conditions sans cellules nourricières. Un jour avant la préparation de ces boîtes revêtues, décongelez lentement un tube de gelt TRX en le laissant toute la nuit au réfrigérateur. Le jour suivant, diluez le tube de gelt TRX décongelé au 1/100 dans du milieu basal en transférant un millilitre de gel Rex dans un flacon contenant 99 millilitres de milieu basal. Mélangez délicatement la solution.

Nous recommandons d'utiliser le milieu basal D-M-E-M-F 12 sans sérum, mais veuillez consulter le texte du protocole pour d'autres options. Recouvrez entièrement la surface de chaque boîte de culture avec la solution Gel Rex. Pour chaque boîte de 60 millimètres, ajoutez 1,5 millilitre de solution Gel Trek.

Incuber les boîtes pendant une heure à 37 degrés Celsius. D'autres plaques peuvent être enveloppées dans du papier paraffiné et conservées au réfrigérateur jusqu'à quatre semaines. Un supplément de gelt TRX dilué peut être prélevé et stocké entre -20 et -80 degrés Celsius, mais il faut éviter plusieurs cycles de congélation-décongélation avant utilisation.

Transférez les plaques revêtues de TRX gelt dans un hotte à flux laminaire ou une hotte de sécurité et laissez-les équilibrer à température ambiante. En outre, préparez tous les autres réactifs nécessaires et assurez-vous que tous les milieux sont équilibrés à 37 degrés Celsius et correctement gazéifiés. Pour adapter les IPC humaines à un milieu sans cellules nourricières, commencez par la première culture.

Les CIP sont cultivées sur des cellules nourricières à base de méthylcellulose jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 70 à 80 %. Aspirez le milieu de chaque boîte de culture de 60 millimètres et ajoutez une quantité appropriée de solution de dispase, soit un millilitre. Incubez ensuite les boîtes à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.

Aspirez la solution dispa de chaque boîte de culture et rincez délicatement les cellules nourricières au méthanol avec du DPBS deux à trois fois. Ensuite, ajoutez une quantité appropriée de milieu complet avec supplémentation sérique dans chaque boîte de culture. À l’aide d’un grattoir à cellules, détachez délicatement les cellules de la surface de la boîte.

Recueillir la suspension cellulaire de chaque boîte dans des tubes coniques séparés de 15 millilitres. Rincer chaque boîte de culture avec une quantité appropriée de milieu de remplacement sérique complet et ajouter le milieu de rinçage aux tubes coniques de 15 millilitres contenant la suspension cellulaire. Centrifuger les tubes coniques de 15 millilitres à 200 ×g pendant cinq minutes à température ambiante pour former un culot cellulaire.

Après la centrifugation, aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Secouez doucement le tube pour détacher complètement le culot cellulaire du fond du tube. Ajoutez une quantité appropriée de milieu complet sans sérum ni cellules nourricières, selon le ratio de fractionnement souhaité.

Et redisperser délicatement le culot. Ne pas fragmenter les agrégats cellulaires en éléments plus petits, car les petits agrégats s'attachent mal à la surface. Aspirer toute solution résiduelle de gel TRE des boîtes de culture préalablement recouvertes de gel Rex et ajouter lentement une quantité appropriée de suspension cellulaire dans chaque boîte de culture.

Déplacez la boîte de culture plusieurs fois d'avant en arrière et de côté à côté afin de répartir les cellules sur toute la surface de la boîte. Placez délicatement les boîtes de culture dans une étuve à 37 degrés Celsius avec une atmosphère humidifiée contenant 4 à 6 % de CO2 dans l'air. Remplacez le milieu usé quotidiennement par la suite jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence d'environ 70 à 80 %.

Lorsque les cellules souches pluripotentes induites humaines, cultivées dans un milieu sans sérum et sans cellules nourricières, atteignent une confluence de 70 à 80 %, elles sont prêtes à être repiquées. Si des cellules différenciées sont présentes, éliminez-les avant le repiquage. Aspirez le milieu usé à l’aide d’une pipette depuis la boîte de culture de 60 millimètres et rincez les cellules deux fois.

Ajouter délicatement un millilitre de solution préchauffée à base de disque dans la boîte de culture à l’aide de DPBS. Agiter doucement la boîte de culture afin d’enduire toute la surface cellulaire. Incuber la culture à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes.

Ensuite, aspirez la solution d'espace de dissociation et lavez doucement les cellules deux fois avec du DPBS, ajoutez le milieu de remplacement sérique complet, sans cellules nourricières, puis détachez délicatement les cellules de la surface de la boîte de culture. À l’aide d’un grattoir à cellules, transférez les cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Rincez la boîte de culture deux fois avec le milieu de remplacement sérique complet.

Projeter doucement le milieu sans agents nourriciers pour éliminer les cellules qui ne se sont pas détachées. Récupérer le milieu à partir des deux rinçages avec les cellules dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 200 ×g pendant cinq minutes à température ambiante afin de former un culot cellulaire sans perturber le culot.

Aspirez soigneusement et jetez le surnageant. Secouez doucement le tube pour détacher complètement le culot cellulaire du fond du tube. Remettez délicatement les cellules en suspension dans le supplément sérique complet.

Milieu sans cellules nourricières à l’aide d’une pipette serologique de cinq millilitres. Ne pas trier. Transférer les cellules dans une nouvelle boîte de 60 millimètres revêtue de gelt TRX au ratio de division souhaité.

Déplacez la boîte de culture plusieurs fois vers l’avant et l’arrière, puis de côté à côté afin de répartir les cellules sur toute sa surface. Placez la boîte de culture dans une étuve à 37 degrés Celsius avec une atmosphère humidifiée contenant 4 à 6 % de dioxyde de carbone dans l’air, le jour suivant. Remplacez délicatement le milieu usé par un milieu complet avec remplacement sérique.

Alimentez avec du milieu sans agents sériques pour éliminer les débris cellulaires. Remplacez le milieu usé chaque jour par la suite. Cette image en contraste de phase montre des cellules souches pluripotentes induites humaines cultivées sur des boîtes de culture revêtues de gelt TRX, en utilisant un milieu complet de remplacement sérique sans cellules nourricières.

Les CPI présentent une morphologie similaire à celle des cellules souches embryonnaires humaines, caractérisée par de grands noyaux et un cytoplasme restreint. La coloration immunohistochimique montre que les CPI cultivées dans un milieu contenant un substitut sérique de type « knockout » et un cocktail de facteurs de croissance expriment les marqueurs de pluripotence OCT4 et SSEA4. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment adapter et maintenir vos CPI dans des conditions sans sérum « knockout » et sans cellules nourricières. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.