Induction et notation clinique de chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale

Je suis Christine Beaton. Je suis chercheuse assistante dans le laboratoire de George Chen au Département de physiologie et de biomécanique de l'Université de Californie à Irvine. Ce que je vais vous montrer au cours des prochains jours, c'est comment induire et surveiller l'EAE chronique récidivant, qui signifie encéphalomyélite auto-immune expérimentale, chez les rats DA.

Ceci est un modèle animal de la sclérose en plaques, ou devrais-je dire, l'un des modèles animaux de la sclérose en plaques. Il se caractérise par une paralysie flasque ascendante chez ces animaux ainsi que par des caractéristiques histologiques qui ressemblent à la maladie humaine. Cette procédure prendra donc plusieurs jours.

Ainsi, le premier jour, je vais vous montrer comment préparer l'émulsion génique avec un homogénat de moelle épinière rouge naïf dans un adjuvant complet de Freund. Le deuxième jour, je vais vous montrer comment immuniser les rats contre l'EAE, puis nous allons attendre entre sept et quinze jours pour observer les premiers signes cliniques chez ces animaux, moment auquel je vous présenterai les différents stades de progression de l'EAE chez les différents animaux. Je vais donc d'abord vous montrer tous les réactifs et le matériel nécessaires à la préparation de l'émulsion.

Ce que j'utilise est un adjuvant complet de H 37 ra, mais ceci, bien qu'il contienne déjà Mycobacterium tuberculosis, va être supplémenté à quatre milligrammes par ml avec davantage de Mycobacterium tuberculosis IH 37 ra desséché. Pour préparer ces bactéries desséchées, je dois les placer dans du mortier et en faire une poudre fine à l'aide d'un pilon. Une fois cela fait, je vais ajouter ces bactéries à l'adjuvant.

Ensuite, l'adjuvant est prêt. L'étape suivante consiste à préparer mon antigène. Je vais donc sortir des moelles épinières de rat D congelées à moins 80 degrés, et pour les maintenir bien congelées, je vais les placer sur un creuset de pesée contenant de la glace sèche, puis je vais les sortir une par une et, à l’aide de lames de rasoir simples, je vais hacher les moelles épinières dans les creusets de pesée.

Je vais ensuite placer mon adjuvant supplémenté sur le vortex. Et pendant l'agitation, je vais ajouter ma moelle épinière petit à petit à l'adjuvant, après avoir mélangé entièrement la moelle épinière à l'adjuvant sur le vortex. Nous allons agiter pendant encore cinq minutes, puis nous allons transférer l'émulsion préparée dans cinq seringues en verre de 5 M.

Nous allons relier deux seringues en verre de 5 ml à l’aide d’un pont de 16 G, et nous allons propulser l’émulsion d’une seringue à l’autre aussi rapidement que possible avec ce pont. Après quelques minutes, lorsque l’émulsion commence à durcir, nous passerons à un pont plus petit, de 18 G, ce qui rendra l’émulsion encore plus dense. Nous laisserons ensuite l’émulsion dans ces seringues, munies de ce pont et enveloppées dans du papier d’aluminium, toute la nuit au réfrigérateur.

J'ai donc pesé 30 milligrammes de Mycobacterium tuberculosis sur le papier de pesée. Je les ai transférés dans un mortier. Et à l'aide d'un pilon, j'ai réduit les agrégats de bactéries en une poudre fine.

Mais vous ne devez pas appuyer trop fort avec le pilon afin de ne pas briser les bactéries. Lorsque les bactéries sont regroupées au début d'une procédure, elles sont de couleur beige jaunâtre. Si vous obtenez une poudre très fine, vous aurez finalement une poudre blanche, ce qui est souhaitable, mais vous ne devez pas appuyer trop fort pour éviter de briser les bactéries.

Une fois cela fait, j'ai prélevé 10 ml d'adjuvant complet de trans, et je me suis assuré que toutes les bactéries étaient en suspension. J'ai ouvert ce prélèvement et versé les 10 ml entiers d'adjuvant complet de trans dans le mortier, au-dessus du Mycobacterium tuberculosis désagrégé. Je vais maintenant transférer l'adjuvant complet supplémenté dans un tube de 50 ml.

Je prends maintenant mon adjuvant complet trans enrichi et je le mets dans un tube. Bien sûr, les bactéries se trouvent au fond du liquide, et je vais essayer d'en transférer la majorité dans le tube. Mais si j'en laisse un peu dans le mortier, cela ne posera pas un grand problème, car je vais réutiliser ce mortier sans le nettoyer pour préparer mon émulsion de moelle épinière.

Voici donc les moelles épinières. Elles ont été conservées congelées à moins 80. J'ai pesé 10 grammes de ces échantillons pour les ajouter à 10 ml de mon adjuvant supplémenté.

Ce que je vais faire avec ces moelles épinières, tout en les maintenant congelées le plus longtemps possible, c’est les hacher très finement dans ces coupelles de pesée à l’aide de lames de rasoir. Pour hacher très finement ces moelles épinières, vous avez besoin de deux lames de rasoir et d’une coupelle de pesée. Ce que je fais, c’est prendre une moelle épinière, la placer dans ma coupelle de pesée, puis commencer à la couper, en gardant la main au-dessus, car étant congelée, elle va commencer à sauter de partout ; je récupère donc d’abord les gros morceaux, et elle va commencer à dégeler très rapidement et à coller sur le bord de ma lame de rasoir.

Donc, j'utilise un autre scalpel pour le retirer, et j'essaie de le hacher aussi finement et aussi rapidement que possible afin qu'il n'ait pas le temps de fondre, car il est beaucoup plus difficile à couper une fois fondu. Il est donc extrêmement important que la moelle épinière soit complètement hachée, très finement, car plus le hachage est fin, plus l'immersion sera homogène, et plus les rats tomberont malades avec une maladie plus homogène. Il est donc extrêmement important de bien hacher toutes ces moelles épinières, très, très soigneusement.

Je vais maintenant hacher minutieusement chacune de ces moelles épinières de la même manière, jusqu’à ce que j’aie terminé les 10 grammes entiers de moelle épinière. Ensuite, je vais mélanger légèrement la moelle épinière dans le mortier afin de m’assurer de récupérer toute la Mycobacterium tuberculosis qui restait encore dans le mortier après avoir terminé l’ajout de l’adjuvant. Puis, je vais placer l’adjuvant sur le vortex.

Et tout en vortexant continuellement aussi rapidement que possible, je vais ajouter mon cordon spinal moyen petit à petit à cet adjuvant. J'ai donc maintenant mon adjuvant supplémenté dans le vortex, et je vais commencer à ajouter, petit à petit, mon cordon spinal moyen. La raison pour laquelle j'ajoute lentement l'antigène A à l'adjuvant est que nous préparons une émulsion d'eau dans l'huile.

Ainsi, l'adjuvant est principalement de l'huile minérale, et l'antigène est une solution en quantité égale. Ce que nous voulons faire, c'est mélanger très lentement l'antigène à l'huile afin que l'huile recouvre complètement l'antigène à chaque ajout. Si nous l'ajoutions d'un seul coup, l'antigène ne serait pas entièrement recouvert par l'huile.

Je viens donc d'ajouter toute la moelle épinière moyenne à l'adjuvant dans le vortex, et j'ai placé le tube sur le vortex pour qu'il tourne encore cinq minutes afin de m'assurer que tout soit parfaitement mélangé. J'ajuste la vitesse de manière à obtenir la rotation la plus élevée possible sans perdre trop de liquide sur les bords du tube. Les cinq minutes supplémentaires de vortexage sont maintenant terminées, et je vais arrêter le vortex et transférer mon mélange dans des seringues en verre.

J'ai donc assemblé la seringue complète. Je l'ai fixée au pont de plus grand diamètre, et à l'autre extrémité du pont, j'ai fixé uniquement le corps d'une seringue, et je vais maintenant y ajouter l'émulsion. Donc maintenant, non.

Maintenant, je vais aspirer tout le liquide dans la seringue inférieure, détacher celle du haut, terminer l'assemblage de la seringue supérieure, et m'assurer qu'il n'y a aucune bulle d'air dans ma seringue inférieure ni dans le pont. Et maintenant, je vais reconnecter. J'ai donc maintenant les deux seringues reliées entre elles par ce pont.

L'un est rempli d'immersion, l'autre est vide. Ce que je vais faire maintenant, c'est pousser aussi rapidement que possible le piston d'une seringue vers l'autre, en aller-retour. Maintenant, je vais remplacer le pont de grand diamètre par un plus petit, le pont de 18 G.

Le pont plus petit va rendre l'émulsion encore plus épaisse. Pour changer de pont, je place toute l'émulsion dans une seringue. J'enlève la seringue vide, je m'assure de ne rien perdre dans le pont, retire le pont, place le nouveau, chasse toutes les bulles d'air, puis je réattache l'autre seringue.

Et je répète la procédure, sachant que l'émulsion est désormais beaucoup plus difficile à traverser, et je fais attention de ne pas rompre ce pont, qui est très fragile. Je répète cette procédure avec un autre jeu de seringues tant qu’il reste de l’émulsion dans mon tube. J’utilise donc autant de seringues que nécessaire pour consommer toute l’émulsion.

Donc, j'ai maintenant mélangé l'émulsion plusieurs fois, peut-être 10 ou 15 fois, mais cela varie selon les lots. Et maintenant, il devient extrêmement difficile de la faire passer. Je vais le faire encore quelques fois, enfin, ou peut-être pas.

Il est vraiment coincé maintenant, donc je vais le laisser en l'état. Sinon, il y a un risque de casser soit la seringue, soit le pont. Ainsi, lorsqu'il cesse d'avancer, si cela se produit très tôt, cela signifie peut-être que le pont est bouché.

Mais à ce stade, puisque je l'ai mélangé au moins 10 à 15 fois, cela signifie que l'émulsion est prête. Elle est très épaisse, donc je dois la laisser au repos. Maintenant, je vais l'envelopper dans du papier d'aluminium et la placer au réfrigérateur pour la nuit.

Donc, hier, nous avons préparé l'émulsion avec des moelles épinières rouges et nous avons laissé l'émulsion toute la nuit au réfrigérateur. Aujourd'hui, nous la sortons et nous allons injecter 200 microlitres par rat à la base de la queue. Mais avant de l'injecter, nous devons nous assurer que l'émulsion est de bonne qualité.

Il devrait donc encore être solide, et c'est toujours un bon solide. La fissure que vous voyez ici nous indique même qu'il s'agit d'un bon solide, qu'il n'est pas séparé en phases, en deux phases, ce qui serait mauvais. Cette émulsion est donc bonne à utiliser.

Ainsi, chaque cage recevra 200 microlitres de notre émulsion. Pour l'injecter, nous utilisons des seringues de trois millilitres, mais nous veillons à employer des seringues à embout verrouillable, car si nous utilisons des seringues à embout lisse, l'émulsion étant très épaisse, l'aiguille pourrait se détacher pendant l'injection.

On utilise donc toujours une seringue de type lu lock. Quant à l’aiguille, nous essayons d’utiliser l’aiguille la plus fine possible, mais étant donné l’épaisseur de l’émulsion, nous devons opter pour une aiguille de calibre 20. Étant donné que nous devons injecter de manière très précise à la base de la queue, nous anesthésions les rats pendant quelques minutes et nous profitons de ce moment où les rats sont profondément endormis pour les marquer.

Nous utilisons des perforations auriculaires, et chaque rat est identifié par un motif spécifique de perforations. Nous sommes donc maintenant prêts à injecter les rats, et nous allons administrer à chaque rat 200 microlitres d'émulsion à la base de la queue, tout en marquant simultanément les oreilles. Je ne prépare l'émulsion dans la seringue d'injection que pour un rat à la fois, car il est souvent très difficile d'effectuer l'injection et je dois exercer une forte pression ; je ne veux pas administrer à un rat une quantité supérieure à ce dont il a besoin.

Je remplis donc la seringue seulement pour une hu à la fois. Pour remplir la seringue, je relie ma seringue à injection en plastique au pont qui est lui-même relié à la seringue en verre contenant l'émulsion. J'insère environ 300 microlitres d'émulsion dans ma seringue en plastique.

Ensuite, je fixe l'aiguille et j'expulse l'air de l'aiguille afin de ne pas perdre les 50 microlitres correspondant à l'espace mort de l'aiguille. Je m'assure alors qu'il reste exactement 200 microlitres, puis j'injecte la solution à la base de la queue du rat. Maintenant que nous avons injecté tous nos cœurs, nous allons les surveiller quotidiennement.

Nous allons donc les peser chaque matin et les examiner deux fois par jour pour détecter les signes cliniques de la EAE. Les premiers signes, que je vous montrerai lorsque ceux-ci apparaîtront, seront une queue flasque, et nous nous attendons à observer ces signes chez les premiers rats vers le septième ou le huitième jour suivant l'injection. La majorité des rats tomberont malades vers le dixième au douzième jour, et les derniers rats tomberont malades vers le quinzième au dix-septième jour.

Nous sommes aujourd'hui au jour 13 suivant l'immunisation de nos souris avec l'émulsion de moelle épinière, et je vais maintenant surveiller ces animaux afin d'évaluer leur score clinique. Mais avant cela, permettez-moi de vous présenter la manière dont nous logeons nos animaux. Les maladies auto-immunes présentent cette particularité que tout pathogène présent chez l'animal va réduire la réponse auto-immune.

Pour éviter cela au maximum, nous logeons nos rats dans des conditions spécifiques. Ainsi, ils sont placés dans ce box, qui contient de l'air filtré et se trouve sous pression positive ; les animaux sont eux-mêmes logés dans des cages stérilisées par autoclavage. Absolument tout ce qui se trouve dans la cage est donc stérilisé par autoclavage avant que nous y placions le rat.

Et ils disposent de filtres placés au-dessus des cages. La nourriture est une alimentation standard pour rongeurs. Elle est stérilisée.

Nous donnons également aux rats de l'eau acidifiée. Nous prenons de l'eau de boisson normale et ajoutons de l'acide chlorhydrique selon des protocoles standard, et nous utilisons l'eau acidifiée pour maintenir la flore intestinale au minimum, ce qui réduira le risque d'altérer notre réponse auto-immune. Je suis donc maintenant prêt à effectuer l'évaluation clinique de mes rats.

La cotation varie d'un score de zéro, correspondant à l'absence de signes cliniques, à six, correspondant à un état moribond entraînant l'euthanasie des animaux. Je vais maintenant vous guider pas à pas en vous montrant des exemples de chaque score clinique que l'on peut observer dans ce modèle. Nous sommes actuellement au jour 13 suivant l'immunisation des rats à l'UCAE.

Et dans cette cage, j'ai deux rats qui n'ont pas encore été malades. Ils n'ont donc absolument aucun signe clinique de maladie. Les deux rats sont donc encore en bonne santé.

Ils courent partout, se déplacent activement, et comme vous pouvez le constater, lorsqu’ils bougent, ils soulèvent leur queue du substrat. Ainsi, parfois, ils la laissent sécher, mais la plupart du temps, ils essaient de la maintenir éloignée du substrat. Et s’ils en ont l’occasion, ils tenteront également de grimper hors de la cage, ce qui signifie qu’ils ont un contrôle complet de leurs quatre membres et qu’ils peuvent se tenir debout s’il le faut.

Ainsi, le premier signe clinique de l'AE est une queue molle. Donc, si je prends un rat et que j'appuie mon doigt contre sa queue, le rat aura tendance à s'agripper avec la pointe de la queue. Comme vous venez de le voir, ce rat n'a pas de queue molle, et je peux le faire également avec l'autre.

La queue saisit le doigt, ce qui signifie que ces rats ont une queue pleinement réactive. Ils ont un score clinique de zéro, ce qui signifie en réalité aucune manifestation clinique du tout. Voici donc un rat qui a un score clinique de 0,5.

Donc, si vous l'observez simplement dans la cage, il se comporte tout à fait normalement : il court, grimpe sur les parois de la cage, mais l'extrémité de la queue ne se détache jamais de la litière. Ce rat pourrait donc présenter une paralysie partielle de la queue. Ce que je fais alors, c'est attraper le rat et effectuer le même test ; bien que la queue présente un certain tonus, son extrémité ne s'enroule pas complètement autour de mon doigt.

Je vais donc attribuer à ce rat un score de 1,5, ce qui correspond à une queue partiellement flasque. Un score clinique de 1 est caractérisé par une queue complètement flasque, c'est-à-dire qu'aucune partie de la queue ne présente de tonicité, mais l'animal peut tout de même utiliser ses membres postérieurs. Comme vous pouvez le voir, ce rat se tient debout contre le côté de la cage, ce qui montre que ses pattes arrière fonctionnent normalement.

Mais si j'examine la queue de ces rats en les soulevant, il n'y a absolument aucun tonus dans leur queue. Un autre test que vous pouvez effectuer consiste, lorsque le RU se trouve au fond de la cage, à soulever la queue avec un RU normal : la queue descendra lentement ou n'atteindra peut-être même pas le sol, ce qui correspond à un score de un. Si vous soulevez la queue, elle retombera immédiatement au sol.

Cet RU peut bouger ses quatre membres, mais ses membres postérieurs sont trop faibles pour permettre à cet RU de se tenir debout. Je vais donc classer cet RU avec un score clinique de deux. La principale différence entre un score de un et un score de deux réside donc dans le fait qu’un score de un correspond uniquement à une queue molle.

Les pattes arrière sont pleinement fonctionnelles, et le rat obtient un score de trois lorsqu'il tombe sur le côté. Un score de deux est intermédiaire, ce qui signifie que le rat peut utiliser ses pattes arrière, mais celles-ci sont beaucoup plus faibles que celles d'un rat normal. Ce rat présente donc une caractéristique inhabituelle de la EAE.

Normalement, l'EAE se caractérise par une paralysie flasque ascendante, mais dans certains cas, assez rares, comme celui-ci, les rats développent d'abord une paralysie des membres antérieurs avant que les membres postérieurs ne soient paralysés. C'est précisément le cas de ce rat. Ainsi, si vous l'observez, sa tête est plus basse que le reste de son corps, car il éprouve des difficultés avec ses membres antérieurs et ne peut pas grimper sur le côté de la cage.

Et bien que ses membres postérieurs fonctionnent normalement, il ne peut pas pousser avec ses membres antérieurs. J'attribuerais donc encore à ce rat un score de deux, ce qui correspondrait à une parésie légère, bien que nous observions normalement cela avec les membres postérieurs dans ce RU, ici nous l'observons avec les quatre membres. Ce RU présente donc un phénotype beaucoup plus sévère que les précédents.

Il présente un score clinique de trois. Comme je vais vous le montrer, les membres antérieurs fonctionnent tout à fait normalement, mais les deux membres postérieurs présentent une paralysie modérée. Ainsi, les deux membres postérieurs sont utilisables par l'animal pour se déplacer, mais l'animal tombe sur le côté et ne peut pas contrôler complètement ces pattes.

Ces spores deviennent beaucoup plus faibles que ce qu'elles seraient normalement sans le EE. À ce stade, on ne s'inquiète plus des membres flasques de la queue, car beaucoup de ces rats finissent par avoir une queue très raide après un certain temps. Celui-ci a encore une queue très flasque, mais parfois on peut observer une dystonie. La queue commence alors à bouger de manière désordonnée.

Ainsi, à ce stade, nous n'examinons plus la queue, nous nous concentrons uniquement sur le fonctionnement des membres. Nous attribuons ici un score de 3,5, car en observant ses membres postérieurs, l'un d'eux bouge, tandis que l'autre est complètement paralysé et ne participe nullement au déplacement vers l'avant du rat. Cette situation correspond à une paralysie complète d'un membre postérieur, d'où un score de 3,5.

Cet IR présente un score clinique de quatre, ce qui signifie une paralysie complète de la ligne postérieure, caractérisée par une incapacité totale à bouger ses pattes arrière. Le rat présent dans cette cage a un score clinique de cinq, ce qui correspond à une paralysie complète de la ligne postérieure accompagnée d'une incontinence supplémentaire. Cet animal est incontinent, comme on peut le voir, il présente une perte totale de poids dans cette zone, ce que l'on n'observe pas chez les autres animaux qui ne sont pas incontinents.

Lorsque nos SHR présentent des scores de trois ou plus, nous leur fournissons des bouteilles d'eau munies de longs tubes d'abreuvement afin de s'assurer qu'ils peuvent accéder à l'eau. Nous plaçons également de la nourriture au fond de la cage et leur donnons des sachets de gel. Toutefois, malgré toutes ces mesures, chaque fois que nous sortons les rats pour les surveiller, ce qui se fait deux fois par jour, nous leur proposons systématiquement de l'eau au cas où ils n'auraient pas pu en consommer suffisamment au cours de la journée.

Ici, j'ai un rat avec un score clinique de quatre. À ce stade, il faut un peu encourager ces animaux à s'alimenter. Ce que je fais, c'est humidifier leur nourriture, ce qui la rend beaucoup plus facile à mâcher.

Ainsi, au cours des deux dernières semaines, je vous ai montré comment induire et surveiller l'EAE chronique récidivant chez les rats DA. Dans un premier temps, je vous ai montré comment préparer l'immersion de la moelle épinière, puis comment l'injecter à la base de la queue de ces rats. Et aujourd'hui, je vous ai montré comment évaluer ces rats selon différents niveaux de maladie.

Bien sûr, ceci est un modèle chronique avec rechutes, donc nous nous attendons à ce que les rats présentent des scores variables. La maladie entrera en rémission en quelques jours, puis connaîtra des rechutes au fil du temps. Certains rats entreront dans une phase plus chronique de la maladie.

Cela variera d'un animal à l'autre. Avant de terminer cette vidéo, je tiens à souligner un point important concernant les tests de médicaments sur ces modèles. Il est essentiel de randomiser les animaux aussi rigoureusement que possible.

Une chose très importante à savoir est que plus l'animal tombe malade tôt, plus sa maladie est sévère. Il ne faut donc pas regrouper tous vos animaux témoins le premier jour, et vos animaux traités pendant les jours suivants. Ce que nous faisons, c'est que dès qu'un animal tombe malade et le jour où nous souhaitons commencer le traitement, nous répartissons aléatoirement les animaux en deux groupes différents.

Si nous avons, par exemple, un groupe témoin et un groupe traité, le premier cœur ira dans le groupe témoin, le deuxième dans le groupe traité, et ainsi de suite jusqu'à ce que tous les animaux soient placés dans leur propre groupe. Mais nous veillons à ce que cette randomisation ait lieu le plus tôt possible dans le protocole. J'espère que cette vidéo vous a été utile et que vous serez en mesure d'induire et de surveiller l'EAE chronique récidivante chez les rats D.

Bonne chance avec vos expériences.