Large Scale Zebrafish-Based In vivo Écran petites molécules

L'objectif général de l'expérience suivante est de découvrir des petites molécules capables de moduler spécifiquement des aspects clés du développement embryonnaire et de la physiologie. Cette approche consiste à placer un grand nombre d'œufs fécondés dans des plaques de criblage à 96 puits lors d'une deuxième étape. Des aliquotes d'une bibliothèque de petites molécules sont ensuite ajoutées dans les puits contenant les embryons à 96 puits.

Les plaques de culture sont examinées afin de détecter les phénotypes induits par les petites molécules. Les résultats obtenus montrent quelles petites molécules affectent spécifiquement le développement ou la physiologie des super poissons. Bonjour, je m'appelle Charles Hong à la faculté de médecine de l'Université Vanderbilt.

Dans notre laboratoire, nous réalisons des criblages chimiques à haut débit en utilisant des embryons de difish. Il s'agit d'une technique relativement simple qui peut être largement adaptée pour découvrir de nouveaux composés bioactifs. L'après-midi précédant le jour du criblage chimique, préparez de 10 à 20 aquariums d'accouplement de zebrafish.

Placer un séparateur dans chaque réservoir et remplir chaque réservoir d'eau provenant du système d'aquaculture en utilisant un filet à poisson pour transférer un mâle adulte et une à deux femelles adultes dans le récipient intérieur. Dans chaque réservoir de reproduction, étiqueter les réservoirs et les couvrir d'un couvercle le matin de l'analyse. Retirer les séparateurs des réservoirs de reproduction et laisser les zebrafish s'accoupler.

Au cours de l'heure suivante, laissez les œufs fécondés tomber à travers la grille située au fond de chaque récipient intérieur. Après une heure, remettez les poissons sébères adultes dans les réservoirs de stockage permanents.

Retirer le récipient intérieur et récupérer les œufs en filtrant l'eau de chaque aquarium d'élevage à l'aide d'un tamis à thé en plastique. Retourner le tamis au-dessus d'une boîte de Pétri et rincer délicatement le tamis pour faire tomber les œufs dans la boîte de Pétri. À l'aide d'une bouteille de lavage contenant le milieu E3, éliminer tous les œufs non fécondés, qui apparaissent opaques.

À l’aide d’une pipette plastique jetable, chaque croisement d’accouplement doit produire environ 200 embryons. Ensuite, transférer environ cinq embryons dans du milieu E trois par puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Une fois les embryons répartis dans une plaque de 96 puits.

Retirer autant que possible le milieu E three des puits à l’aide d’une pipette à 12 canaux, en prenant soin de ne pas endommager les embryons. À l’aide de la pipette à 12 canaux, ajouter 250 microlitres de milieu E three.

Milieu contenant 0,5 microgramme par millilitre de canamycine ajouté dans chaque puits le plus rapidement possible afin d'éviter que les embryons ne s'assèchent. Placer les plaques de 96 puits dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade désiré, moment auquel les composés seront ajoutés. Dans ce protocole, nous recherchons des composés qui perturbent le modelage embryonnaire précoce et nous incubons les embryons pendant trois heures ou jusqu'à ce que plus de 90 % des embryons aient atteint le stade mille cellules, moment où les bibliothèques de petites molécules sont généralement fournies.

Dans une plaque source de 96 puits contenant chaque composé stocké dans du DMSO à une concentration mère de 10 millimolaire, environ 60 minutes avant que les embryons n'atteignent le stade souhaité, décongelez un nombre approprié de plaques de 96 puits contenant des aliquotes de petites molécules. Notez le numéro de série ou tout autre numéro d'identification des plaques sources afin de minimiser la condensation sur les plaques. Placer dans une chambre de dessiccation contenant un agent desséchant.

Faire une courte centrifugation des plaques dans une centrifugeuse de table équipée d’un adaptateur pour plaque multipuits. Retirer le ruban d’aluminium du plateau source à l’aide d’une pipette à 12 canaux, puis diluer les composés dans le plateau source à la concentration souhaitée avec du DMSO. Dans ce protocole, nous utilisons une concentration finale de 0,5 millimolaire et ajoutons 4,75 microlitres de DMSO pour diluer la plaque mère de 10 millimolaire.

Lorsque les embryons dans la plaque de 96 puits atteignent le stade souhaité, utilisez une pipette à 12 canaux pour transférer 2,5 microlitres de composés depuis les plaques sources vers les plaques réceptrices contenant les embryons. Couvrez les plaques contenant maintenant les embryons et les composés avec leurs couvercles, puis enregistrez le numéro d'identification des plaques sources sur les plaques d'embryons. Mélangez les plaques en les agitant doucement et placez-les dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius.

Couvrez chaque plaque source contenant des petites molécules inutilisées avec du papier d'aluminium, fixez à l'aide de ruban adhésif et placez dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pour une conservation à long terme. Avant d'effectuer l'analyse visuelle, définissez un critère précis de positivité. Par exemple, lors d'un criblage de petits inhibiteurs moléculaires du développement du cerveau antérieur, un résultat positif peut correspondre à un composé induisant la perte du cerveau antérieur.

L'absence d'yeux est un indicateur visuel simple de la perte du prosencéphale et ne nécessite aucune fluorescence pour être évaluée aux moments souhaités du développement. Retirer les plaques de 96 puits contenant les embryons traités avec le composé de l'incubateur et examiner chaque puits au microscope stéréoscopique lors du criblage d'inhibiteurs de petite molécule du développement du cerveau antérieur. Examiner les plaques à 28 heures pour détecter la perte de l'œil, qui sert de marqueur d'inhibition du développement du cerveau antérieur. Noter l'identité de la plaque et la position du puits pour tout puits dans lequel au moins trois embryons sur cinq présentent le phénotype hi prescrit. Remettre la plaque de 96 puits dans l'incubateur.

Confirmer à nouveau la perte des yeux et du prosencéphale à 48 heures. Même si les embryons ne posséderont pas de prosencéphale, ils survivront au moins jusqu'à quatre jours. Confirmer un résultat potentiel en testant à nouveau les effets du composé à plusieurs doses ; pour chaque dose, 10 embryons sont testés dans 0,5 millilitre de milieu E3 selon un format de plaque à 48 puits.

Le moment de l'ajout du composé pour le nouveau test doit être identique à celui du criblage initial. Un HIIT est confirmé lorsque le phénotype observé se reproduit de manière dépendante de la dose lors du nouveau test du composé. Enfin, identifier le composé hi à partir de la base de données de petites molécules présente dans la bibliothèque chimique.

Grâce à un écran chimique visuel basé sur le poisson zèbre, nous avons découvert une petite molécule inhibitrice du signal hedgehog en fonction de son effet sur l'axe corporel. Cette image montre des embryons exposés à l'inhibiteur hedgehog, présentant une courbure ventrale marquée de la queue. À 24 heures, les mêmes embryons examinés à 48 heures présentent toujours le phénotype de courbure ventrale.

Cette image montre l'embryon traité par le composé comparé à l'embryon mutant de la voie hedgehog. Une fois cette technique maîtrisée, une personne peut analyser environ 400 composés par semaine en seulement quelques heures. Cette technique a également ouvert la voie aux chimistes biologistes pour étudier des phénomènes tels que le développement cellulaire, les voies de signalisation cellulaire et le développement embryonnaire.

Lorsque vous manipulez des petites molécules non caractérisées, il est important de respecter les consignes de sécurité en portant une blouse de laboratoire et des gants, car ces molécules non caractérisées pourraient présenter un danger potentiel.