Name: Large Scale Zebrafish-Based In vivo Écran petites molécules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Découvrez le criblage à grande échelle de petites molécules chez l'embryon de zèbre Danio rerio pour identifier des composés modulant le développement embryonnaire. Cette méthode facilite la découverte de médicaments en biologie du développement.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) Collection d&#39;œufs de poisson zèbre <ol><li> Sur l&#39;après-midi précédant le jour de l&#39;écran chimique, mis en place 10 à 20 bassins d&#39;élevage de poisson zèbre. Remplissez chaque réservoir avec l&#39;eau du système de l&#39;aquaculture. En utilisant un filet de poisson, le transfert un mâle adulte et un à deux femelles adultes à l&#39;intérieur de conteneurs dans chaque bac d&#39;élevage. Séparez les poissons mâles et femelles de l&#39;autre avec un diviseur. Étiqueter les cages et mettre un couvercle sur eux. </li><li> Le matin de l&#39;écran, retirez les diviseurs de bassins d&#39;élevage et de permettre le poisson-zèbre pour s&#39;accoupler. Au cours de la prochaine 1 heure, permettent d&#39;œufs fécondés de tomber à travers la grille au fond de chaque récipient intérieur. </li><li> Après 1 heure, le retour de poisson zèbre pour adultes de retour aux réservoirs de stockage permanent, retirez le récipient interne et ramasser les oeufs en filtrant l&#39;eau dans chaque réservoir d&#39;élevage à travers une passoire à thé en plastique. </li><li> Inverser la crépine sur une boîte de Pétri et rincer le filtre doucement à vider les oeufs dans la boîte de Petri en utilisant une bouteille de lavage contenant le milieu de l&#39;E3. </li><li> Tous les œufs non fécondés, qui apparaissent opaque, doit être retiré à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique jetables. Chaque croix d&#39;accouplement devrait produire environ 200 embryons. </li></ol> 2) rangeant embryons en plaques de 96 puits <ol><li> Transfert d&#39;environ 5 embryons dans le milieu de l&#39;E3 dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits en utilisant une pipette Pasteur en verre. </li><li> Une fois que les embryons sont disposés sur la plaque de 96 puits, enlever autant du milieu E3 que possible hors des puits en utilisant un 12-canaux (30 - 300 ul) pipette, en prenant soin de ne pas percer l&#39;embryon. Utiliser la pipette à 12 canaux, de livrer 250 pi de milieu contenant de la kanamycine E3 0.5μg/ml à chacun des puits aussi rapidement que possible afin de ne pas permettre à des embryons à se tarir. </li><li> Mettre les plaques à 96 puits dans la pépinière 28,5 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade désiré lorsque les composés à ajouter. </li></ol> 3) Transfert de banque de petites molécules Alors que le transfert de composés peuvent être automatisées avec des méthodes de transfert de robotique, nous allons décrire la méthode de transfert manuel. <ol><li> Bibliothèques de petites molécules sont généralement fournis dans un format de 96 puits, avec chaque composé stocké dans le DMSO comme un stock de 10 mm. Environ 60 minutes avant les embryons atteignent le stade où les composés sont à ajouter, décongeler un nombre souhaité de plaques de 96 puits contenant des aliquotes de petites molécules (plaque de source). Prenez note du numéro d&#39;identification de série ou l&#39;autre des plaques source. Pour réduire la condensation sur les plaques, la décongélation peut se produire dans une chambre de dessication contenant Drierite (WA HAMMOND Drierite CO, Xenia, OH). </li><li> Brièvement spin bas les plaques dans une centrifugeuse de table équipé d&#39;un adaptateur plaque multi-puits. </li><li> Retirer le ruban adhésif en aluminium de la plaque source. Avec une pipette à 12 canaux, diluer les composés de la plaque source à la concentration de 0,5 mM (par exemple, si à partir de 250 nL aliquotes de stock 10mM, ajouter 4,75 ul de DMSO dans chaque puits). </li><li> Lorsque les embryons dans la plaque de 96 puits (plaque destinataire) atteindre le stade désiré, utiliser un 12-canaux (2-20 uL) pipette pour transférer 2.5μL de composés (0.5mm) à partir des plaques de source dans les plaques de récipient contenant le embryons. </li><li> Notez le numéro d&#39;identification des plaques de source sur les plaques d&#39;embryon receveur. Couvrir les plaques bénéficiaires désormais contenant les embryons et les composés avec des couvercles, mélanger délicatement les plaques en remuant doucement, et les placer dans un incubateur à 28,5 ° C. </li><li> Couvrir chaque plaque de source contenant de petites molécules inutilisées (0,5 mm) avec un ruban adhésif d&#39;aluminium et placer dans un congélateur à -80 ° C pour stockage à long terme. </li></ol> 4) Le dépistage des effets de petites molécules par inspection visuelle des phénotypes <ol><li> Avant de procéder à l&#39;écran, de formuler un critère spécifique pour ce qui constituerait un &quot;hit&quot;. </li><li> Au moment voulu dans le développement, enlever les plaques de 96 puits contenant le composé traités embryons de l&#39;incubateur et d&#39;examiner chaque puits sous un stéréomicroscope. Pour une meilleure visualisation des changements subtils, tels que des changements dans le modèle circulatoire, un microscope à contraste de phase inversée peut être utilisée. Fluorescent microscopie peut être utilisé pour examiner la perturbation de l&#39;expression de la GFP ou protéines DsRed sous un promoteur tissu-spécifique. </li><li> Numériser rapidement les plaques à 96 puits pour un puits dans lequel au moins 3 des 5 embryons présentent le prescrit &quot;hit&quot; phénotype. Noter l&#39;identité de la plaque et l&#39;emplacement du puits de chaque hit potentiel. </li><li> Réitérer un hit potentiel en retester les effets du composé à des doses de plusieurs (1 uM, 5 uM, 10 um et 50 um). Pour chaque dose, 10 embryons ont été testés dans 0,5 ml de presse E3 dans un format de plaque de 48 puits. Le moment de l&#39;addition composé pour le second test devrait être identique à celle du dépistage initial. Une touche est confirmée lorsque le phénotype provoqué est reproduit sur un nouvel essai sur l&#39;compound </li><li> Identifier le composé frappé de la base de petites molécules chimiques dans la bibliothèque. </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

Lors de la planification d&#39;un écran chimiques à base de poisson zèbre, une attention particulière doit être portée à la robustesse du phénotype à l&#39;étude et le taux de base du phénotype tel. Ceci est particulièrement important pour les écrans des suppresseurs chimique d&#39;un phénotype induit. Par exemple, pour un phénotype causé par un choc thermique par induction d&#39;un transgène, la condition qui provoque le phénotype reproductible doit être précisément tracé avant de lancer l&#39;écran pour éviter de trop...

<ol><li> Minimum de 20 paires de poisson zèbre adulte du génotype voulu. </li><li> Filets de poisson, les réservoirs d&#39;élevage, avec récipient intérieur amovible et séparateurs (habitats aquatiques). </li><li> Boîtes de Pétri (10 cm). </li><li> Passoire à thé en plastique. </li><li> L&#39;eau de lavage d&#39;embryon bouteille containg. </li><li> Pipettes de transfert jetables en polyéthylène. </li><li> Polystyrène plaques de 96 puits d&#39;essai à fond rond (Corning Costar, Lowell, MA). </li><li> Pipette Pasteur en verre (Fisher Scientific). </li><li> Manuel pipette pompe, 10 ml (Bel-Art Products, Pequannock, NJ). </li><li> Moyennes embryon E3: 5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, contenant 0,003% (phénylthio-urée, Sigma, St. Louis, MO) PTU. PTU peut être préparée comme une solution en dissolvant 0,3 10x-g PTU dans 1 L de médias embryon E3. Les solutions contenant du PTU devrait être protégé de la lumière en couvrant avec du papier aluminium. </li><li> 12-canaux des pipettes, 2-20 uL (Eppendorf). </li><li> 12-canaux pipettes, 300-300 uL (Eppendorf). </li><li> Jetable en polystyrène pipettes bassin, 50 ml (Fisher Scientific). </li><li> Bibliothèques de petites molécules de divers composés structurellement disposés dans un format 96-WLL à 10 mM dans le DMSO stocks. Chaque plaque maître est répartie dans des plaques de 96 puits de stockage en polypropylène (Corning), et conservés à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Aluminium Bande d&#39;étanchéité pour les plaques 96 puits (Nunc, Rochester, NY). </li><li> DMSO (Sigma, St. Louis, MO). </li><li> Base incubateur, 28,5 ° C (Fisher Scientific). </li><li> Stéréomicroscope avec la base de lumière transmise (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). </li></ol>

large scale zebrafish-based in vivo Écran petites molécules

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Compte tenu de leur taille petit embryon, le développement rapide, la transparence, la fécondité, et de nombreuses similitudes moléculaires, morphologiques et physiologiques chez les mammifères, le poisson-zèbre est apparu comme un puissant<em&gt; In vivo</em&gt; Plate-forme pour les écrans de la drogue basée sur le phénotype et l&#39;analyse chimique génétique. Ici, nous démontrons une méthode simple et pratique pour criblage à grande échelle de petites molécules à partir d&#39;embryons de poisson zèbre.

Le poisson zèbre est apparu comme un puissant<em&gt; In vivo</em&gt; Plate-forme pour les écrans de la drogue basée sur le phénotype et l&#39;analyse chimique génétique. Ici, nous démontrons une méthode simple et pratique pour criblage à grande échelle de petites molécules à partir d&#39;embryons de poisson zèbre.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Écran petites molécules

Compte tenu de la petite taille de leurs embryons, de leur développement rapide, de leur transparence, de leur fécondité et de leurs nombreuses similitudes moléculaires, morphologiques et physiologiques avec...

L'objectif général de l'expérience suivante est de découvrir des petites molécules capables de moduler spécifiquement des aspects clés du développement embryonnaire et de la physiologie. Cette approche est réalisée en plaçant un grand nombre d'œufs fécondés dans des plaques de criblage à 96 puits lors d'une deuxième étape. Des aliquotes d'une bibliothèque de petites molécules sont ensuite ajoutées dans les puits des plaques à 96 puits contenant les embryons.Les plaques de culture sont examinées afin de détecter les phénotypes induits par les petites molécules. Les résultats obtenus montrent quelles petites molécules affectent spécifiquement le développement ou la physiologie des super poissons. Bonjour, je m'appelle Charles Hong, de l'École de médecine de l'Université Vanderbilt.Dans notre laboratoire, nous réalisons des criblages chimiques à haut débit en utilisant des embryons de difish. Il s'agit d'une technique relativement simple qui peut être largement adaptée pour découvrir de nouveaux composés bioactifs. L'après-midi précédant le jour du criblage chimique, préparez de 10 à 20 aquariums de reproduction de zebrafish.Placer un séparateur dans chaque réservoir et remplir chaque

large-scale-zebrafish-based-in-vivo-small-molecule-screen

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous rapportons le développement d'un système automatisé pour l'imagerie et l'analyse des embryons de poisson zèbre transgénique dans des plaques multipuits. Ceci démontre la capacité de mesurer les effets dose-dépendante d'une petite molécule, la BCI, le Fibroblast Growth Factor expression du gène rapporteur et de fournir la technologie pour établir des écrans à haut débit chimiques du poisson zèbre.

Développement de l&#39;imagerie automatisée et d&#39;analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

Dans cet article, les embryons de poisson-zèbre sont utilisés pour le dépistage de la toxicité chimique. La toxicité chimique est corrélée aux lectures phénotypiques. L’exemple de protocole montre une approche méthodologique de la réalisation du dépistage de la toxicité chimique.

Dépistage de la toxicité chimique à base d’embryons : évaluation des effets sur le développement des embryons de poisson-zèbre

Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Cet article décrit la vidéo pipeline à haut débit qui a été mis en place avec succès pour infecter et d'analyser un grand nombre d'embryons de poisson zèbre qui fournissent un nouvel outil puissant pour les essais en enclos et la découverte de médicaments à l'aide d'un organisme entier de animaux vertébrés.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Le poisson zèbre est un excellent organisme expérimental pour étudier les processus de développement de vertébrés et modèle des maladies humaines. Ici, nous décrivons un protocole sur la façon d'effectuer un écran chimique à haut débit manuel embryons de poisson zèbre avec un ensemble de montage hybridation in situ (WISH) lecture.

Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Le poisson-zèbre est un excellent système modèle pour les études génétiques et développementales. L’implantation de billes est une technique précieuse de manipulation tissulaire qui peut être utilisée pour interroger les mécanismes de développement en introduisant des altérations dans les environnements cellulaires locaux. Ce protocole décrit comment effectuer l’implantation de microbilles dans l’embryon de poisson-zèbre.

Microbead implantation dans l&#39;embryon de poisson zèbre

Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l'extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L'expérience ne nécessite qu'une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.

Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Ce protocole décrit une procédure de dépistage de médicaments chez les larves de poisson-zèbre 3 à 7 jours après la fécondation, suivie d’une évaluation morphologique.

Dépistage de petites molécules et essais de toxicité chez les larves de poisson-zèbre à un stade précoce

Les RASopathies sont des syndromes génétiques multisystémiques causés par l’hyperactivation de la voie RAS-MAPK. Des variants potentiellement pathogènes en attente de validation émergent en permanence alors que de mauvaises preuves précliniques limitent le traitement. Ici, nous décrivons notre protocole in vivo pour tester et valider les niveaux d’activation ERK associés à RASopathy et sa modulation pharmacologique au cours de l’embryogenèse par imagerie FRET en direct chez le poisson-zèbre...

Un protocole efficace pour évaluer la modulation de l’activité ERK dans des modèles précoces de poisson zèbre du syndrome de Noonan via la microscopie FRET en direct et l’immunofluorescence

Découvrez le criblage à grande échelle de petites molécules chez l'embryon de zèbre Danio rerio pour identifier des composés modulant le développement embryonnaire. Cette méthode facilite la découverte de médicaments en biologie du développement.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Écran petites molécules

Explorer plus de vidéos