Livraison de gènes au cerveau de rat postnatal par des non-ventriculaire injection Plasmide et électroporation

Bonjour, je m’appelle RI Ov.Et je m’appelle Alexia Ying. Nous sommes des étudiants de troisième cycle de l’Université Cent. Dans cette vidéo, nous allons présenter une méthode d’électroporation in vivo pour l’administration d’un gène cible à une certaine zone d’un tissu cérébral principal.

Alors voyons voir. Voyons. La méthode d’électroporation in vivo offre un moyen rapide et efficace de délivrer des gènes d’intérêt ou de petits ARN interférents aux tissus cérébraux vivants.

Il s’agit d’une alternative peu coûteuse à la création d’animaux transgéniques et à l’approche de l’administration de gènes viraux. Dans cette vidéo, nous allons démontrer une procédure détaillée de livraison de gènes postnatals au cortex néonatal. Nous utiliserons l’encodage plasmidique pour la protéine fluorescente verte améliorée et le promoteur de la bêta-actine de poulet avec un activateur de CMV.

Nous effectuons toutes les manipulations chirurgicales dans l’armoire à flux laminaire afin de maintenir la stérilité et de minimiser le risque de contamination bactérienne ou fongique de l’animal. Pour l’administration du plasmide au cortex, nous utilisons un micro-injecteur WPI avec contrôleur électronique et une seringue Hamilton de 10 microlitres attachée à un manipulateur stéréotaxique. Le chiot rouge est anesthésié à l’aide d’une unité d’anesthésie composée d’une boîte et d’un masque.

Le chiot est ensuite fixé à l’aide de barres d’oreille sur la table chauffante fixée au manipulateur stéréotaxique. Pour la manipulation chirurgicale et le suivi de la microinjection, nous utilisons un microscope binoculaire. Pour l’électroporation, nous utilisons l’électro-opérateur in vivo CYV 21 avec des électrodes en forme de force.

Pour la récupération du chiot. Après l’anesthésie, une chambre chauffée est utilisée, nous préparons généralement 10 microlitres de la solution d’injection de plasmide dans un tube à paroi mince de 200 microlitres. Cette solution est suffisante pour plusieurs expériences.

Nous mélangeons huit microlitres de la solution plasmidique avec un microlitre de 10 XPBS et un microlitre de solution d’eau à 0,1 % de vert rapide. La concentration finale du plasmide dans la solution d’injection doit être comprise entre un et trois microgrammes par microlitre. L’utilisation de concentrations plus faibles d’ADN plasmidique réduira l’efficacité de la transfection, tandis que la concentration d’ADN plus élevée sera trop visqueuse pour être injectée à travers la pointe mince du capillaire de verre.

Pour la préparation de la pipette en verre, nous utilisons un capillaire en verre de silicate de boa avec un filament et le pooler en verre à électrode verticale sur des paramètres de mise en commun et de chauffage maximum. Ensuite, nous cassons la pointe de la pipette à l’aide d’une feuille de papier pour obtenir une pointe de 10 à 20 micromètres de diamètre. Nous vérifions la pointe, le diamètre et la forme au microscope Objectif.

À l’aide d’un capillaire mince en polymère, nous remplissons environ un tiers du volume d’une seringue Hamilton de 10 microlitres. Avec l’huile minérale, on s’assure d’éviter les bulles d’air. Ensuite, nous remplissons la pipette en verre d’huile minérale et insérons la pipette dans la seringue Hamilton.

Encore une fois, en évitant les bulles d’air. La seringue avec pipette en verre est ensuite fixée sur un micro-injecteur relié à un contrôleur. Le dispositif de micro-injection fixé sur un instrument stéréotaxique nous permet d’immerger en toute sécurité l’extrémité de la pipette en verre dans le tube avec une solution d’injection plasmidique.

Lorsque la pointe touche la surface de la solution, nous la trempons davantage d’un à deux millimètres. Ensuite, nous utilisons le contrôleur de micro-injecteur pour remplir la tuyauterie avec environ un microlitre du mélange d’injection. Toutes les expériences présentées ici sont réalisées conformément aux règlements de l’Université d’Helsinki pour les expériences sur les animaux.

Pour chaque expérience, nous remplissons une seringue étanche avec de l’isof fluorine. Nous fixons la seringue sur l’unité d’anesthésie reliée à la source de flux d’air, les promenades de l’animal et le masque fixé sur la configuration stéréotaxique. Sur l’unité d’anesthésie, nous ajustons le débit d’air à environ 250 millilitres par minute et le niveau de fluor iso à 4 %. Nous plaçons le pop rouge dans la boîte de l’animal pendant deux à cinq minutes.

Lorsque le P s’arrête de bouger, nous le mettons sur le coussin chauffant fixé à la configuration stéréotaxique. Nous positionnons la partie rostrale de la tête P’S dans le masque. Il faut généralement cinq à 10 minutes pour que le chiot entre dans l’anesthésie profonde.

Lorsque cela est réalisé, nous réduisons le débit d’isoflurane à environ 1,5 à 2 %. Nous traitons la peau de la tête du P’S avec l’éthanol à 70 % à l’aide de petits cassars et de pinces fines. Nous coupons la peau de la peau du chiot jusqu’à son front, plions les morceaux de peau sur le côté et tirons légèrement les barres d’oreille dans les orifices buccaux du crâne pour la fixation de la tête et de la peau. À l’aide d’un microscope binoculaire, on localisera le point rema sur le crâne pour identifier la région d’intérêt à l’aide des coordonnées stéréotaxiques, la position de la pipette d’injection au-dessus de cette région et marquée par la chute de 25 à 50 nanolitres de la solution d’injection sur la surface du crâne.

Nous perçons le crâne doucement et soigneusement au point marqué à l’aide d’une perceuse chirurgicale à grande vitesse sous le microscope jusqu’à ce qu’un liquide apparaisse dans la zone percée. Nous fixons les pinces d’électroporation, les électrodes sur les côtés du crâne. Nous appliquons un gel conducteur pour obtenir une meilleure conductivité.

Nous retirons la goutte de liquide de la zone percée à l’aide d’un petit tampon et trempons l’aiguille de verre dans le trou. Selon les coordonnées du site d’injection, nous avons perfusé 25 à cent nanolitres de la solution d’injection à raison de cinq à 20 nanolitres par seconde. Nous retirons ensuite rapidement la pipette et procédons immédiatement à l’électroporation.

L’électroporation se fait en appliquant cinq impulsions d’une durée de 50 millisecondes à l’amplitude d’impulsion de 99 volts et à la fréquence d’un hertz. Nous retirons les électrodes et les barres d’oreille. Nous avons cousu la peau coupée à l’aide d’une combinaison de pinces muettes et tranchantes et de fils chirurgicaux.

Nous avons placé le chiot dans une chambre chaude pendant 15 à 30 minutes pour l’aider à se rétablir après l’anesthésie. Ensuite, nous remettons le pop dans la cage de sa mère. L’expression du transgène dans les cellules transfectées avec succès apparaîtra environ 10 heures après l’électroporation et il restera stable pendant plusieurs semaines.

C’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences. Au revoir.