Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer les informations métriques et structurelles sur les protéines. Tous les complexes ligamentaires exprimant des cellules biologiques vivantes, les cellules de levure sont génétiquement modifiées pour exprimer les protéines d’intérêt attachées à une sonde fluorescente donneuse ou accepteuse. Les sondes donneuses peuvent être excitées directement par un laser.

Alors que les accepteurs ne peuvent être excités que par un transfert d’énergie d’un donneur excité à proximité, les cellules sont exposées à la lumière d’un laser proche infrarouge pulsé. L’insémination fluorescente des sondes est séparée en ses composantes spectrales par un réseau de transmission et projetée à la surface d’un réseau CCD multiplicateur d’électrons. Par conséquent, des spectres fluorescents complets de l’individu, tous les ligaments sont obtenus pour chaque position dans l’échantillon.

Le profil spectral de la fluorescence détectée dépend de l’interaction spécifique des protéines d’intérêt. Les données sont analysées pour déterminer, pour chaque pixel d’image d’une cellule de balayage, les émissions distinctes des sondes donneuse et accepteuse. L’efficacité du transfert d’énergie est déterminée à chaque pixel de l’image, puis les pixels sont courbés en fonction de leur efficacité de frette et de leur histogramme.

L’interprétation de l’histogramme permet de déterminer in vivo la protéine, la taille du complexe et la configuration. Bonjour, je m’appelle Michael Stoneman du Riku Research Group de l’Université du Wisconsin à Milwaukee. Je m’appelle Singh.

Je viens du Rikus Lab dans le Wisconsin, à Milwaukee. Le principal avantage de cette technique est que les profils d’émission complets de centaines de tous les complexes ligamentaires d’une cellule sont obtenus en un seul balayage complet de la cellule. En règle générale, la plupart des méthodes de microscopie à fluorescence nécessitent que la cellule d’intérêt soit balayée plusieurs fois afin d’accumuler suffisamment d’informations spectrales afin de déterminer l’efficacité de frette dans diverses régions d’intérêt au sein de la cellule.

Cependant, les réactions biochimiques de diffusion peuvent modifier la composition moléculaire de ces régions d’intérêt et ainsi limiter les informations obtenues lors du balayage de l’image. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude de l’interaction protéine, protéine dans les cellules vivantes, telles que quelle est la taille des oligomères nocifs ? À quelle étape du cycle de vie des protéines les oligomères cultivent-ils, et quel est le rôle de l’oligomère de cette protéine dans la fonction cellulaire ?

Le microscope à deux résolutions spectrales permet d’accumuler des informations spectrales sur les complexes olima dans la cellule d’image en balayant la focale du faisceau d’excitation sur l’échantillon d’intérêt à plusieurs endroits. Une paire de miroirs à balayage orthogonaux est utilisée pour traduire la focalisation du faisceau laser à travers l’échantillon dans deux directions différentes. Le mouvement des miroirs de balayage est contrôlé par ordinateur et synchronisé avec l’extraction des données d’intensité de fluorescence de la caméra CCD à partir des balayages linéaires, des cartes spatiales d’intensité de fluorescence correspondant à une longueur d’onde particulière de la lumière peuvent être reconstruites.

Afin de reconstruire avec précision les cartes spatiales de l’intensité de la fluorescence X et de calculer la longueur d’onde réelle correspondant à chacune de ces cartes, le protocole de balayage linéaire doit être calibré à l’aide d’une solution de fluorescéine. Pour commencer la procédure d’étalonnage, envoyez au spectre d’excitation à une longueur d’onde de 800 nanomètres, ce qui est deux fois la longueur d’onde d’excitation maximale de l’étiquette donneuse GFP deux deux à envoyer au spectre d’excitation, transmettez le prisme situé dans la cavité laser pour modifier la dispersion de la vitesse de groupe à l’aide du programme informatique auquel la caméra est interfacée. Envoyez une commande à la puce CCD pour abaisser la température de la puce CCD à sa température la plus basse possible.

Afin de réduire le bruit sombre. Pipeter 10 microlitres de solution de fluorescéine sur un couvercle de lame de microscope avec une lamelle de protection afin qu’une fine couche de l’échantillon soit uniformément dispersée dans la région entre la lamelle de couverture et la lame de microscope, placez une petite goutte d’huile d’immersion sur la surface de la lamelle. Fixez maintenant le microscope, la diapositive à la platine de translation XY, Z et transmettez la lame et la platine dans la direction de l’axe optique En ajustant manuellement l’actionneur linéaire, déplacez la lame jusqu’à ce que l’objectif du microscope entre en contact avec la goutte d’huile d’immersion, basculez la caméra sur un mode vidéo d’acquisition de données de sorte que la lumière admise frappant le réseau CCD soit affichée sur l’écran de l’ordinateur en temps réel.

Éteignez toutes les lumières ambiantes de la pièce afin de réduire le bruit de fond détecté au niveau de la matrice CCD. Ajustez lentement le micromètre contrôlant l’étage de translation dans la direction de l’axe optique pour amener l’échantillon dans le point focal du faisceau laser. Lorsque l’échantillon de fluorescéine est focalisé, l’émission apparaît sous la forme d’une ligne nette sur le réseau CCD.

Téléchargez la lecture des intensités de pixels de la matrice CCD sur l’ordinateur. Mesurez l’intensité des pixels en fonction de la position sur le réseau CCD en ouvrant la matrice téléchargée des valeurs d’intensité dans l’image J et en traçant une ligne à travers la région fluorescente. Utilisez la commande image jour.

Analysez le profil du tracé pour créer un graphique illustrant le spectre d’émission de l’échantillon de fluorescéine. Ajustez le paramètre incrémental du miroir, qui contrôle le mouvement du laser. Focalisez dans la direction Y, de sorte que les positions y adjacentes dans l’échantillon entraînent le mouvement du pic des spectres fluorescents d’exactement un pixel le long de la dimension spectrale sur le réseau CCD.

Pour surveiller cela, téléchargez l’intensité des spectres de fluorescéine pour deux positions Y différentes dans l’échantillon. Ouvrez ensuite les images d’intensité avec l’image J et trouvez la position du pixel de crête pour chacun des spectres fluorescents. À l’aide du curseur J de l’image, en laissant l’obturateur du CCD ouvert, balayez la mise au point laser sur l’échantillon dans la direction X.

La lumière émise par chaque voxel le long de la ligne de balayage doit tomber en incident sur le réseau CCD à la fin de chaque balayage linéaire, stocker les données du réseau CCD obtenues pour ce balayage linéaire, puis effacer les pixels du réseau CCD. Déplacez la position du laser. Concentrez-vous sur la direction Y de la quantité déterminée précédemment.

Ensuite, balayez le faisceau laser dans la direction X à travers l’échantillon. Une fois de plus, en laissant ouvert l’obturateur du CCD pour stocker les données. Répétez cette procédure de balayage linéaire jusqu’à ce qu’une zone physique d’environ 50 % plus grande que les dimensions d’une seule cellule biologique ait été éclairée par la lumière laser.

La relation entre le numéro de ligne d’une image à balayage linéaire particulière et la longueur d’onde doit être utilisée pour reconstruire les images afin d’obtenir plusieurs cartes faciales d’intensités fluorescentes d’ex-épouse à différentes longueurs d’onde. Pour obtenir l’image de la soumission fluorescente de l’ex-épouse pour une longueur d’onde particulière, trouvez le numéro de ligne sur l’image obtenue à partir du premier balayage linéaire qui correspond à cette longueur d’onde. Ensuite, la rangée adjacente de l’image de balayage linéaire suivante correspond à la rangée suivante de l’image d’émission fluorescente.

Pour cette longueur d’onde particulière, empilez toutes les rangées d’images qui correspondent à cette longueur d’onde pour obtenir les cartes spatiales d’intensité fluorescente XY de l’échantillon à cette longueur d’onde. Répétez cette procédure pour toutes les autres longueurs d’onde disponibles afin de collecter des données sur vos échantillons. Tout d’abord, retirez de l’incubateur les plaques contenant des colonies de levures transformées.

Il doit y avoir au moins trois types de cellules transformées. Cellules exprimant les protéines d’intérêt marquées avec les deux types de sondes fluorescentes. Cellules exprimant uniquement des protéines marquées avec les sondes fluorescentes donneuses et cellules exprimant uniquement des protéines marquées avec les sondes fluorescentes accepteurs.

Ajoutez 100 microlitres de chlorure de potassium de 100 millimolaires dans un microtube à centrifuger. Ensuite, à l’aide d’une pointe de micro-pipette, grattez trois à cinq colonies de levures de la plaque de cellules exprimant des protéines marquées à la fois avec le donneur et, à l’exception d’une sonde fluorescente et d’un inoculat, le chlorure de potassium de 100 millimolaires. Avec ces cellules, prélevez 10 microlitres de la suspension cellulaire et distribuez-la sur un microscope frais. Glisser.

Couvrez la gouttelette avec une lamelle et placez une gouttelette d’huile sur la surface de la lamelle. Ensuite, fermez manuellement l’obturateur sur la trajectoire du faisceau laser pour empêcher la lumière laser d’atteindre l’objectif du microscope. Fixez la lame du microscope à la platine de translation XY, Z et déplacez la platine de la lame dans la direction de l’axe optique jusqu’à ce que l’objectif du microscope entre en contact avec la goutte d’huile d’immersion.

Allumez maintenant l’éclairage à grand champ et accédez à l’appareil photo. Mode vidéo de collecte de données. L’image à grand champ de l’échantillon sera sévèrement floue en raison de la présence du réseau de transmission dans le trajet d’émission.

Par conséquent, placez un filtre passe-bande de petite largeur totale moitié maximum dans le chemin optique précédant le réseau de transmission. Déplacez lentement l’étape de translation dans la direction de l’axe optique tout en visualisant l’image des cellules sur l’écran de la caméra jusqu’à ce que les cellules soient mises au point. Déplacez la platine dans la direction X ou Y afin d’amener une seule cellule à l’emplacement de la focalisation du faisceau laser.

Éteignez la source d’éclairage à grand champ et retirez le filtre de chemin de bande du chemin d’émission. Débloquez le faisceau laser pendant une courte période tout en visualisant simultanément le signal reçu par le réseau CCD. Si un signal fluorescent est détecté sur le réseau CCD pendant le temps où le faisceau laser est incident sur la cellule, effectuez un balayage complet d’acquisition de données fluorescentes de cette cellule.

Il est essentiel d’utiliser les mêmes paramètres de balayage, en particulier le nombre de lignes et l’incrément de raison, tels que déterminés dans la procédure d’étalonnage démontrée précédemment. Répétez le processus d’acquisition de données de localisation cellulaire et de fluorescence pour un grand nombre de cellules exprimant des protéines attachées à la fois aux étiquettes donneuses et aux étiquettes accepteuses. Après avoir accumulé suffisamment d’images de fluorescence de cellules exprimant des protéines marquées avec les deux récepteurs, répétez tout le processus pour les deux cellules exprimant uniquement des protéines marquées avec les sondes fluorescentes du donneur et les cellules exprimant uniquement des protéines marquées avec les sondes fluorescentes accepteurs.

Enfin, reconstruisez tous les balayages pour obtenir une résolution spectrale. Les cartes spatiales d’intensité de fluorescence XY pour chaque ensemble de données à l’aide de la procédure décrite précédemment illustrée dans ces trois figures sont les cartes spatiales résultantes calculées à partir de deux mesures de microscopie à photons résolues spectralement effectuées sur une cellule de levure exprimant le récepteur stérile du facteur alpha. Des cartes bidimensionnelles des signaux donneur et accepteur ont été obtenues en analysant les profils d’émission spectrale obtenus à partir de chaque emplacement de la cellule.

Les intensités de fluorescence se voient attribuer de fausses couleurs en fonction de leurs valeurs, et l’échelle est affichée sous forme d’encart. Une carte bidimensionnelle de l’efficacité apparente des frottements a ensuite été calculée à l’aide des images KDA et KAD à l’aide des valeurs extraites de la carte des efficacités apparentes des frottements de la cellule qui venait d’être montrée, un histogramme a été préparé. Les valeurs EAPP mesurées de la cellule sont représentées par des cercles.

La ligne continue rouge représente le meilleur ajustement aux données mesurées en utilisant la somme des fonctions calciques individuelles représentées par des lignes vertes continues. L’analyse de l’histogramme, qui est décrit dans le texte du protocole, confirme que le complexe stérile de tous les ligaments du récepteur à deux facteurs alpha prend la forme d’un tétramère en forme de RBA in vivo. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures si elle est correctement exécutée.

Lors de cette expérience, il est important de maintenir la puissance de la source d’excitation faible. Il est important d’éviter l’excitation multiple du donneur par une seule impulsion.