Name: Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Découvrez la quantification des interactions protéiques GPCR in vivo par microscopie à deux photons à résolution spectrale. Cette méthode permet d'obtenir des cartes d'efficacité FRET au niveau pixel pour analyser la stœchiométrie des complexes oligomériques dans les cellules vivantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par l&#39;Initiative UW-Milwaukee recherche de croissance, l&#39;Institut du Wisconsin pour la recherche biomédicale et des technologies de la santé, et la Fondation Bradley.

<ol><li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Nanoscopy+and+Multidimensional+Optical+Fluorescence+Microscopy%22">Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy</a>. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer. New York. (2006).</li>
<li>Raicu, V., Popescu, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Integrated+Molecular+and+Cellular+Biophysics%22">Integrated Molecular and Cellular Biophysics</a>. , Springer. London. (2008).</li>
<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renaissance+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The renaissance of fluorescence resonance energy transfer.</a> Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).</li>
<li>Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+quantified+in+vivo+by+spectrally+resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer.</a> Biochem J. 385, 265-277 (2005).</li>
<li>Maurel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nat Methods. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).</li>
<li>Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+protein+interactions+with+photoquenching+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET.</a> Nat Methods. 3, 519-524 (2006).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).</li>
<li>Wlodarczyk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FRET+signals+in+the+presence+of+free+donors+and+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors.</a> Biophys J. 94, 986-1000 (2008).</li>
<li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimentelle+und+theoretische+Untersuchung+des+zwischenmolekularen+bergangs+von+Elektronenanregungsenergie.+Z.+Naturforsch%5BTitle%5D)+AND+%22A%3A+Astrophys+Phys+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch.</a> A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-2124 (2006).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+Resonance+Energy+Transfer+in+Homo-Oloigomeric+Complexes+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins.</a> J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).</li>
<li>Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+supramolecular+structure+and+spatial+distribution+of+protein+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells.</a> Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).</li>
<li>Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspectroscopic+method+for+determination+of+size+and+distribution+of+protein+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo.</a> Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).</li>
<li>Kurjan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+response+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pheromone response in yeast.</a> Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).</li>
<li>Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G-protein-coupled+receptors%3A+lessons+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).</li>
</ol>

Dans cette présentation, nous avons illustré comment déterminer la taille et l&#39;information structurelle sur un complexe oligomère des protéines in vivo. Bien que les données présentées ont été obtenues à partir d&#39;un récepteur membranaire spécifique (c.-à Ste2p) exprimée dans les cellules de la levure, la méthode est globale en ce qu&#39;elle peut être appliquée à tout type de protéine exprimée dans tout type de cellule, la seule condition étant que les protéines sont étiquetés avec des marqueur...

<table><tbody><tr><td>Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>Polymère d'éthylène glycol 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>Base d'azote pour levures sans (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; et acides aminés</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Compléments synthétiques pour milieu de levures sans apport (Drop-out)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70210</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d'ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Acros Organics</td><td>424090010</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP385</td><td></td></tr><tr><td>Hisitidine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP382</td><td></td></tr><tr><td>Objectif à immersion huile 100x, Plan Achromat, corrigé à l'infini, NA=1,43</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à deux photons à résolution spectrale</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dans la quantification in vivo des interactions des protéines g récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

L&#39;étude des interactions entre protéines dans les cellules vivantes est un domaine de recherche important parce que les informations accumulées à la fois les applications retombées industrielles ainsi que des augmentations de base de connaissances biologiques fondamentaux. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) entre une molécule bailleurs de fonds dans un état électroniquement excité et une molécule d&#39;accepteur à proximité a été fréquemment utilisée pour des études d&#39;interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. Les protéines d&#39;intérêt sont étiquetés avec deux différents types de sondes fluorescentes et exprimée dans les cellules biologiques. Les sondes fluorescentes sont alors excités, typiquement en utilisant la lumière laser, et les propriétés spectrales de l&#39;émission de fluorescence émanant des sondes fluorescentes sont recueillies et analysées. L&#39;information concernant le degré des interactions protéine est ancrée dans les données d&#39;émission spectrale. Typiquement, la cellule doit être balayé un certain nombre de fois afin d&#39;accumuler suffisamment d&#39;informations spectrales de quantifier avec précision l&#39;étendue des interactions protéine pour chaque région d&#39;intérêt dans la cellule. Cependant, la composition moléculaire de ces régions peuvent changer au cours du processus d&#39;acquisition, de limiter la détermination spatiale des valeurs quantitatives de l&#39;efficacité apparente de FRET à une moyenne sur des cellules entières. Par le biais d&#39;une résolution spectrale de microscope à deux photons, nous sommes en mesure d&#39;obtenir un ensemble complet d&#39;images spectralement résolue après un seul balayage d&#39;excitation complète de l&#39;échantillon d&#39;intérêt. Partir de ces données au niveau des pixels spectrale, une carte de l&#39;efficacité de FRET dans toute la cellule est calculée. En appliquant une simple théorie du FRET dans des complexes oligomériques à la distribution obtenues expérimentalement l&#39;efficacité de FRET à travers la cellule, un seul balayage résolution spectrale révèle l&#39;information stoechiométrique et structurelles sur le complexe oligomère à l&#39;étude. Nous décrivons ici la procédure de préparation des cellules biologiques (la levure Saccharomyces cerevisiae) exprimant des récepteurs membranaires (stérile 2 α-facteur de récepteurs) taggés avec deux différents types de sondes fluorescentes. Par ailleurs, nous illustrons facteurs critiques impliqués dans la collecte de données de fluorescence à l&#39;aide de la résolution spectrale à deux photons système d&#39;imagerie microscopique. L&#39;utilisation de ce protocole peut être étendu pour étudier tout type de protéine qui peut être exprimé dans une cellule vivante avec un marqueur fluorescent qui s&#39;y rattachent.

En employant une résolution spectrale à deux photons système d&#39;imagerie microscopique, au niveau des pixels des cartes de transfert de Förster Resonance Energy (FRET) efficacités sont obtenues pour des cellules exprimant des récepteurs membranaires hypothèse de former des homo-oligomères complexes. Depuis le FRET cartes d&#39;efficacité, nous sommes en mesure d&#39;estimer l&#39;information sur le complexe stoechiométrique oligomère à l&#39;étude.

Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons

L'étude des interactions protéiques dans les cellules vivantes constitue un domaine de recherche important car les informations accumulées profitent tant à l'industrie...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer des informations stœchiométriques et structurales sur une protéine. Tous les complexes ligamentaires exprimant des cellules biologiques vivantes, les cellules de levure sont modifiées génétiquement pour exprimer les protéines d'intérêt liées à une sonde fluorescente donneur ou accepteur. Les sondes donneur peuvent être excitées directement par un laser.Bien que les accepteurs ne puissent être excités que par un transfert d'énergie en provenance d'un donneur proche excité, les cellules sont exposées à une lumière provenant d'un laser pulsé proche infrarouge. La fluorescence émise par les sondes est séparée en ses composantes spectrales par un réseau de transmission et projetée sur la surface d'un réseau CCD à multiplication d'électrons. Ainsi, des spectres fluorescents complets provenant d'individus isolés, tous les ligaments, sont obtenus pour chaque position de l'échantillon.Le profil spectral de la fluorescence détectée dépend de l'interaction spécifique des protéines d'intérêt. Les données sont analysées afin de déterminer, pour chaque pixel d'image d'une cellule scannée, les émissions séparées des sondes donneur et a

in-vivo-quantification-g-protein-coupled-receptor-interactions-using

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit comment l'image interactions protéine-protéine en utilisant un dosage de proximité basée sur le FRET.

Imagerie interactions protéine-protéine In vivo</em

Ici, nous décrivons les méthodes détaillées direct imagerie cellulaire pour enquêter sur le chimiotactisme. Nous présentons la fluorescence des méthodes microscopiques pour surveiller la dynamique spatio-temporelle des événements de signalisation dans les cellules en migration. Mesure des événements de signalisation nous permet de mieux comprendre comment un réseau de signalisation GPCR réalise gradient de détection et de contrôle des chimiotactiques migration directionnelle des cellules...

Récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum</em

Nous avons développé une plate-forme logicielle qui utilise Imaris Neuroscience, ImarisXT et MATLAB pour mesurer les changements dans la morphologie d'une forme indéfinie pris trois dimensions fluorescence confocale de cellules individuelles. Cette nouvelle approche peut être utilisée pour quantifier les changements dans la forme des cellules qui suivent l'activation du récepteur et représente donc un outil possible supplémentaire pour la découverte de médicaments.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour visualiser et suivre des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et ainsi analyser la mobilité latérale des récepteurs, la taille des complexes récepteurs, ainsi que pour visualiser les interactions transitoires récepteur-récepteur. Ce protocole peut être étendu à d’autres protéines membranaires.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Des méthodes simples pour détecter l’activation sélective des protéines G par les récepteurs couplés aux protéines G restent un défi majeur dans la signalisation cellulaire. Ici, des biocapteurs de transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) ont été développés en attachant par paires un RCPG à des peptides de protéine G pour sonder les changements de conformation à des concentrations contrôlées dans des cellules vivantes.

Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l&#39;aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension

La liaison à la guanosine triphosphate (GTP) est l'un des premiers événements dans l'activation du récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Ce protocole décrit comment caractériser pharmacologiquement des interactions spécifiques de GPCR-ligand en surveillant la liaison de l'analogue GTP radio-marqué, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en Réponse à un ligand d'intérêt.

Mesure de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G via liaison GTP radiomarquée

Une procédure est présentée pour visualiser les activités de kinase a de protéine dans les souris head-fixed, se comportant. Un journaliste amélioré d'activité de A-kinase, tAKARMD, est exprimé dans les neurones corticaux et rendu accessible pour la formation image par une fenêtre crânienne. La microscopie d'imagerie à vie à deux photons est utilisée pour visualiser les activités de LPJ in vivo pendant la locomotion forcée.

Visualisation de la protéine Kinase Une activité chez des souris à behaving à l'aide de la microscopie d'imagerie à deux photons in vivo fluorescence à vie

Les changements morphologiques se produisent dans les cellules de fibroblaste sensibles au système immunitaire après l'activation et favorisent des changements dans le recrutement cellulaire. Utilisation de l'imagerie à 2 photons en conjonction avec une protéine génétiquement modifiée spécifique au fibroblaste 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) ligne de souris et vert fluorescent marqué lipopolysaccharide-FITC, nous pouvons illustrer l'apport très spécifique de lipopolysaccharide...

In Vivo Deux-Couleur 2-Photon Imagerie des cellules de reporter génétiquement marqués dans la peau

En raison du faible rapport signal/bruit (SNR) inhérent aux capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance Fӧrster (FRET), la mesure des signaux cAMP a été difficile, en particulier dans trois dimensions spatiales. Nous décrivons ici une méthodologie d’imagerie et d’analyse FRET hyperspectrale qui permet de mesurer la distribution de l’AMPc en trois dimensions spatiales.

Mesure des distributions cAMP à 3 dimensions dans des cellules vivantes à l’aide de l’imagerie et de l’analyse FRET hyperspectrales en 4 dimensions (x, y, z et λ)

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

Découvrez la quantification des interactions protéiques GPCR in vivo par microscopie à deux photons à résolution spectrale. Cette méthode permet d'obtenir des cartes d'efficacité FRET au niveau pixel pour analyser la stœchiométrie des complexes oligomériques dans les cellules vivantes.

Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons (Vidéo) | JoVE Journal

Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons

Explorer plus de vidéos