L'utilisation de carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) pour surveiller la prolifération des lymphocytes
October 12th, 2010
CFSE étiquettes de façon covalente à long terme avec les molécules intracellulaires colorant fluorescent, carboxyfluorescéine. En tant que tel, quand une cellule se divise CFSE-étiquetés, sa descendance ont la moitié de la quantité de fluorescence, qui peut ainsi être utilisée pour évaluer la division cellulaire. Cet article décrit les procédures généralement utilisées pour le marquage des lymphocytes de souris avec CFSE.
L’objectif global de cette expérience est de marquer les lymphocytes avec le colorant fluorescent intracellulaire, CFSE, afin que les lymphocytes puissent être surveillés pour la division cellulaire par cytométrie en flux. Ceci est réalisé en mélangeant des lymphocytes avec CFDA se, qui est la forme diacétyle de CFSE. Les deux groupes acétyle permettent au colorant de pénétrer rapidement dans les cellules des lymphocytes.
Les estérases éliminent les groupes acétyle du C-F-D-A-S-E, formant la forme CFSE du colorant. Sans les groupes acétyle, le CFSE devient fluorescent et est également moins imprégné de membrane, concentrant ainsi le colorant dans les cellules. La chaîne latérale aminoréactive AL de CFSE couple ensuite de manière covalente le colorant à des protéines intracellulaires, rendant ainsi les cellules fluorescentes presque en permanence.
Le CFSE peut être utilisé pour surveiller la division des lymphocytes en fonction de l’intensité séquentielle de la fluorescence des cellules filles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’incorporation de thymidine tritiée, est que les cellules individuelles peuvent être surveillées pour la division cellulaire. La démonstration de la procédure sera faite par Ben Qua, un chercheur de mon laboratoire, afin de marquer les cellules.
Commencez avec des lymphocytes fraîchement isolés de la rate ou des ganglions lymphatiques de souris et ajoutez une concentration comprise entre un demi-et 10 millions de cellules par millilitre de milieu de culture, complétée par 5 % de chaleur. Le sérum de veau fœtal inactivé remet soigneusement en suspension les cellules et transfère soigneusement un millilitre au fond d’un tube conique frais de 10 millilitres. Posez le tube horizontalement avec précaution.
Ajoutez 110 microlitres de PBS dans le haut du tube dans la partie non mouillée du plastique, en veillant à ce qu’il n’entre pas en contact avec la solution de la cellule. Ajouter une solution de colorant frais de 1,1 microlitre du stock de cinq millimolaires de C-F-D-A-S-E aux 110 microlitres de PBS. Fermez rapidement le tube et retournez-le et tourbillonnez bien pour obtenir un mélange uniforme et rapide des solutions puisque le colorant devient fluorescent et donc sujet au blanchiment.
Protégez le tube de la lumière en le recouvrant d’une feuille d’aluminium. Incuber les cellules pendant cinq minutes à température ambiante en les diluant dans 10 volumes de 20 degrés Celsius, PBS contenant 5 % H-I-F-C-S sédimentant par centrifugation à 300 Gs pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius et en jetant le surnageant. Répétez le lavage deux fois de plus.
Les cellules peuvent ensuite être appliquées à un protocole d’intérêt pour l’induction de la division cellulaire. Les cellules marquées peuvent être utilisées dans des essais in vitro et in vivo. À la fin de l’essai de prolifération, les cellules sont récoltées et analysées par cytométrie en flux.
Dans cet exemple, le marquage CFSE est utilisé in vitro pour mesurer comment les lymphocytes T de souris transgéniques génétiquement modifiées réagissent aux cellules dendritiques pulsées avec différentes concentrations d’antigène. Les pics de dilution CFSE non ombragés représentent des cellules T transgéniques CD positives huit fois qui se sont divisées une à trois fois. On peut voir qu’un plus grand nombre de lymphocytes T se divisent aux concentrations plus élevées de l’antigène.
La méthode de marquage CFSE se prête également à des essais in vivo tels que les expériences de transfert adoptif. Ici, la télécopie est utilisée pour identifier la population de lymphocytes T qui présentent un intérêt chez les souris receveuses. Un profil de prolifération CFSE ultérieur représente des cellules T CD huit positives qui se sont divisées une à six fois en fonction des pics de dilution CFSE après son développement.
Cette procédure a ouvert la voie aux chercheurs et à l’immunologie pour explorer la prolifération des lymphocytes au cours d’une réponse immunitaire.
Aperçu
Cet article décrit la procédure pour marquer les lymphocytes de souris avec le colorant fluorescent CFSE, permettant le suivi de la division cellulaire par cytométrie en flux. La méthode permet aux chercheurs de suivre la prolifération des lymphocytes pendant les réponses immunitaires.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Cytométrie en flux
Contexte
- Le CFSE est un colorant fluorescent utilisé pour marquer les protéines intracellulaires.
- Il permet l'évaluation de la division cellulaire en mesurant la dilution de la fluorescence dans les cellules filles.
- Cette technique offre des avantages par rapport aux méthodes traditionnelles comme l'incorporation de thymidine tritiée.
- Le marquage CFSE peut être appliqué dans des essais in vitro et in vivo.
Objectif de l'étude
- Démontrer la technique de marquage CFSE pour surveiller la division des lymphocytes.
- Fournir un protocole détaillé pour les chercheurs à suivre.
- Mettre en évidence l'application du CFSE dans l'étude des réponses des cellules T aux antigènes.
Méthodes utilisées
- Isolation des lymphocytes à partir de la rate de souris ou des ganglions lymphatiques.
- Mélange des lymphocytes avec CFDA SE pour faciliter l'entrée du colorant.
- Incubation et lavage des cellules pour éliminer l'excès de colorant.
- Analyse par cytométrie en flux pour évaluer la division cellulaire basée sur la dilution du CFSE.
Résultats principaux
- Le marquage CFSE permet de suivre la division des cellules T en réponse à des concentrations variables d'antigènes.
- La cytométrie en flux révèle des pics distincts correspondant à différents niveaux de division des cellules T.
- La méthode est efficace pour les applications in vitro et in vivo.
- Les résultats démontrent l'utilité du CFSE dans la recherche immunologique.
Conclusions
- Le marquage CFSE est une méthode fiable pour étudier la prolifération des lymphocytes.
- Cette technique améliore la compréhension des réponses immunitaires.
- Les chercheurs peuvent utiliser cette méthode pour divers designs expérimentaux.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
CFSE labeling enables precise tracking of lymphocyte proliferation, supporting target validation in immunology-focused drug discovery. By quantifying division at single-cell resolution, it de-risks mechanistic hypotheses and informs go/no-go decisions in early discovery. The method’s compatibility with multi-color flow cytometry enhances assay scalability and cross-functional data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring antigen-driven T cell division in response to varying stimulus concentrations.
- Operational Value: Provides quantitative, single-cell readouts that clarify pathway activation and functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing biologically active compounds from inert controls based on proliferation profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, low-variance fluorescent labeling compatible with high-throughput flow cytometry workflows.
- Reproducibility: Enables consistent detection of up to eight division cycles, supporting assay qualification across sites and operators.
- Multiplexing Capacity: Integrates with other fluorochromes for simultaneous phenotyping and functional readouts in complex immune assays.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-specific T cell responses applicable to vaccine, autoimmune, and oncology indications.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo validation via adoptive transfer models, preserving proliferation tracking fidelity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by correlating proliferation depth with mechanistic potency and target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
CFSE labeling functions as a discovery-phase tool that connects hypothesis testing in early immunology to lead optimization through quantifiable proliferation metrics.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses by linking antigen exposure to lymphocyte division kinetics, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence dilution data enabling reliable comparison of test conditions across compound libraries.
- Analytics: Generates resolvable flow cytometry peaks corresponding to division cycles, supporting statistical comparison of proliferation indices.
- Translational Research: Enables continuity from reductionist in vitro assays to physiologically relevant in vivo models without re-labeling or assay redesign.
- Enterprise Reuse: Serves as a modular, plug-and-play labeling platform applicable across multiple immune cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving individual cell division histories obscured in bulk assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization through covalent, stable labeling with minimal technical variance and no requirement for radioactive handling.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by confirming target-mediated biological activity early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Enables objective, data-driven prioritization of immunomodulatory candidates based on proliferation efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell handling, flow cytometry compensation, and fluorescence interpretation to avoid artifacts from dye quenching or aggregation.
- Dependent on access to calibrated flow cytometers with appropriate laser and filter sets for FITC-channel detection.
- Necessitates standardized washing protocols to remove extracellular dye and ensure signal specificity to intracellularly retained CFSE.
- Must account for potential dye toxicity at high concentrations or prolonged incubation, though source notes low toxicity under standard conditions.
- Requires light protection during staining and handling to prevent photobleaching and maintain signal integrity.
