Préparation des cultures de neurones d'embryons de drosophile Midgastrula scène

Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones d'embryons de drosophile midgastrula scène. Vues des cultures vivantes montrent les cellules 1 heure après le placage et les neurones différenciés après 2 jours de croissance dans un milieu à base de bicarbonate défini. Les neurones sont électriquement excitables et forment des connexions synaptiques.

Je m’appelle Diana Dowd et je suis professeure au département de biologie du développement et cellulaire et d’anatomie et de neurobiologie à l’UC Irvine. Et aujourd’hui, je vais démontrer la préparation de cultures neuronales primaires à partir d’embryons de drosophile. Et ce que cela implique, c’est en fait de retirer toutes les cellules d’un embryon de drosophile à un stade gastro-intestinal moyen, et de les placer dans une culture cellulaire.

Et ce pour quoi nous utilisons ces cultures, c’est vraiment comprendre quels sont les gènes et les facteurs environnementaux qui sont importants pour la régulation de l’excitabilité électrique et de la transmission synaptique entre les neurones de la drosophile. Pour commencer cette procédure, nous devons collecter des embryons de drosophile. Pour ce faire, nous prenons des assiettes de collecte d’œufs, étalons un peu de pâte de levure dessus.

C’est un substrat favorable pour que les mouches adultes pondent leurs œufs. Nous mettons ces assiettes sur des bouteilles contenant une population de mouches adultes, généralement une centaine à 200 mouches. Et puis nous laissons les mouches, les mouches adultes pondre leurs œufs pendant environ deux à trois heures.

Ensuite, nous retirons les plaques de collecte d’ovules, et ce sont les embryons que nous utilisons pour la procédure de culture. L’étape suivante de la procédure consiste à décenculer les embryons, ce qui signifie que nous enlevons effectivement le corion. Pour ce faire, nous lavons les embryons dans un entonnoir de Buechner sur lequel nous avons un morceau de papier filtre pour qu’il attrape les embryons.

Nous les laissons reposer dans l’entonnoir Buchner dans une solution d’eau de Javel à 50 %. Cette solution d’eau de Javel à 50 % dissout non seulement le corion, mais elle sert également à le faire dans le cadre de notre procédure de stérilisation. En fait, nous ne faisons pas cette procédure dans la capuche, c’est à l’extérieur de la capuche, donc les embryons sont, une fois déchlorés, nous les lavons dans une boîte de Pétri.

En fait, lorsque le Corian a disparu, la membrane ovile est assez collante et elle collera bien à une boîte de Pétri. Vous pouvez ensuite verser de l’eau distillée sur eux et retirer l’eau distillée deux ou trois fois et en fait simplement jeter l’eau et les embryons colleront à la boîte de Pétri. N’utilisez pas de plat en plastique de culture tissulaire.

Ils ne s’en tiennent pas à cela. Nous commençons la partie stérile de la procédure en prenant les boîtes de Pétri des embryons et en les amenant dans une hotte à flux laminaire. Il s’agit de bulletins de recouvrement Bellco.

Ils ne sont pas enduits, mais ils ont été autoclaves et ils n’ont pas été lavés. Nous constatons qu’ils ne fonctionnent pas très bien. Lorsqu’ils sont lavés, nous sortons généralement quatre bordereaux de protection et les mettons dans une seule boîte de Pétri.

Nous allons donc faire quatre cultures d’embryons dans chaque boîte de Pétri. D’accord, donc cette boîte de Pétri est essentiellement prête pour que nous commencions à cultiver, et je fais généralement 12 cultures, 12 à 16 cultures à la fois. D’accord? Le milieu de culture que nous utilisons est un milieu défini relativement simple.

C’est une base A-D-M-E-M, et nous préparons ce milieu liquide une fois toutes les deux semaines pour qu’il reste bon pendant deux semaines au réfrigérateur. Celui-ci a été stérilisé. Il a été passé à travers un filtre stérile de 0,2 micron, puis nous avons ajouté cinq suppléments au média.

Ils sont préparés une fois tous les deux mois, puis congelés dans des aliquotes qui sont ajoutées à 10 mils de milieu liquide. Nous supprimons donc simplement le contenu. La dernière, puis c’est juste, nous inversons doucement ce média pour le mélanger et nous sommes prêts à partir. D’accord.

Tout est mis en place. J’ai ma boîte de culture qui est prête, celle-là ou ma boîte de Pétri qui contient quatre lamelles prêtes à l’emploi. Et maintenant, je vais prendre mon plat avec des embryons et je vais, ils sont maintenant assis dans l’eau distillée.

Je vais retirer l’eau distillée simplement en la secouant. C’est comme ça que je le fais directement à la poubelle. Et maintenant, je vais verser environ deux moulins de milieu sur ces embryons, et maintenant ils sont prêts pour que j’insère l’aiguille de verre dans des embryons individuels et que j’en retire le contenu.

Il faut avoir les médias à l’extérieur. De toute évidence, s’il y avait de l’eau là-bas, vous auriez un choc osmotique. Maintenant, pour me préparer à préparer les cultures juste avant de retirer le contenu de l’embryon, je mets la goutte de cinq microlitres sur les lamelles.

Si vous le laissez trop longtemps, le pH du média change. D’accord, maintenant je vais mettre une goutte de cinq microlitres au centre de chacun des quatre couvercles. Il est en fait important que ces gouttes disent de rester aussi intactes que possible.

Si le média se répand sur toute la lamelle, puis les cellules sont plaquées dans certaines, une très fine couche de liquide est difficile. Vous voulez qu’ils plaquent les cellules en une belle goutte ronde de liquide. Comme vous pouvez le voir là-bas, nous avons quatre belles gouttes rondes de liquide prêtes à l’emploi.

Et maintenant, je vais prendre l’une des pipettes que j’ai tirées et je l’attache ensuite simplement à ce tube de pipette buccale. Vous pouvez utiliser n’importe quel tube que vous voulez, mais ce qui est bien avec ce tube, c’est qu’il est en fait livré avec des pipettes de 100 microlitres calibrées en tube VWR. Et dans ceux-ci, nous avons, il y a un petit joint en caoutchouc ici.

Je peux insérer le pipeteur à bouche, je veux dire la pipette en verre dans cette extrémité du pipeteur. Et puis, quand j’aspire le contenu de l’embryon, je ne vais pas monter plus loin que cela, la région où il commence à se rétrécir. Il y a donc cette énorme zone qui me sépare en utilisant l’aspiration de souris ici et l’endroit où se trouvent les cellules.

Il n’y a donc pas, il n’y a pas de problème de contamination. Si vous aspirez accidentellement le contenu dans cette zone, vous allez avoir d’énormes problèmes de contamination. Dans nos hottes à flux laminaire, nous avons des microscopes de dissection qui sont sur une base scopique.

Cela permet à la lumière d’entrer par le dessous de l’embryon, et cela nous permet de voir le sillon céphalique, l’intestin moyen et les imaginations que vous verrez lorsque nous regarderons les embryons réels. Et c’est ainsi que nous choisissons le stade de l’embryon qui est important pour la culture afin d’éliminer le contenu de l’embryon. Nous utilisons des pipettes en verre, tirons sur un extracteur de micro-électrodes ordinaire que nous utilisons pour fabriquer nos pipettes d’enregistrement de patchs.

Nous ne nous soucions pas vraiment des paramètres. Nous tirons des pipettes assez fines parce que nous allons casser la pipette dans la boîte à côté de l’embryon à la taille que nous voulons vraiment. Nous prenons ensuite ces pipettes en verre, les insérons à travers la membrane intestinale de l’embryon et à l’aide d’un tube d’aspiration buccale fixé à l’arrière de l’arrière de la pipette.

Nous extrayons ensuite le contenu de l’embryon entier. Ensuite, nous le déplaçons, prenons, sortons la pipette et le déplaçons dans un autre plat qui a une lamelle avec une goutte de cinq microlitres de support. Et nous expulsons le contenu de l’embryon dans cette goutte de cinq microlitres.

Nous avons pipeté de haut en bas plusieurs fois pour disperser les cellules, puis nous avons laissé ce couvercle reposer dans le plat pendant environ 10 minutes avant d’inonder le plat avec deux moulins de média. Les boîtes des cellules, après avoir été plaquées, sont placées dans un incubateur à 5 % de CO2. C’est très important car le média que nous utilisons est un média tamponné au bicarbonate.

Nous avons quelques HEP là-dedans, mais ce n’est pas suffisant pour amortir dans l’environnement aérien. Il faut donc utiliser un incubateur à 5 % de CO2. Cependant, il doit être à une température relativement basse autour de 22 à 23 degrés est idéal.

Nous prenons donc un incubateur de CO2 standard qui serait utilisé à partir de cultures de mammifères et nous le chauffons à 37 degrés. Ce que nous faisons, c’est que nous éteignons le chauffage, nous le gardons dans notre laboratoire et nous pouvons mettre de la glace au fond de l’incubateur, ce qui maintient la température autour de 21 à 25 degrés. L’autre technique que nous utilisons, c’est de prendre, encore une fois, l’un de ces incubateurs à CO2 chauffants standard et de mettre l’incubateur dans une chambre froide.

Ensuite, vous pouvez chauffer assez efficacement l’incubateur à 23 degrés si la température ambiante est froide à température ambiante. Et donc ce sont les deux méthodes que nous utilisons pour avoir un phoque standard, le phoque de mammifère à l’incubateur pour nous permettre de survivre. D’accord, c’est une Culture qui a été plaquée il y a une heure à la même grosseur que nous avons vue juste après le placage une heure après le placage.

Ici, nous voyons des neurones qui se sont différenciés pendant environ deux jours. En culture, les neuroblastes se sont divisés une ou plusieurs fois, puis ont donné naissance à des neurones, qui étendent les processus qui forment de vastes réseaux névrotiques chevauchants. Ici, nous avons deux corps cellulaires qui s’affrontent.

Celle du haut prolonge un processus à 11 heures, et celle du bas prolonge un processus à cinq heures. Ce sont là leurs principales extensions. Et puis vous pouvez voir qu’ils forment des branches plus fines.

Ceux-ci adhèrent très étroitement au substrat de verre, et il y a des processus que vous pouvez voir qui proviennent également d’autres cellules qui les chevauchent. Et ce sont des sites de connexion synaptique potentielle. Nous patcherions l’une de ces cellules, et en général, avec ce niveau d’élaboration de processus, elles auraient des courants synaptiques synaptiques fonctionnels.

Maintenant, nos cellules se développent en culture 12 heures après le placage. Ils auront prolongé des processus assez agréables. Notre physiologie standard, nous commençons à en faire environ un à deux après la culture.

Et vous pouvez voir qu’ils continuent en fait à développer les processus pendant les quatre ou cinq prochains jours. Et nous avons enregistré des cellules jusqu’à deux semaines en culture, mais la plupart de nos enregistrements sont entre deux et six jours en culture avec ces cultures que nous venons de préparer à partir d’embryons de drosophile au stade gastro moyen, nous avons des réseaux de neurones qui communiquent en culture. Nous sommes en mesure d’examiner les propriétés de décharge de ces cellules.

Ils ont des propriétés de cuisson diverses. Ils ont, ils se déclenchent de manière répétitive, certaines cellules se déclenchent de manière répétitive, d’autres cellules se déclenchent à la naissance, et ces cellules sont principalement cholinergiques ou GABAergiques. Et nous regardons, nous pouvons regarder les courants synaptiques qui sont médiés par ceux-ci, par les récepteurs nicotiniques, Aach, H et GABA.