Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer l’activation du canal BK sous tension contrôlée, tout en contrôlant la solution intracellulaire. Ceci est accompli en exprimant d’abord les canaux BK dans les cytes de xénope en leur injectant de l’ARNm du canal BK. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer le système de perfusion.

La troisième étape de la procédure consiste à former un giga joint entre la membrane de l’ovocyte et la pipette patch. La dernière étape de la procédure consiste à exciser le patch membranaire. En fin de compte, les résultats obtenus en utilisant la technologie du patch clamp couplée à un système de profusion montrent que les canaux BK sont activés par les changements de tension et de concentration en calcium.

Bonjour, je suis Jin Cho Young du laboratoire du Dr Jamie Zus à l’Université de Washington. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, y compris des questions concernant le mécanisme moléculaire de l’activation des canaux ioniques. Alors commençons.

La première étape de la procédure commence quelques jours avant le clampage du patch et utilise l’ARNm du canal BK qui a été transcrit in vitro. Après avoir récolté les cytes de Xenopus Lavu au stade cinq à six, injectez 0,05 à 50 nanogrammes d’ARNm du canal BK dans un cyte. Utilisation d’un injecteur nano deux auto nanoliter.

Répétez l’injection sur une dizaine d’ovocytes pour chaque ARNm suite à l’injection. Rincez les ovocytes deux fois avec la solution de ND 96. Ensuite, placez les ovocytes dans une plaque de culture et incubez-les à 18 degrés Celsius pendant deux jours ou plus pour laisser le temps aux ovocytes d’exprimer le canal BK.

Après deux à cinq jours d’incubation, les ovocytes devraient exprimer des canaux BK et sont donc déjà pour le clampage par patch. Avant de manipuler les ovocytes, installez tout ce dont vous aurez besoin pour le clampage par patch, en commençant par le système de perfusion. Le système illustré ici est le lien de vanne automatisé.

16 Système de profusion L’azote sous pression pousse les solutions de profusion hors des réservoirs de solution à travers les tubes de profusion et dans le crayon et l’embout de profusion. Le débit de chaque jet de solution de profusion est contrôlé par une vanne de réservoir et une vanne électronique. Dans ce protocole, l’un des réservoirs n’est pas pressurisé et fonctionne comme un collecteur de déchets, ainsi qu’un mécanisme de libération de la pression.

Des solutions de perfusion de différentes concentrations de calcium ou de magnésium peuvent être préparées avant les expériences. Ajoutez les solutions de perfusion dans les réservoirs et étiquetez chacun d’eux pour indiquer la concentration de calcium ou de magnésium. Pour configurer d’abord le système de profusion, connectez les tubes au crayon de profusion.

Allumez ensuite le contrôleur électronique des vannes et ouvrez les vannes électroniques pour vous assurer que les tubes et le crayon de profusion sont exempts de bouchons et de bulles d’air. Poussez de l’eau déminéralisée à travers chaque tube à l’aide d’une seringue remplie d’eau déminéralisée. À ce stade, connectez les tubes aux réservoirs de solution et ouvrez la vanne de la bouteille de gaz pour appliquer de l’azote sous pression.

Ouvrez une vanne de réservoir pour remplir le tube avec l’une des solutions de réservoir. Si nécessaire, cliquez sur le robinet du réservoir pour éliminer les bulles dans la solution. Fermez la valve du réservoir une fois que le tube est rempli de solution, remplissez l’embout de perfusion avec de l’eau et vissez-le sur le crayon de perfusion.

Veillez à ne pas piéger de bulles. Lors de la connexion de l’embout, fixez le crayon de perfusion à l’étage du bain à l’aide de pâte à modeler, assurez-vous que l’embout de profusion est dans l’espace du bain. Le système de profusion est maintenant mis en place.

À ce stade, ajoutez de l’eau déminéralisée dans le bain. Assurez-vous que l’embout de profusion est immergé dans l’eau. Testez que chaque solution de perfusion sort correctement de l’embout de perfusion.

Fermez la vanne électronique reliée à la tubulure du collecteur de déchets et ouvrez la vanne pour l’une des solutions de profusion. Au microscope, observez le jet de liquide de profusion qui sort de l’embout de perfusion. Fermez la vanne pour cette solution de profusion et ouvrez la vanne pour le collecteur de déchets.

Le jet de profusion devrait presque disparaître. Répétez le même test pour chacune des solutions de perfusion. Lorsque vous avez vérifié que toutes les solutions de perfusion s’écoulent correctement, remplacez l’eau désionisée dans le bain par la solution de bain souhaitée.

Il est maintenant temps de configurer l’appareil d’enregistrement. Vous devez recouvrir l’électrode d’enregistrement en argent de chlorure d’argent avant chaque séance de serrage de patch. Tout d’abord, retirez le fil de l’électrode du porte-pipette et plongez la moitié de l’extrémité du fil de l’électrode dans un flacon contenant de l’eau de Javel fraîche pendant au moins 15 minutes.

Cela dépose une couche de chlorure d’argent sur le fil. Rincez le fil de l’électrode avec de l’eau déminéralisée et séchez-le par éponge. Ensuite, réinstallez l’électrode de chlorure d’argent et d’argent dans le porte-pipette.

Allumez maintenant votre ordinateur. Branchez la clé matérielle dans le port d’imprimante de votre ordinateur. La clé matérielle doit être branchée pour que vous puissiez utiliser le logiciel d’acquisition de données, qui est HEA pulse.

Allumez l’amplificateur et démarrez le logiciel d’acquisition de données. Pouls HEA. Chargez le fichier de protocole et ajustez les paramètres de configuration tels que l’échelle de stimulus.

L’objectif de l’ajustement des paramètres de configuration est de s’assurer que le potentiel de test est exactement égal au potentiel de commande. Nous sommes maintenant prêts à préparer les ovocytes. Récupérez les ovocytes de l’incubateur.

Immergez l’ovocyte dans une solution de stripping pendant cinq à 10 minutes. La solution de décapage détache la membrane vielle de la membrane plasmique, ce qui permet de décaper la membrane vitel. Après cinq à 10 minutes, retirez doucement la membrane vitel de l’ovocyte.

À l’aide de deux pinces. Un site diví OC est extrêmement fragile et doit donc être déplacé le moins nécessaire. En prenant soin d’éviter d’exposer l’ovocyte Devi à l’air ou aux bulles, utilisez une pipette en verre remplie de suffisamment de solution pour transférer l’ovocyte dans le bain.

Les canaux de la membrane ovocytaire sont maintenant exposés et prêts pour la pipette patch. Tirez une pipette patch en insérant un tube capillaire en verre dans l’extracteur de micro-pipette. Observez les pipettes au microscope pour déterminer la forme de la pointe et le diamètre de l’ouverture.

Le diamètre d’ouverture doit être de deux à quatre micromètres pour réduire le courant capacitif pendant l’enregistrement, et pour assurer une pointe lisse, enduire la pointe de cire puis tirer. Polissez-le au microscope. Remplissez l’embout de la pipette en plaçant l’embout de la pipette à l’intérieur de la solution de pipette et en tirant le piston.

Cela mouille la pointe de la pipette. Ensuite, remplissez la pipette au tiers avec la solution de pipette à l’aide d’une seringue. Placez ensuite la pipette dans le porte-pipette avec l’électrode d’argent, de chlorure d’argent à l’intérieur.

Assurez-vous que le fil-électrode est en contact avec la solution de pipette. L’étape suivante consiste à exciser un patch à l’envers de l’ovocyte préparé. Tout d’abord, trouvez le bord clair de l’ovocyte au microscope.

À l’aide du manipulateur, rapprochez la pipette patch de l’ovocyte, en vous assurant qu’elle est immergée. Dans la solution du bain, notez la résistance en série de la pipette. La résistance idéale de la pipette patch est comprise entre 1 et 1,5 milliohms lorsqu’elle est remplie de solution de pipette et immergée dans une solution de bain.

Poussez maintenant lentement la pipette contre l’ovocyte jusqu’à ce que sa résistance double environ. Obtenez une étanchéité giga ohm en appliquant une légère aspiration par la bouche à travers un tube d’aspiration relié au porte-pipette. Après avoir vérifié qu’un giga joint s’est formé, stabilisez le patch en le maintenant à moins 30 millivolts pendant quelques minutes.

Pour obtenir un patch à l’envers, excisez le patch en poussant rapidement la pipette plus loin dans le site OO, puis en la tirant doucement vers l’extérieur. Le patch à l’envers est maintenant prêt pour le serrage du patch. Déplacez la pipette qui maintient le patch à l’envers à environ 100 microns de l’ouverture de l’embout de perfusion.

Fermez la vanne électronique pour la collecte des déchets et ouvrez la vanne du réservoir pour la solution de profusion souhaitée. Commencez à enregistrer les courants à travers le patch. Modifiez les solutions de tension et de profusion comme vous le souhaitez.

Lorsque vous avez terminé l’enregistrement, nettoyez les tubes de profusion au crayon et à la pointe en poussant dans de l’eau déminéralisée pour éviter les obstructions. Les enregistrements de patch clamp obtenus ici montrent que les canaux BK de type sauvage sur un patch de membrane ovocytaire répondent à la fois à la tension et au calcium. Cette figure montre un enregistrement épicutané avec zéro calcium nominal dans la solution de perfusion.

Les ondes carrées au-dessus des traces de courant indiquent la tension appliquée au patch. Quatre tensions ont été appliquées, allant de 50 millivolts à 200 millivolts par incréments de 50 millivolts. Le courant maximum, environ deux nanoampères, a été obtenu avec la tension maximale de 200 millivolts.

Cette augmentation de l’amplitude du courant avec l’augmentation de la tension indiquait que la probabilité ouverte des canaux BK augmentait avec la tension. Cette figure montre la réponse du patch à l’envers à différentes tensions. Lorsqu’il y avait une micromolaire de calcium dans la solution de perfusion, des échelons de tension ont été appliqués.

Comme dans la figure ci-dessous, la réponse à l’incrément de tension de 200 millivolts, la réponse supérieure a augmenté à environ trois nanoampères lorsqu’il y avait du calcium dans le huit de Perfu, par rapport à deux nanoampères sans calcium. Cela indique que la probabilité ouverte des canaux BK augmentait en présence de calcium. En résumé, cette procédure de patch clampage a montré que les canaux BK étaient dépendants de la tension et du calcium.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer l’activation du canal de fer à l’aide de la technique de pince de patch couplée à un système de ravitaillement professionnel. Maintenant. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.