Synapses Quantifier: un dosage à base d'immunocytochimie Quantifier Nombre Synapse

L’un des objectifs les plus importants des neurosciences est de comprendre les indices moléculaires qui instruisent les premiers stades de la formation des synapses. En tant que tel, il est devenu impératif de développer des approches objectives pour quantifier les changements dans la connectivité synaptique. Pour quantifier le nombre de synapses dans une variété de préparations expérimentales, des neurones cultivés ou des préparations de tissu cérébral cryosectionnées sont colorés avec des marqueurs pré et post-synaptiques sélectifs pour marquer les points de contact synaptique entre les neurones.

Les cellules ou les tissus sont ensuite imagés au microscope fluorescent et des images de huit bits sont requises pour chacun des canaux correspondant aux deux marqueurs immunohistochimiques. Les images sont analysées à l’aide de l’image J 1.29 avec un analyseur de ponctuation. Pour déterminer l’étendue de la colocalisation entre les marqueurs pré et post-synaptiques, les points de colocalisation peuvent ensuite être utilisés pour déterminer le nombre de synapses présentes dans la préparation.

Le principal avantage de la technique décrite ici par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie électronique est que le dosage des synapses permet une analyse et une quantification du nombre de synapses à un débit beaucoup plus élevé. Les principales implications de cette technique s’étendent au diagnostic et au traitement de troubles cliniques tels que la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie ou l’autisme dans lesquels des anomalies et la connectivité synaptique ont été impliquées comme base de la pathologie sous-jacente. Cette technique peut être utilisée pour identifier des formes d’intervention qui peuvent réduire ou améliorer les déficiences que nous observons dans la capacité des neurones affectés à former des synapses les uns avec les autres.

Bien que cette méthode soit utile pour étudier le développement du cerveau, elle peut également être appliquée à d’autres organismes modèles ou systèmes d’organes dans lesquels vous souhaitez étudier ou quantifier le nombre de contacts de cellule à cellule pour lesquels vous avez la possibilité d’étiqueter sélectivement chaque face opposée de chaque site de contact. Préparez des cultures neuronales en plaquant des cellules ganglionnaires rétiniennes de rat purifiées à partir de la rétine de rat, récoltées sur cinq à sept animaux sur des lamelles de verre recouvertes de poly de lycine. Dans une plaque à 24 puits, les cellules sont laissées croître à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq jours avant la transfection.

Après la transfection, incubez les cellules pendant sept à huit jours supplémentaires pour permettre aux synapses de se développer lorsque les cellules en plaques ont suffisamment mûri. Retirez le milieu de culture des puits et ajoutez 500 microlitres de préchauffage à 4 % de paraformaldéhyde dans chaque puits fixé pendant sept minutes. À température ambiante après la fixation, rincer les cellules trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Il est important de s’assurer que les cellules ne sèchent jamais dans les puits. Une fois qu’une zone tampon est retirée d’un puits, elle doit être rapidement remplacée par la zone tampon suivante. Préparez un tampon de blocage contenant 50 % de sérum de chèvre normal et 0,2 % de Triton X 100.

Après avoir retiré le PBS de chacun, ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage dans chaque puits et bloquez pendant 30 minutes. À température ambiante, retirez le tampon de blocage et rincez trois fois. Avec le PBS, préparez une dilution primaire de l’anticorps dans un tampon d’anticorps à 90 %, une solution NGS à 10 % contenant la paire d’anticorps pré et post-synaptique de votre choix.

Ici un lapin antis synapsine, un marqueur pré-synaptique et un souris anti homer. Un marqueur post-synaptique est utilisé Centrifuge, la dilution de l’anticorps primaire pendant cinq minutes à vitesse maximale dans une centrifugeuse de paillasse pour éliminer tout anticorps précipité, puis ajouter 200 microlitres de solution d’anticorps primaire à chacun. Bien placer la plaque dans un récipient humidifié pour éviter le dessèchement de la solution primaire.

Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius après l’incubation avec l’anticorps primaire. Rincez bien chaque fois trois fois. Avec le PBS, ajoutez 200 microlitres d’anticorps secondaires appropriés, dilués de un à 1000 dans un tampon d’anticorps contenant 10 % de NGS préparé.

Comme précédemment, placez le plat dans la chambre humidifiée et incubez pendant deux heures à température ambiante dans l’obscurité après l’incubation avec des secondaires. Rincez bien chaque fois trois à quatre fois avec du PBS. Placez une goutte de support de montage de bouclier vectoriel avec DPI sur une diapositive de verre.

Ensuite, retournez le verre de couverture avec les cellules sur la goutte à monter. Enfin, appliquez du vernis à ongles transparent sur les bords de la lamelle. Veillez à ne pas pousser ou déplacer les lamelles pendant l’application.

Étant donné que cela partagera les cellules, laissez les lames sécher pendant au moins 30 minutes dans un endroit sec et sombre. Ici, l’imagerie est réalisée à l’aide d’un microscope à fluorescence zes axio imager équipé de jeux de filtres appropriés et d’un objectif à immersion dans l’huile 63 fois. Placez une lame contenant des cellules non transfectées sur la platine du microscope.

À l’aide du filtre DPI défini pour visualiser les noyaux cellulaires, sélectionnez les cellules qui se trouvent à au moins deux diamètres de cellule de leurs voisines les plus proches. L’utilisation de DPI pour cette étape aidera à éviter les biais et à garantir le caractère aléatoire de la sélection des cellules. Pour chaque cellule sélectionnée, obtenez des images de huit bits en utilisant les jeux de filtres appropriés dans ce cas, GFP et Texas Red.

L’image pseudo-colorée superposée doit montrer les marqueurs pré et post-synaptiques en rouge et vert respectivement. Ensuite, placez une lame contenant des cellules transfectées sur la platine du microscope. Ici, les cellules ont été transfectées avec un vecteur d’expression de tomate TD.

Utilisez ce marqueur pour sélectionner les cellules comme auparavant. Pour chaque cellule sélectionnée, obtenez huit images de fosse à l’aide des jeux de filtres appropriés dans ce cas, GFP, Texas Red et Sci cinq. L’image pseudo-colorée superposée doit avoir les marqueurs post-synaptiques en rouge, vert et bleu.

Ici, le programme d’analyse de ponction est utilisé pour la quantification de la ponction synaptique colocalisée. Le plugin d’analyse Puncta a été écrit par Barry Walk et est disponible sur demande dans l’image J 1.26. Ouvrez l’une des images collectées.

Utilisez l’outil de sélection circulaire pour sélectionner une région d’environ un diamètre de cellule radialement autour du SOR d’intérêt. Une fois la région d’intérêt sélectionnée, allez dans le menu des plugins et sélectionnez l’analyseur de crevaison dans la fenêtre des options d’analyse qui apparaît Sélectionnez le canal rouge Canal vert. Le premier soustrait l’arrière-plan et définit le fichier de résultats.

Cliquez sur OK. Définissez ensuite un emplacement dans lequel enregistrer les résultats. Ces résultats peuvent être exportés vers Excel pour une analyse plus approfondie dans la fenêtre qui s’affiche.

Ensuite, assurez-vous qu’un rayon de balle roulante de 50 est sélectionné et décochez l’option de fond blanc. Cette modification n’est pas nécessaire mais est souvent préférée par les utilisateurs de l’application. Pour faciliter la visualisation, cliquez sur OK.

Une nouvelle fenêtre apparaîtra à côté d’un masque correspondant à l’image du canal rouge. Ajustez le seuil jusqu’à ce que le masque rouge corresponde le mieux possible avec autant de crevaisons individuelles discrètes. Sans introduire trop de bruit, cliquez sur OK.

Réglez la taille minimale du point sur quatre pixels. Ne modifiez rien d’autre. Cliquez sur OK.

Répétez l’étape précédente, cette fois pour le canal vert. Après avoir répété cela avec le canal vert, le plugin fournira une quantification correspondant à des puncta dans chaque canal séparément et à un puncta co-localisé entre les deux canaux. Le test de synapse montré ici peut être appliqué à des coupes cryogéniques du cerveau et à tout autre tissu du système nerveux tel que la moelle épinière ou la rétine.

À condition qu’il existe une paire de marqueurs pré et post-synaptiques appropriée. Commencez par prélever du tissu cérébral sur une souris qui a été euthanasiée par exsanguination et profusion avec le PBS. Placez tout le cerveau dans du paraldéhyde à 4 % dans du PBS à quatre degrés Celsius pendant la nuit du lendemain.

Rincez le cerveau trois fois avec du PBS. Cryo protège le cerveau en le plaçant dans 30 % de saccharose. Dans PBS.

Le tissu flottera d’abord à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il coule au fond. À ce stade, la cryoprotection est complète. Ensuite, dans une solution deux à un de 20 % de saccharose à OCT et PBS intégrer la brainine à l’orientation souhaitée pour la section.

Par exemple, sagittal ou coronal. Ensuite, placez une surface métallique plane sur un seau de glace sèche. Placez le cerveau incrusté dessus pour le congeler une fois congelé, transférez le cerveau dans un sac de congélation et placez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à un an avant de les sectionner.

À l’aide d’un cryostat, coupez le tissu en sections de 12 à 16 microns et montez-le sur des lames de verre. Ensuite, séchez les lames en les plaçant dans un four à 37 degrés Celsius. Ensuite, rincez-les trois fois avec du PBS pour éliminer les résidus d’OCT.

Un stylo à paraffine est utilisé pour créer une barrière hydrophobe autour de la lame et un tampon de blocage est ajouté à la lame pour empêcher l’écoulement de la lame par la bordure en paraffine. Placez les lames dans du sérum de chèvre normal à 20 % dans du PBS pendant une heure à température ambiante pour bloquer l’endroit suivant. Les sections d’anticorps primaires diluées dans du PBS avec 0,3 % de triton et 10 % de sérum de chèvre normal.

Ici, l’antit de lapin, PSD 95 est utilisé pour marquer les compartiments glutamatergiques post-synaptiques et le cobaye anti v glu deux est utilisé pour marquer les terminaisons pré-synaptiques glutamatergiques. Placez les lames à quatre degrés Celsius et incubez pendant 36 à 60 heures après l’incubation. Lavez l’anticorps primaire en immergeant les lames trois fois dans du PBS pendant 15 minutes chacune.

Après cette étape, assurez-vous de protéger les lames de la lumière directe. Appliquez des anticorps secondaires dilués de un à 200 dans du PBS avec 0,3 % de triton et 10 % de sérum de chèvre normal. Ici, chèvre anti cochon d’Inde.

Alexa 4 8 8 et chèvre anti lapin. Alexa 5, 9, 4 sont utilisés. Incuber pendant deux heures à température ambiante dans l’obscurité.

Lavez les lames en les immergeant quatre fois dans du PBS pendant 15 minutes chacune pour les monter. Ajoutez de petites gouttes de support de montage de bouclier vectoriel avec du dappy et couvrez les diapositives avec des lamelles de protection. Appliquez du vernis à ongles pour inhiber les mouvements des lamelles.

L’imagerie de la coupe tissulaire doit être réalisée à l’aide d’un microscope confocal avec des lasers appropriés à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile de 63 fois pour chaque image de coupe, des coupes optiques en série à des intervalles de 0,33 micron sur une profondeur totale de cinq microns pour un total de 15 coupes optiques. Au moins trois sections de chaque animal doivent être imagées et au moins trois animaux doivent être inclus dans des conditions expérimentales données. Générer des projections d’intensité maximale à partir de groupes de trois sections consécutives, produisant cinq projections représentant un micron de profondeur chacune.

Ceux-ci sont quantifiés à l’aide de l’image J comme décrit pour les RG C avec un ROI modifié pour déterminer le nombre de synapses formées en l’absence d’astrocytes. L’immunochimie a été réalisée sur rgc dissocié traité avec des milieux de croissance basaux en utilisant des anticorps contre le basson montré en rouge et homer montré en vert comme prévu. Très peu de points de colocalisation synaptique sont observés pour déterminer l’effet des molécules sécrétées par les astrocytes sur le nombre de synapses formées in vitro : les RG C dissociés ont été traités avec des milieux conditionnés aux astrocytes de souris tous les trois jours pour un total de 12 jours après la coloration.

De nombreuses synapses étaient évidentes dans ce neurone, mais il est bientôt affiché en rouge. Homer est montré en vert : des RDC dissociés transfectés avec de la tomate TD cytoplasmique exprimée par Lee ont été traités avec une croissance basale uniquement. Les synapses moyennes ne sont pas visibles.

La tomate TD est visible en bleu et la synapse en rouge. Il y a très peu de signal pour le marqueur post-synaptique homer montré en vert. Lorsque les mêmes cellules sont traitées de manière chronique avec un milieu conditionné aux astrocytes de rat, de nombreuses synapses sont observées.

La tomate TD est en bleu, la synapsine en rouge et l’homer en vert ici. On montre un RGC purifié qui a été traité avec un milieu conditionné aux astrocytes et qui a été coloré pour la pré-synapse en rouge et les marqueurs verts homer post-synaptiques : les masques de seuil générés à l’aide de l’analyseur de perforation correspondent aux deux canaux présents. Lors de l’identification des points de colocalisation, l’analyseur Puncta produit une représentation graphique de ces points.

Une sortie numérique est fournie par l’analyseur de points qui indique le nombre de points discrets identifiés dans les deux canaux et pour les points de colocalisation. Les données produites par l’analyse de ce neurone illustrent la capacité des molécules sécrétées par les astrocytes à favoriser la formation des synapses, comme le montre ici un test synaptique dans lequel la colocalisation du marquage immunohistochimique pré et post-synaptique a été quantifiée pour démontrer la potentialisation de la formation de synapses induite par les astrocytes par la surexpression du récepteur neuronal pour l’importante molécule synaptique thrombo spon, une molécule génique synaptique sécrétée par les astrocytes. Cette figure montre le nombre moyen de synapses par neurone traitées de manière chronique avec des milieux de croissance basaux, gm, ou avec des milieux conditionnés par des astrocytes.

A-C-M-A-C-M favorise plus fortement la formation de synapses dans les cellules ganglionnaires rétiniennes surexprimant le récepteur thrombo spon par rapport aux cellules exprimant surexprimant un vecteur vide. Pour quantifier la densité synaptique chez la souris, les compartiments pré et post-synaptiques du colliculus supérieur ont été marqués séparément à l’aide de marqueurs immunohistochimiques spécifiques des compartiments. Comme le montre ici, il y a eu une augmentation du nombre de synapses entre le septième jour postnatal et la P 14.

Cela illustre l’augmentation du nombre de synapses dans l’ulus supérieur au cours de cette fenêtre de temps de développement. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être complété en deux jours environ pour les cultures neuronales dissociées et en cinq jours environ pour les coupes de cerveau provenant de la récolte de l’animal suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que l’électrophysiologie et la microscopie électronique sont utilisées pour vérifier que les changements dans le nombre synaptique reflètent respectivement les changements dans les synapses fonctionnelles et les synapses ultra-structurellement normales.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer l’immunohistochimie à votre préparation expérimentale pour quantifier le nombre de synapses. Ce protocole détaille comment utiliser des anticorps spécifiques à un compartiment pour marquer sélectivement les compartiments pré et post-synaptiques. Dans ce contexte, nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux obtenus à partir de chacun de ces marqueurs.