Synapses Quantifier: un dosage à base d'immunocytochimie Quantifier Nombre Synapse

L'un des objectifs les plus importants en neurosciences consiste à comprendre les signaux moléculaires qui dirigent les premiers stades de la formation des synapses. Par conséquent, il est devenu essentiel de développer des approches objectives permettant de quantifier les modifications de la connectivité synaptique. Pour quantifier le nombre de synapses dans diverses préparations expérimentales, des neurones en culture ou des préparations histologiques de tissu cérébral en coupes cryostatiques sont marqués à l'aide de marqueurs sélectifs des compartiments pré- et post-synaptiques afin de visualiser les points de contact synaptique entre les neurones.

Les cellules ou tissus sont ensuite observés au microscope fluorescent et des images en 8 bits sont nécessaires pour chacun des canaux correspondant aux deux marqueurs immunohistochimiques. L'analyse des images est effectuée à l'aide d'ImageJ 1.29 avec le module Puncta Analyzer. Pour déterminer le degré de colocalisation entre les marqueurs présynaptiques et postsynaptiques, les points de colocalisation peuvent ensuite être utilisés afin de déterminer le nombre de synapses présentes dans la préparation.

Le principal avantage de la technique décrite ici par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie électronique est que le test de synapse permet une analyse et une quantification du nombre de synapses à haut débit. Les principales implications de cette technique concernent le diagnostic et le traitement de troubles cliniques tels que la maladie d'Alzheimer, l'épilepsie ou l'autisme, dans lesquels des anomalies de la connectivité synaptique ont été impliquées comme base de la pathologie sous-jacente. Cette technique peut être utilisée pour identifier des formes d'intervention capables de réduire ou d'atténuer les déficiences observées dans la capacité des neurones affectés à former des synapses entre eux.

Bien que cette méthode soit utile pour l'étude du développement cérébral, elle peut également être appliquée à d'autres organismes modèles ou systèmes d'organes dans lesquels vous souhaitez étudier ou quantifier le nombre de contacts cellule à cellule, à condition de pouvoir marquer sélectivement chaque face opposée de chaque site de contact. Préparez des cultures neuronales en ensemencant des cellules ganglionnaires rétiniennes de rat purifiées à partir de la rétine de rat, prélevées sur des animaux âgés de P5 à P7, sur des lamelles de verre revêtues de poly-d-lysine. Dans une plaque de 24 puits, les cellules sont laissées à croître à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq jours avant la transfection.

Après la transfection, incuber les cellules pendant sept à huit jours supplémentaires pour permettre le développement des synapses, une fois que les cellules ensemencées ont suffisamment mûri. Retirer le milieu de culture des puits et ajouter 500 microlitres de paraformaldéhyde préchauffé à 4 % dans chaque puits pendant une fixation de sept minutes. À température ambiante, après la fixation, rincer les cellules trois fois avec du tampon phosphate salin.

Il est important de s'assurer que les cellules ne sèchent jamais dans les puits. Dès qu'un tampon est retiré d'un puits, il doit être immédiatement remplacé par le tampon suivant. Préparez le tampon de blocage contenant 50 % de sérum de chèvre normal et 0,2 % de Triton X-100.

Après avoir retiré le PBS de chaque puits, ajouter 200 microlitres de tampon de blocage dans chaque puits et effectuer le blocage pendant 30 minutes. À température ambiante, retirer le tampon de blocage et rincer trois fois avec du PBS. Préparer une dilution d'anticorps primaire dans un tampon contenant 90 % de tampon pour anticorps et 10 % de solution de NGS, incluant la paire d'anticorps pré- et post-synaptique choisie.

Ici, un anticorps polyclonal de lapin anti-synapsine, un marqueur pré-synaptique, et un anticorps monoclonal de souris anti-homer, un marqueur post-synaptique, sont utilisés. Centrifuger la dilution d'anticorps primaire pendant cinq minutes à vitesse maximale dans une centrifugeuse de table afin d'éliminer tout anticorps précipité, puis ajouter 200 microlitres de solution d'anticorps primaire à chaque puits. Placer la plaque dans un récipient humidifié pour éviter le dessèchement de la solution primaire.

Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius après l'incubation avec l'anticorps primaire. Rincer chaque puits trois fois. Ajouter 200 microlitres des anticorps secondaires appropriés, dilués au 1/1000 dans un tampon à anticorps contenant 10 % de NGS préparé, avec du PBS.

Comme précédemment, placez la boîte dans la chambre humidifiée et incubez pendant deux heures à température ambiante à l’abri de la lumière, après l’incubation avec les anticorps secondaires. Rincez chaque puits trois à quatre fois avec du PBS. Déposez une goutte de milieu de montage Vector Shield contenant du DPI sur une lame de verre.

Ensuite, retourner la lame avec les cellules et l’appliquer sur la goutte pour monter l’échantillon. Enfin, appliquer du vernis incolore sur les bords de la lame. Veiller à ne pas déplacer ou bousculer les lames lors de l’application.

Étant donné que cela impliquera le partage des cellules, laissez sécher les lames pendant au moins 30 minutes dans un endroit sec et à l’abri de la lumière. Ici, l’imagerie est réalisée à l’aide d’un microscope à fluorescence Zeiss Axio Imager équipé de jeux de filtres appropriés et d’un objectif à immersion dans l’huile de 63 fois. Placez une lame contenant des cellules non transfectées sur la platine du microscope.

À l’aide du jeu de filtres DPI pour visualiser les noyaux cellulaires, sélectionnez des cellules situées à au moins deux diamètres cellulaires de leurs voisines les plus proches. L’utilisation du DPI pour cette étape permettra d’éviter tout biais et garantira l’aléatoire de la sélection cellulaire. Pour chaque cellule sélectionnée, obtenez des images en 8 bits en utilisant les jeux de filtres appropriés, dans ce cas GFP et Texas Red.

L'image pseudo-colorée superposée doit montrer les marqueurs pré- et post-synaptiques respectivement en rouge et en vert. Ensuite, placer une lame contenant des cellules transfectées sur la platine du microscope. Ici, les cellules ont été transfectées avec un vecteur d'expression de TD-tomato.

Utilisez ce marqueur pour sélectionner les cellules comme précédemment. Pour chaque cellule sélectionnée, obtenez huit images de puits en utilisant les jeux de filtres appropriés, dans ce cas GFP, Texas Red et Sci cinq. L'image superposée aux couleurs fausses doit présenter les marqueurs post-synaptiques en rouge, vert et bleu.

Ici, le programme d'analyse de puncta est utilisé pour la quantification des puncta synaptiques co-localisés. Le module complémentaire Puncta Analyzer a été développé par Barry Walk et est disponible sur demande dans ImageJ 1.26. Ouvrez l'une des images recueillies.

Utilisez l'outil de sélection circulaire pour sélectionner une région d’environ un diamètre cellulaire autour de la SOR d’intérêt. Une fois la région d’intérêt sélectionnée, accédez au menu plugins et choisissez l’analyseur de ponctions dans la fenêtre d’options d’analyse qui s’affiche. Sélectionnez Canal Rouge Canal Vert. Effectuez d’abord la soustraction du fond et définissez le fichier de résultats.

Cliquez sur OK. Ensuite, définissez un emplacement pour enregistrer les résultats. Ces résultats peuvent être exportés vers Excel pour une analyse ultérieure dans la fenêtre qui apparaît.

Ensuite, assurez-vous qu'un rayon de la sphère roulante de 50 est sélectionné et décochez l'option de fond blanc. Cette modification n'est pas obligatoire, mais elle est souvent préférée par les utilisateurs de l'application. Pour faciliter la visualisation, cliquez sur OK.

Une nouvelle fenêtre apparaîtra à côté d'un masque correspondant à l'image du canal rouge. Ajustez le seuil jusqu'à ce que le masque rouge corresponde le mieux possible à autant de piqûres individuelles distinctes que possible, sans introduire trop de bruit, puis cliquez sur terminé.

Définissez la taille minimale du point à quatre pixels. Ne modifiez rien d'autre. Cliquez sur OK.

Répétez l'étape précédente cette fois pour le canal vert. Après avoir répété cette opération avec le canal vert, le plugin fournira une quantification correspondant aux points dans chaque canal séparément, ainsi qu'aux points co-localisés entre les deux canaux. Le test de synapse présenté ici peut être appliqué à des coupes cryo du cerveau et à tout autre tissu du système nerveux, comme la moelle épinière ou la rétine.

À condition qu'il existe une paire appropriée de marqueurs pré- et post-synaptiques. Commencez par prélever le tissu cérébral d'une souris ayant été euthanasiée par exsanguination et perfusion avec du PBS. Placez l'ensemble du cerveau dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS à quatre degrés Celsius pendant toute la nuit ; procédez le lendemain.

Rincez le cerveau trois fois avec du PBS. Protégez le cerveau par congélation en le plaçant dans du saccharose à 30 % dans du PBS.

Le tissu flottera initialement ; maintenez-le à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'il coule au fond. À ce stade, la cryoprotection est terminée. Ensuite, incluez le cerveau dans une solution de 20 % de saccharose dans OCT et PBS selon un rapport de deux pour un, en lui donnant l'orientation souhaitée pour la coupe.

Par exemple, sagittal ou coronal. Ensuite, placez une surface métallique plane sur un seau de glace sèche. Placez le cerveau inclus sur celle-ci pour le congeler ; une fois congelé, transférez le cerveau dans un sac congélation et stockez-le à moins 80 degrés Celsius pendant jusqu'à un an avant la sectionnement.

À l’aide d’un cryostat, découper le tissu en sections de 12 à 16 micromètres et monter celles-ci sur des lames de verre. Ensuite, sécher les lames en les plaçant dans une étuve à 37 degrés Celsius. Puis les rincer trois fois au PBS pour éliminer l’OCT résiduel.

Un stylo à paraffine est utilisé pour créer une barrière hydrophobe autour de la lame, et du tampon de blocage est ajouté sur la lame, empêchant ainsi le liquide de s'écouler grâce à la frontière de paraffine. Placer les lames dans du sérum de chèvre normal à 20 % dans du PBS pendant une heure à température ambiante pour effectuer le blocage, puis placer les sections dans des anticorps primaires dilués dans du PBS contenant 0,3 % de Triton et 10 % de sérum de chèvre normal.

Ici, l'anticorps de lapin anti-PSD 95 est utilisé pour marquer les compartiments post-synaptiques glutamatergiques, et l'anticorps de cobaye anti-vGluT2 sert à marquer les terminaisons pré-synaptiques glutamatergiques. Placer les lames à quatre degrés Celsius et incuber de 36 à 60 heures. Après l'incubation, éliminer l'anticorps primaire en plongeant les lames trois fois dans du PBS pendant 15 minutes chacune.

Après cette étape, veillez à protéger les lames de la lumière directe. Appliquez les anticorps secondaires dilués au 1/200 dans du PBS contenant 0,3 % de Triton et 10 % de sérum de chèvre normal. Ici, chèvre anti-cochon d'Inde.

Alexa 488 et anti-lapin provenant de chèvre. Alexa 594 sont utilisés. Incuber pendant deux heures à température ambiante à l'abri de la lumière.

Lavez les lames en les immergeant quatre fois dans du PBS pendant 15 minutes chacune pour la montaison. Ajoutez de petites gouttes de milieu de montage vectoriel avec DAPI et recouvrez les lames avec des lamelles. Appliquez du vernis à ongles pour empêcher les déplacements des lamelles.

L'imagerie des coupes de tissu doit être réalisée à l'aide d'un microscope confocal équipé de lasers appropriés et d'un objectif à immersion huile de 63 fois pour chaque image de coupe, en effectuant des sections optiques sérielles à des intervalles de 0,33 micron sur une profondeur totale de cinq microns, soit un total de 15 sections optiques. Au moins trois coupes par animal doivent être imagées, et au moins trois animaux doivent être inclus pour une condition expérimentale donnée. Générer des projections d'intensité maximale à partir de groupes de trois coupes consécutives, produisant ainsi cinq projections représentant chacune une profondeur d'un micron.

Leur quantification est effectuée à l'aide d'ImageJ, comme décrit pour les CBR, en utilisant une ROI modifiée afin de déterminer le nombre de synapses formées en l'absence d'astrocytes. Une immunohistochimie a été réalisée sur des CBR dissociés traités avec un milieu de croissance basique, en utilisant des anticorps dirigés contre la bassoon, en rouge, et contre la homer, en vert, comme attendu. Très peu de points de colocalisation synaptique sont observés. Pour déterminer l'effet des molécules sécrétées par les astrocytes sur le nombre de synapses formées in vitro, les CBR dissociés ont été traités avec un milieu conditionné par des astrocytes de souris tous les trois jours, pendant un total de 12 jours, suivis d'une coloration.

De nombreuses synapses étaient visibles dans ce neurone, mais bientôt est montré en rouge. Homer est montré en vert dans des RDC dissociées transfectées avec une tomate TD exprimée dans le cytoplasme ; les cellules ont été traitées uniquement avec un milieu de croissance basal. Les synapses ne sont pas visibles dans le milieu.

La tomate TD apparaît en bleu et la synapse en rouge. On observe très peu de signal pour le marqueur post-synaptique homer, montré en vert. Lorsque les mêmes cellules sont traitées de façon chronique avec un milieu conditionné d'astrocytes de rat, de nombreuses synapses sont observées.

La tomate TD est en bleu, la synapsine en rouge et l'homer en vert ici. Une cellule ganglionnaire rétinienne purifiée est montrée, ayant été traitée avec un milieu conditionné par des astrocytes et colorée pour les marqueurs pré-synaptiques en rouge et les marqueurs post-synaptiques homer en vert ; des masques seuils générés à l’aide de l’analyseur de puncta correspondent aux deux canaux présents. Après identification des points de colocalisation, l’analyseur de puncta fournit une représentation graphique de ces points.

Un résultat numérique est fourni par l'analyseur de points, indiquant le nombre de points discrets identifiés dans les deux canaux ainsi que les points de colocalisation. Les données obtenues à partir de l'analyse de ce neurone illustrent la capacité des molécules sécrétées par les astrocytes à favoriser la formation de synapses, comme le montre ici un test de synapse dans lequel la colocalisation des marquages immunohistochimiques pré- et post-synaptiques a été quantifiée afin de démontrer la potentialisation, par surexpression du récepteur neuronal de la thrombospondine, molécule synaptogénique sécrétée par les astrocytes, de la formation de synapses induite par les astrocytes. Ce graphique présente le nombre moyen de synapses par neurone traité de façon chronique avec un milieu de croissance basique, gm, ou avec un milieu conditionné par les astrocytes.

A-C-M-A-C-M favorise plus fortement la formation de synapses dans les cellules ganglionnaires de la rétine surexprimant le récepteur thrombospon dine par rapport aux cellules surexprimant un vecteur vide. Afin de quantifier la densité synaptique dans le colliculus supérieur de souris, les compartiments pré- et post-synaptiques ont été marqués séparément à l’aide de marqueurs immunohistochimiques spécifiques aux compartiments. Comme illustré ici, on observe une augmentation du nombre de synapses entre le septième jour postnatale et le jour P 14.

Ceci illustre l'augmentation du nombre de synapses dans le gyrus supérieur au cours de cette période de développement. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en environ deux jours pour des cultures neuronales dissociées et en environ cinq jours pour des sections de cerveau, à compter du prélèvement sur l'animal selon cette procédure. D'autres méthodes, telles que l'électrophysiologie et la microscopie électronique, sont utilisées pour vérifier que les variations du nombre de synapses reflètent respectivement des modifications des synapses fonctionnelles et des synapses normales sur le plan ultrastructurale.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment appliquer l'immunohistochimie à votre préparation expérimentale afin de quantifier le nombre de synapses. Ce protocole décrit comment utiliser des anticorps spécifiques aux compartiments pour marquer sélectivement les compartiments pré- et post-synaptiques. Dans ce contexte, nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux obtenus à partir de chacun de ces marqueurs.