Agar-Block microcosmes pour la décomposition des tissus végétaux contrôlés par des champignons aérobie

L’objectif global de cette procédure est d’inoculer un champignon aérobie dégradant le bois dans un microcosme de boîte de Pétri où l’humidité du bois et les substrats exogènes sont étroitement contrôlés. Ceci est accompli en préparant d’abord des microcosmes avec les volumes exacts d’édia connus. Ensuite, le bois à dégrader et les éventuels substrats solides exogènes sont assemblés sur une grille en plastique sur la surface agricole sans permettre le contact entre les substrats.

Le microcosme est ensuite inoculé et incubé avec le champignon d’essai. Après l’incubation, les blocs de bois sont récoltés pour déterminer la perte de masse et préparer les tissus pour les analyses. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent le degré de biodégradation du bois et le rôle des sources d’éléments exogènes grâce à des mesures de perte de masse, des observations de la morphologie mycélienne et des analyses élémentaires ciblées comme la spectroscopie à plasma à couplage inductif.

Bonjour, je m’appelle Brooke Jacobson du laboratoire du Dr Jonathan Schilling au Département des bioproduits et de l’ingénierie des biosystèmes de l’Université du Minnesota. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’utilisation des boîtes de Pétri comme microenvironnements pour la décomposition des tissus végétaux par des champignons aérobies. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les mécanismes de décomposition fongique de la lignocellulose

La lignocellulose est le tissu végétal composé de lignine, de cellulose et d’hémicellulose. Les erreurs de bois sont les aspects moins techniques de la conception des blocs de tarière sont les causes de défaillance les plus courantes et les principales sources de variabilité entre les études, ce qui rend utile la publication vidéo de notre configuration de bloc de tarière. Nous savons par expérience que cette procédure donne des résultats de haute qualité et de faible variabilité.

Alors commençons. Pour ces expériences, utilisez des boîtes de Pétri qui sont un centimètre plus profondes que les boîtes de Pétri typiques pour augmenter l’espace libre au-dessus du bloc de bois. Dans le microcosme.

Commencez la préparation du microcosme en préparant suffisamment d’edia pour 20 millilitres par boîte de Pétri pour ne pas avoir de calcium ni de fer. Tapez une gélose à raison de 15 grammes de gélose dans une fiole jaugée de 500 millilitres contenant environ 400 millilitres d’eau déminéralisée amendée avec des suppléments. Utilisez des solutions mères préalablement préparées pour ajouter des micronutriments au mélange.

Une fois les nutriments ajoutés, remplissez le ballon jaugé jusqu’à la ligne de 500 millilitres. Ensuite, transférez le support dans une fiole de 1000 millilitres. L’autoclave à 121 degrés Celsius et 16 PSI pendant 20 minutes.

Veillez à ne pas dépasser un volume de 500 millilitres par ballon pour éviter de voir l’agri solidifier avant l’administration des plaques d’essai. Après l’autoclavage, laissez le média refroidir au toucher pour minimiser la condensation. La minimisation de l’humidité est essentielle dans ces expériences comme la teneur en humidité ou mc.

Plus de 80 % provoquera une anoxie dans les tissus. Limitez la pourriture par les champignons aérobies et augmentez la variabilité une fois. Refroidir. Utilisez un aide-pipette portable et des pipettes en polystyrène stériles de 10 millilitres pour aseptique.

Transférez la gélose dans une pile élevée de plaques dans une armoire de biosécurité. Ensuite, coupez généreusement des grilles en plastique pour les adapter à l’intérieur du fond des plaques. Après avoir coupé et soigneusement lavé les grilles avec de l’eau et du savon, préparez les grilles pour le séchage et l’autoclave pour cette démonstration.

Le pin jaune du Sud ou SYP est utilisé car il représente une source importante de bois d’œuvre. Dans les habitations résidentielles aux États-Unis, utilisez du bois non traité et coupez des blocs sans nœuds de 19 x 19 millimètres à partir d’une seule coupe longitudinale le long du grain. Coupez cette longueur en blocs cubiques de 19 millimètres.

Fendez les blocs cubes de 19 millimètres en deux dans le sens du grain à l’aide d’un ciseau et d’un marteau au lieu d’une scie. Cela fait un bord de bloc rugueux à faire face vers le bas sur le treillis en plastique dans le microcosme du bloc agri et un bord supérieur lisse à étiqueter. Étiquetez le bord lisse des blocs avec un crayon, coupez suffisamment de blocs pour satisfaire les traitements, ainsi que les témoins non inoculés qui serviront à la fois de moniteurs de contamination et d’échantillons de données de référence conditionnés en parallèle pour les matériaux séchés au four, placez les échantillons dans des bacs à lactosérum en aluminium et dans un four à convection à 100 degrés Celsius pendant 48 heures.

Transférez les échantillons du four dans une dessiccation pour les refroidir une fois. Refroidir. Pré-pesez les échantillons pour déterminer le poids initial à sec du four. Enfin, préparez les échantillons, y compris les grilles en plastique et le bois pour l’autoclave en les enveloppant hermétiquement avec du papier d’aluminium pour minimiser le mouillage.

Cela n’exige pas que chaque échantillon soit emballé individuellement, mais que l’exposition à la vapeur soit faible et constante. Autoclavez les échantillons marqués à 121 degrés Celsius et 16 PSI pendant une heure. Dans une enceinte de biosécurité stérile, assemblez des AE vides, une plaque source pour les matériaux exogènes de substrat végétal à maille d’inoculum, une bande de paraforme sharpie, des pinces et des outils de transfert.

L’étape suivante de l’inoculation consiste à ajouter les articles à l’agri, contenir des boîtes de Pétri pour minimiser le risque de contamination. Outils de transfert de flamme et pinces avec 95 % d’éthanol au fur et à mesure de leur utilisation. Tout d’abord, ajoutez le treillis en plastique dans la boîte de Pétri.

Ajoutez ensuite le substrat en bois ici. Deux blocs de bois sont ajoutés sur toute la longueur du maillage afin que les données des récoltes précoces et tardives puissent être appariées. Ces blocs sont ajoutés côte à côte avec le grain et face à la pointe de la source de l’inoculum fongique.

Ensuite, ajoutez les matériaux exogènes. Ici. Le rôle du gypse est testé sur la décomposition par un champignon filamenteux. Par conséquent, le champignon devrait rencontrer ces disques de gypse avant d’atteindre le bois.

Un disque de gypse est ajouté entre chaque bloc et le point d’inoculum au-dessus du treillis. Prenez soin d’éviter tout contact entre les disques dans le bois tout en les gardant rapprochés. Pour l’inoculum fongique, utilisez un Boer en liège numéro quatre de sept millimètres de diamètre pour fabriquer des bouchons à partir de cultures de deux semaines cultivées dans 20 millilitres de gélose.

Cela aide à contrôler le volume de l’inoculum. Pour les témoins non inoculés, il est préférable d’ajouter un bouchon à partir d’une plaque stérile. Ne laissez pas entrer en contact l’inoculum avec les substrats exogènes ou le bois, mais placez-les à proximité les uns des autres.

Utilisez un bouchon d’inoculum par bloc. Scellez la vaisselle avec le param qui a été coupé avec un rasoir, maintenez les plaques horizontalement et enveloppez le param dans un mouvement continu et doux. Enfin, étiquetez les couvercles des plats à l’aide d’un marqueur résistant à l’alcool en étiquetant les numéros de bloc directement sur les substrats respectifs.

Dessinez également des cercles sur les disques de gypse. Transférez soigneusement les plaques dans un incubateur biologique pour éviter de bousculer le contenu et pour minimiser la condensation due aux fluctuations de température. Les conditions utilisées ici sont à 20 degrés Celsius et, dans l’obscurité, les récoltes en série chronologique sont aseptiques, à l’exception de la dernière récolte.

Au point de récolte de la cinquième semaine, retirez tout le lot de traitement. Vaporisez chaque bas et chaque haut avec de l’éthanol à 70 % et utilisez une pince flammée pour retirer le matériau à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité. Prenez des photos avant de détruire les plaques agricoles, en vous concentrant sur tout morphe F ou melon.

Retirez ensuite les blocs à traiter. Roulez tout excès de pha, mais veillez à ne pas perdre de matériau décomposé au four. Sécher les blocs dans des casseroles en aluminium et déterminer la perte de masse à l’aide des poids frais et secs des commandes pour surveiller l’évacuation excessive de l’humidité.

Les données sur la perte de masse aident à évaluer la progression de la décomposition et constituent des données importantes. Si les concentrations élémentaires doivent être calculées sur la base du gramme poids, les données en pourcentage doivent être normalisées. Pour les statistiques, étiquetez et suivez tous les blocs brun foncé, qui sont clairement gorgés d’eau.

Enfin, détruisez les cultures dans des sacs autoclavables, en économisant les mailles de support en plastique et tout autre composant qui peut être recyclé pour être utilisé dans de futures expériences. À l’aide de la configuration du microcosme des blocs agricoles, les blocs de bois de pin reposent sur un treillis en plastique pour élever les blocs au-dessus du contact agricole. Des rainures circulaires se sont développées en contact direct avec les surfaces de gypse et dans les blocs de bois.

Ce mycélium représente un lien important entre le bois et les sources exogènes d’éléments nutritifs. Le contrôle de ces sources de matériaux exogènes dans la gélose ou les matériaux solides est un avantage clé d’une conception en bloc agricole par rapport à la conception en bloc de sol : le pourcentage moyen de perte de poids comme mesure de l’étendue de la décomposition du bois par les descendants après cinq et 15 semaines. L’incubation avec du pin dans des microcosmes de blocs agricoles est montrée ici.

Il n’y avait aucun traitement. Cinq millimolaires de chlorure de calcium ajoutés à une gélose contenant plus de 99 % de gypse pur ou 1 % de gypse amendé au fer pour chaque barre de récolte sous la même lettre ne sont pas significativement différents. Avec les barres d’erreur représentant l’écart-type, une perte de poids de plus de 60 % a été observée dans les blocs de pin pourris bruns témoins, ce qui satisfait à l’objectif standard de l’American Society for Testing and Materials de plus de 50 % de pourriture.

Le coefficient de variation moyen de la décomposition était de 0,055 à la semaine 16. En plus de la faible variabilité, un effet de traitement a été observé. La pourriture fongique a été inhibée par des ajouts de calcium, que ce soit dans la gélose sous forme de chlorure de calcium ou de gypse pur.

Il est intéressant de noter que les taux de décomposition rebondissent avec l’ajout de fer au gypse. Suggérer du fer et non du calcium est essentiel pour observer les cinq répétitions à la semaine 15 de la décomposition. Par le même pourriture brune, champignon test, lamines circulaires, la couleur du mycélium me révèle.

Différences dans les hyphes externes entre les traitements, les blocs ont été enlevés et remontés et séchés. Révélant le manque de mein dans le traitement sans calcium. Le jaunissement dans les traitements au calcium pur et l’aspect rouille dans le traitement amendé au fer.

Le témoin représente des blocs non inoculés à des fins de comparaison. Il est intéressant de noter que les effets mein sont perdus en utilisant un milieu à haute teneur en fer. Collectivement, il est suggéré que ce champignon utilise du fer, et non du calcium.

Dans ces matériaux, nous venons de vous montrer comment utiliser une configuration de bloc de tarière pour tester avec succès la biodégradation des tissus végétaux par des champignons filamenteux aérobies. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’empêcher les substrats d’entrer en contact les uns avec les autres, en particulier les tissus végétaux et la tarière, de minimiser la teneur en humidité de la tarière et des plaquettes, et de vérifier que le contenu de chaque plaque n’a pas bougé avant l’incubation. En gardant ces variables à l’esprit, vous pouvez contrôler l’environnement de décomposition beaucoup mieux que vous ne le pouvez lorsque vous utilisez une configuration de bloc de sol.

Vous pouvez générer des données avec une puissance statistique nécessaire pour répondre à vos questions de recherche. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.