Name: Une plaque de microtitrage à 96 puits à base Méthode de formation suivi et les tests de sensibilité antifongique des Candida albicans Les biofilms (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Apprenez une méthode de formation de biofilms de Candida albicans sur plaques de microtitrage à 96 puits pour évaluer la sensibilité aux antifongiques. Cette technique simple et reproductible facilite le dépistage de l'activité antifongique.

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Biofilm liés travailler dans le laboratoire est financé par des subventions et numérotées R21DE017294 R21AI080930 de l&#39;Institut national de recherche dentaire et craniofaciale et l&#39;Institut national des maladies allergiques et infectieuses (pour JLL-R.). Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;NIDCR, le NIAID ou du NIH.

1. Préparation de C. albicans C. albicans est un microorganisme 1/BSL1 des risques du Groupe. Rappelez-vous toujours à la bonne utilisation des techniques aseptiques / stériles pour travailler avec ce micro-organisme et de suivre les procédures institutionnelles pour l'élimination appropriée des matériaux biologiques dangereux. <ol><li> Préparer une culture de nuit de C. albicans dans YPD (levure-peptone dextrose) milieu liquide en inoculant une seule colonie de C. albicans dans 25 ml de YPD. </li><li> Incuber la culture dans un agitateur orbital (environ 180 rpm) à 30 ° C pendant la nuit. C. La plupart des albicans souches augmentera à mesure que les cellules de levure dans ces conditions. </li><li> Centrifuger les cultures de la nuit (environ 3000 rpm, 5-10 minutes), se laver les cellules deux fois avec du PBS stérile, et remettre le culot final dans environ 20-25 ml de milieu RPMI 1640 tamponné avec 165 mM d'acide morpholinepropanesulfonic à pH 7,0 et préchauffé à 37 ° C (à partir de maintenant sur ce milieu est appelé simplement "RPMI 1640"). </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Après le dépouillement, préparer une suspension de cellules à une densité finale de 1,0 x 10 6 cellules / ml dans du RPMI 1640. Remarque: Parce que les cellules ont tendance à s'agréger, il est important de vortexer vigoureusement entre les lavages et avant le pipetage. </li></ol> 2. Configuration de la plaque de 96 puits de microtitration pour la formation du biofilm <ol><li> En utilisant une pipette multicanaux ajouter 100 uL de C. la suspension albicans dans les puits sélectionnés de la plaque de 96 puits de microtitration (-s). Ne pas ajouter des cellules à des puits dans la colonne 12, car ceux-ci servent de témoins négatifs. </li><li> Recouvrir la plaque de microtitration entière avec son couvercle d'origine, joint avec du parafilm, place à l'intérieur d'un incubateur et incuber pendant 24 h à 37 ° C. La durée d'incubation peut être adapté à la conception spécifique expérimentale. Par exemple, il est possible d'examiner la cinétique de formation d'un biofilm sur une période de 24 - 48 heures par ensemencement des plaques multiples et le traitement de chaque plaque à différents moments (c. 2, 4, 8, 12, 24 et 48 h) </li><li> Après la formation du biofilm, à l'aide d'une pipette multicanaux aspirer le support de soin que de ne pas toucher et perturber le biofilm qui se sont formés dans chacun des puits. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux plaques laver trois fois dans du PBS stérile (200 ul par puits). Sinon, utilisez une rondelle de microtitration automatisé assiette. Entre les lavages, et notamment après le dernier lavage, égouttez les plaques en position inversée en épongeant avec du papier absorbant pour enlever tout résidu de PBS. A ce point biofilms formés sur le fond des puits doit être clairement visible, même à l'œil nu et peut également être visualisés à l'aide d'un microscope inversé (figure 1). Les biofilms sont maintenant prêts à être traitées pour des dosages des tests de sensibilité antifongique. (Si le but principal de l'expérience est d'évaluer l'étendue de la formation de biofilms, les plaques sont prêtes à être traitées en utilisant la méthode colorimétrique. Pour cela, le réactif XTT / ménadione (voir l'étape 3 ci-dessous) peuvent être ajoutés et la couleur résultante lus en utilisant un lecteur de plaque de microtitration). </li></ol> 3. Test de sensibilité aux antifongiques des biofilms <ol><li> Des solutions stock ou en poudre, préparer une solution de travail en milieu RPMI 1640 de chaque antifongiques à tester. Typiques des concentrations élevées sont 1024 pg / ml pour le fluconazole, et 16 pg / ml à la fois pour l'amphotéricine B et la caspofungine. D'autres concentrations peuvent être utilisées pour différents agents. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 200 ul de la forte concentration de travail des antifongiques dans les puits correspondants dans la colonne 1 de chaque plaque de microtitration contenant des biofilms fongiques. </li><li> Ajouter 100 ul de RPMI 1640 à chacun des puits dans les colonnes 2 à 10. </li><li> Ajouter 100 ul de RPMI 1640 aux puits dans la colonne 11. </li><li> Retirer 100 uL d'agent antifongique dans les puits de la colonne 1 et l'ajouter au puits adjacents dans la colonne 2 (contenant déjà 100 ul de milieu). </li><li> Mélangez le contenu bien par aspiration et refoulement d'effectuer une double dilution en série, et de supprimer les pointes. </li><li> Répétez jusqu'à ce que le déplacement vers la droite des puits de la colonne 10, après quoi la finale du 100 volumes uL dans les puits de la colonne 10 après le mélange est jeté. De cette façon, une série de dilutions de votre agent (-s) d'intérêt ont été créés; de la plupart concentrées dans les puits de la colonne 1 de moins concentrées dans les puits de la colonne 10. Biofilms incontesté dans la colonne 11 servira de contrôles positifs, et les puits vides dans la colonne 12 servira de contrôles négatifs. </li><li> Couvrir les plaques avec leur couvercle, joint avec du parafilm et incuber pendant 24 h -48 à 37 ° C. </li><li> Après la période d'incubation, laver les assiettes que dans l'étape 2.4 avant (3 x PBS). </li><li> En utilisant une pipette multicanaux ajouter 100 ul de XTT / ménadione solution à chaque puits contenant un biofilm pré-lavés ainsi que les puits de contrôle négatif pour la mesure de X de fondTT-colorimétrique niveaux. <ol><li> Le XTT est préparée comme une solution saturée à 0,5 g / L dans le lactate de Ringer stérile, PBS ou de solution saline, qui doit être stérilisée par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um de taille des pores. La solution est sensible à la lumière XTT, donc il devrait être couvert avec du papier aluminium pendant la préparation. Une fois préparé et stérilisé par filtration, partie aliquote dans 10 mL volumes de travail, et conserver à -70 ° C. Protéger les tubes de la lumière en utilisant du papier d'aluminium. Décongelez uniquement comme de nombreux tubes comme nécessaire pour une expérience particulière, juste avant utilisation. </li><li> Ménadione est préparée comme une solution à 10 mM dans l'acétone à 100%, répartie dans des petits volumes (environ 50 pi) et conservés à -70 ° C. Préparer la solution XTT / ménadione juste avant l'utilisation, en ajoutant 1 pl de la solution stock de ménadione dans un tube contenant 10 ml de la solution XTT décongelé. </li></ol></li><li> Couvrir les plaques dans du papier aluminium et laisser incuber dans l'obscurité pendant 2 h à 37 ° C. </li><li> Découvrez les assiettes. En utilisant une pipette multicanaux retirer 80 ul du surnageant résultant de couleur de chaque puits et le transfert dans les puits correspondants d'une plaque de microtitration nouvelles. </li><li> Lire la plaque (-s) dans un lecteur de microplaque à 490 nm. </li><li> Calculer les concentrations minimales inhibitrices sessiles SMIC50 et SMIC80, qui sont les concentrations antifongiques au cours de laquelle une diminution de 50% ou 80% dans les lectures colorimétriques sont détectés en comparaison avec le contrôle des biofilms formés en l'absence de médicament antifongique (dans ce cas les valeurs de la colonne 11 , rappelez-vous aussi à soustraire des valeurs de contrôle négatif à partir de puits dans la colonne 12 contenant XTT seulement). Les résultats du SMIC peut être présenté comme un tableau (ie multiples contre des isolats antifongiques multiples) ou, alternativement, les résultats individuels pour chaque champignon d'isoler les uns contre les antifongiques peuvent être présentés sous forme de graphique en traçant la concentration d'inhibition pour cent par rapport antifongique. </li></ol> Exemple: Après avoir soustrait les valeurs dans le contrôle négatif, la DO moyenne de biofilms formés de contrôle dans la colonne 11 est de 1,32. Le SMIC50 est la plus faible concentration antifongique conduisant à une réduction&gt; 50% dans les lectures colorimétriques, dans ce cas moins de 1,32 x 50 / 100 = 0,66. De même, le SMIC80 est la plus faible concentration antifongique conduisant à une réduction&gt; 80% dans les lectures colorimétriques, dans ce cas moins de 1,32 x 20/100 = 0.264. 4. Les résultats représentatifs La figure 1 montre une microphotographie d'un C. albicans biofilm formé sur le fond d'un puits dans une plaque de microtitrage à 96 ainsi prises à l'aide d'un microscope inversé. La figure 2 montre XTT-colorimétrique des lectures (DO 490 valeurs) pour chacun des 11 biofilms d'un C. souche de type sauvage albicans formé dans chacune des huit lignes différentes de la même plaque de microtitration 96 puits. La figure 3 montre l'activité de l'amphotéricine B à des concentrations différentes contre C. albicans biofilms; flèches indiquent SMIC50 et SMIC80 valeurs. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> La figure 1 (A). Panneau A montre une microphotographie prise avec une caméra reliée à un microscope inversé d'un C. albicans biofilm formé sur le fond du puits après aspiration du milieu RPMI et lavages successifs au PBS. (B) une micrographie d'un typique C. albicans biofilm visualisé par microscopie électronique à balayage. Les bars sont 100 um et 10 um pour les panneaux A et B respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Formation de multiples équivalents C. albicans biofilms dans les plaques 96 puits de microtitration. lectures colorimétriques (DO 490 valeurs) à partir de réduction des dosages XTT des biofilms formés par un C. albicans type sauvage dans des puits de microplaques. Les valeurs sont indépendantes de 11 biofilms formés dans chacune des huit lignes différentes de la même plaque de microtitration 96 puits. Résultats pour les différentes lignes ont été comparés par une analyse de variance et en utilisant le test de Bartlett pour l'homogénéité des variances et des comparaisons multiples de Bonferroni du post-test. Aucune différence statistiquement significative n'a été notée en comparant toutes les paires de lignes à l'autre (p&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Les résultats typiques des tests de sensibilité antifongique contre C. albicans biofilms. graphique illustrant les résultats typiques de l'efficacité de différentes concentrations d'amphotéricine B contre les biofilms d'un C. souche de type sauvage albicans. Les valeurs sont exprimées en pour cent en moyenne des lectures colorimétriques pour XTT de réduction par rapport aux tests de contrôle de puits. SMIC50 et SMIC80 valeurs sont indiquées par des flèches.

<ol><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li>
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<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li>
<li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+development%2C+modeling+a+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li>
</ol>

JLL-R possède une participation dans les technologies MicrobeHTS, Inc, qui est le développement d&#39;agents antifongiques. Technologies MicrobeHTS, Inc fourni aucune aide financière pour ces études.

Nous décrivons ici un moyen simple, rapide, économique et hautement reproductibles 96 modèle bien microplaque pour la formation de biofilms à Candida couplée à une méthode colorimétrique qui mesure l&#39;activité métabolique des cellules au sein du biofilm en utilisant XTT. Ce modèle bien 96 microplaque pour la formation de biofilms a été initialement développé pour C. albicans, mais peut être utilisé pour d&#39;autres espèces de Candida. et facilement adaptable à d&#39;autres organismes fongi...

<table><tbody><tr><td>Agar Sabouraud-dextrose</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>Pour préparer des plaques destinées à des sous-cultures fraîches d'isolats fongiques</td></tr><tr><td>YPT : extrait de levure, peptone, dextrose</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>Milieu de propagation pour des cultures liquides de 24 heures</td></tr><tr><td>RPMI-1640 sans bicarbonate de sodium, supplémenté avec de la L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>Milieu liquide pour la formation de biofilms</td></tr><tr><td>Acide morpholinopropanesulfonique (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>Pour tamponner le RPMI 1640</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tampon utilisé pour les lavages</td></tr><tr><td>Sel de sodium du XTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>Voir ci-dessus pour les instructions de préparation</td></tr><tr><td>Lactate de Ringer&amp;rsquo;s</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>Pour la préparation de la solution de XTT</td></tr><tr><td>Ménadione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>Attention : dangereux par contact cutané, inhalation ou ingestion</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de centrifugation de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de centrifugation de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Plaques microtitration à 96 puits : en polystyrène, fond plat, traitées pour culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanal et embouts</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques microtitration</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une plaque de microtitrage à 96 puits à base méthode de formation suivi et les tests de sensibilité antifongique des candida albicans les biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans reste la cause la plus fréquente des infections fongiques chez une population en expansion des patients compromise et la candidose est maintenant le troisième plus fréquente d&#39;infection dans les hôpitaux américains. Différentes manifestations de la candidose sont associés à la formation de biofilm, à la fois sur tissus de l&#39;hôte et / ou des dispositifs médicaux (cathéters par exemple). La formation du biofilm porte négatives implications cliniques, comme les cellules dans le biofilm sont protégées par des réponses immunitaires de l&#39;hôte et de l&#39;action des antifongiques. Nous avons développé un modèle simple, rapide et robuste in vitro pour la formation de C. biofilms albicans aide de 96 puits de microtitration-plaques, qui peut également être utilisé pour tester la sensibilité aux antifongiques biofilm. La lecture de ce dosage est colorimétrique, basée sur la réduction du XTT (un sel de tétrazolium) par les cellules métaboliquement active biofilm fongique. Une expérience typique dure environ 24 h pour la formation de biofilms, avec un supplément de 24 h pour les tests de sensibilité aux antifongiques. En raison de sa simplicité et l&#39;utilisation de matériel de laboratoire couramment disponibles et des équipements, cette technique démocratise la recherche biofilm et représente une étape importante vers la normalisation des tests de sensibilité aux antifongiques des biofilms fongiques.

Nous décrivons une méthode simple, rapide et robuste pour la formation de<em&gt; Candida albicans</em&gt; Biofilms en utilisant des plaques de microtitration 96 puits et son utilité dans les tests de sensibilité antifongique de cellules au sein des biofilms.

Une plaque de microtitrage à 96 puits à base Méthode de formation suivi et les tests de sensibilité antifongique des Candida albicans Les biofilms

Candida albicans demeure la cause la plus fréquente d'infections fongiques au sein d'une population croissante de patients immunodéprimés et la candidose est désormais la troisième...

L'objectif général de cette procédure est de former des biofilms de Candida albicans et d'examiner leur sensibilité aux agents antifongiques. Cela est réalisé en formant d'abord ces biofilms fongiques dans les puits de plaques microtitrables à 96 puits, puis en ajoutant des antifongiques aux biofilms préformés et en incubant pendant 24 à 48 heures après cette incubation.Une méthode colorimétrique mesurant l'activité métabolique des cellules au sein des biofilms est utilisée pour évaluer l'activité de ces antifongiques, afin de déterminer la concentration minimale inhibitrice des antifongiques contre les biofilms. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent la capacité de formation de biofilms et les tests de sensibilité aux antifongiques grâce à une méthode simple et facile basée sur une plaque microtitration de 96 puits, couplée à une lecture colorimétrique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est facile, relativement peu coûteuse, hautement reproductible et permet la formation de multiples biofilms équivalents.De plus, elle est compatible avec la technologie de plateforme 96 puits couramment disponible dans la plupart des laboratoires de recherche et cliniques. Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement des canidés. En effet, très souvent, ces infections sont associées à la formation de biofilm.En utilisant des techniques appropriées de manipulation microbiologique, prélever une boucle pleine de cellules à partir d'une sous-culture fraîche d'albicans sur une plaque de cuivre de dextrose SAU Alan et inoculer dans un flacon Erlenmeyer de 125 millilitres contenant 25 millilitres de bouillon de dextrose pepane aux levures. Placer la culture dans un agitateur orbital réglé à 180 tr/min et à 30 degrés Celsius, puis incuber toute la nuit. Après l'incubation nocturne, verser les cultures de levures dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifuger à 3000 tr/min pendant cinq à dix minutes. Jeter le surnageant et vortexer.Agiter vigoureusement le culot pour désagréger les cellules. Ensuite, ajouter du PBS stérile pour laver, puis centrifuger à nouveau les cultures. Répéter cette étape de lavage une fois de plus avant de resuspendre les cellules.Dans environ 20 millilitres de RPMI 1640, un milieu tamponné à pH 7,0. À l'aide d'une solution de mops à 165 millimolaire préalablement réchauffée à 37 degrés Celsius, préparez une dilution d'un à 100 à partir de cette suspension en utilisant un hémocytomètre standard et un microscope à champ clair. Comptez les cellules.Ensuite, préparez une suspension finale de cellules à une concentration de 1 × 10⁶ par millilitre dans du RPMI 1640 tamponné et réchauffé. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 100 microlitres de la suspension de cellules dans les puits sélectionnés d’une plaque stérile de 96 puits à fond plat. Laissez les puits de la colonne 12 vides, car ils serviront de témoins négatifs.Après avoir recouvert et scellé la plaque avec du paraforme, incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 24 heures afin de permettre la formation des biofilms. À l'issue de l'incubation, aspirez délicatement et jetez le milieu de chaque puits, en prenant soin de ne pas perturber les biofilms formés au fond.Effectuer un lavage en ajoutant 200 microlitres de PBS dans chaque puits, puis drainer en inversant délicatement la plaque et en l’essuyant sur une pile de serviettes en papier. Répéter cette étape de lavage trois fois. À ce stade, les biofilms sont détectables à l’œil nu et peuvent être visualisés à l’aide d’un microscope inversé ou de MEB.Nous pouvons constater que les biofilms sont constitués d'un mélange entrelacé de filaments et de cellules levuriennes. Une fois la formation du biofilm vérifiée, on peut commencer les tests d'agents antifongiques en utilisant du milieu RPMI 1640 tamponné ; préparer des solutions travail à haute concentration des agents antifongiques à tester. Les concentrations élevées typiques sont de 1024 microgrammes par millilitre pour le fluconazole et de 16 microgrammes par millilitre pour l'amphotéricine B et CASPO fungi beri.Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solutions antifongiques dans les puits de la colonne un et 100 microlitres de RPMI 1640 tamponné. Milieu dans les puits des colonnes deux à onze. Effectuez une série de dilutions doubles sérielles en transférant 100 microlitres des solutions antifongiques à forte concentration des puits de la colonne un vers ceux de la colonne deux.Après avoir mélangé délicatement par aspiration et distribution, prélevez 100 microlitres des puits de la colonne deux et ajoutez-les dans ceux de la colonne trois, et ainsi de suite jusqu’à la colonne 10. N’ajoutez aucune solution antifongique dans la colonne 11, car elle servira de contrôle positif, et jetez les derniers 100 microlitres provenant des puits de la colonne 10. Tous les puits, sauf ceux de la colonne 12.Le volume final doit maintenant être de 100 microlitres. Couvrir la plaque, la sceller avec du parafilm et l'incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures afin de permettre aux antifongiques d'agir après l'incubation. Après avoir lavé la plaque trois fois dans du PBS comme décrit précédemment, ajouter 100 microlitres de solution XTT milieu par puits dans tous les puits, y compris les puits de contrôle négatif.Dans la colonne 12. Couvrez la plaque, enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, déballez la plaque pour permettre le développement de la couleur.La solution XTT initialement claire aura viré à l'orange après avoir été traitée par des cellules métaboliquement actives. Transférez 80 microlitres des surnageants colorés dans une nouvelle plaque de microtitration à fond plat. Utilisez un lecteur de plaque de microtitration colorimétrique réglé à une longueur d'onde de 490 nanomètres pour lire la plaque comme indiqué ici. En l'absence d'antifongiques, les mesures colorimétriques n'ont pas été traitées.Les biofilms des candidats SEA sur différentes lignes sont équivalents. Afin d'évaluer en premier lieu l'effet des composés antifongiques testés, soustraire la valeur moyenne du fond obtenu à partir des puits témoins négatifs de la colonne 12 de toutes les autres valeurs. Ensuite, calculer le pourcentage d'inhibition en utilisant les témoins positifs de la ligne 11.Les concentrations maximales, définies comme les concentrations d'agents antifongiques provoquant une diminution de 50 % ou 80 % des mesures colorimétriques, sont connues sous le nom de concentrations minimales inhibitrices de Cecil. Ces valeurs sont généralement utilisées comme mesure de référence de la puissance d'un composé. Grâce à cette méthode simple à haut débit, des biofilms fongiques peuvent être formés in vitro en 24 heures, et des composés sélectionnés peuvent être testés pour leur activité antifongique après leur développement initial.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la mycologie médicale pour explorer la formation de biofilms et examiner l'activité des agents antifongiques. Encore une fois, les cellules dans les biofilms.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Le test décrit un moyen rapide pour mesurer la formation de biofilm au début de bactéries et de champignons. Cette méthode utilise une plaque de microtitration comme substrat pour la formation de biofilms microbiens et le biofilm est visualisée en utilisant la souche de cristal violet. Le test fournit soit un test qualitatif ou quantitatif pour la formation de biofilm tôt.

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Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) pour criblage à haut débit des médicaments antifongiques

Cette vidéo présente un test in vitro pour cribler des composés antifongiques à l’aide d’un test de microdilution en bouillon. Les composés d’essai sont dilués en série dans une plaque de microtitration et incubés avec un inoculum fongique. Après l’incubation, la plaque est examinée à la recherche de puits sans croissance fongique visible afin d’évaluer le potentiel antifongique des composés d’essai et leur concentration minimale inhibitrice (CMI).

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Cette vidéo présente une technique in vitro pour étudier l’effet des anticorps sur les biofilms fongiques. Le champignon pathogène Candida tropicalis sécrète un facteur de virulence sécrété par l’aspartyl protéinase 2 (Sap2), facilitant la formation du biofilm. Lors de l’introduction d’un sérum inactivé par la chaleur contenant des anticorps spécifiques de Sap2 qui inhibent la maturation du biofilm, la viabilité des cellules fongiques est évaluée à l’aide d’un test chromogène.

Un test in vitro pour évaluer l’effet des anticorps sur le biofilm de Candida tropicalis

Nous présentons une procédure expérimentale de développement du biofilm de Candida albicans dans un modèle sous-cutané de souris. Les biofilms fongiques ont été quantifiés en déterminant le nombre d’unités formant des colonies et par une imagerie de bioluminescence non invasive, où la quantité de lumière produite correspond au nombre de cellules viables.

Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

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Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Une méthode de microdilution bouillon simple et adaptable pour le dépistage des substances antifongiques et extraits.

Bouillon Microdilution In Vitro Screening : une méthode simple et rapide pour détecter les nouveaux composés antifongiques

Nous présentons ici un protocole par étapes pour étudier la respiration mitochondriale et la fonction glycolytique chez Candida Albicans à l’aide d’un analyseur de flux supplémentaires.

Enquête bio-énergétique en temps réel à l’aide de Candida albicans analyse extracellulaire de Flux

Pour visualiser et quantifier les caractéristiques internes des biofilms Candida albicans, nous préparons des spécimens intacts fixes qui sont clarifiés par l’appariement des indices réfractifs. Ensuite, la microscopie de section optique peut être utilisée pour obtenir des données d’image tridimensionnelles bien que toute l’épaisseur du biofilm.

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Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir des données quantitatives sur l’activité antifongique de peptides et d’autres composés, tels que des agents antifongiques à petites molécules, contre Candida albicans. Son utilisation de la densité optique plutôt que de compter les unités formant colonie pour quantifier l’inhibition de la croissance permet d’économiser du temps et des ressources.

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Une plaque de microtitrage à 96 puits à base Méthode de formation suivi et les tests de sensibilité antifongique des Candida albicans Les biofilms (Vidéo) | JoVE Journal

Une plaque de microtitrage à 96 puits à base Méthode de formation suivi et les tests de sensibilité antifongique des Candida albicans Les biofilms

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