Name: Stratégie de transfection optimisés pour lexpression et lenregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Découvrez une méthode optimisée de transfection pour l'expression et l'enregistrement électrophysiologique de canaux ioniques voltage-dépendants recombinants dans les cellules HEK-293T.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de fonctionnement découverte à partir du JDS sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada, du CRSNG Alexander Graham Bell Canada Bourses d&#39;études supérieures (doctorat) (à A. Senatore) et la Fondation des maladies du cœur, Grant -in-aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

Etre capable d'enregistrer la cellule entière courants en utilisant les protocoles décrits et les solutions indique que la transfection a été un succès et que les canaux souhaités ioniques voltage-dépendants ou les complexes de canaux ioniques sont présents en quantités significatives à la membrane cellulaire. Si les cellules transfectées de façon positive (c.-vert fluorescent) mais pas les courants enregistrable, un délai supplémentaire à 28 ° C peut être nécessaire pour permettre la protéine du canal pour être convena...

<table border="1"><tr><td> Matériau </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP plasmidique </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Cercle de verre lamelles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Cercles n ° 1 - 0.13 à 0.17mm d&#39;épaisseur, Taille: 12mm </td></tr><tr><td> Amplificateur </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B ou 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Système d&#39;acquisition de données </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel d&#39;électrophysiologie </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Manipulateurs pipette </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé à épifluorescence </td><td> Zeiss Canada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Porte-électrode Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Détenteur de microélectrodes pour électrode de terre </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes capillaires électrophysiologie </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Verre borosilicate avec filament, OD 1.5mm, OD 0.86mm, 15cm de long </td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipette Puller </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette feu polisseuse </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Système de micro-perfusion de médicaments </td><td> AutoMate scientifique </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Système de perfusion de drogues </td><td> AutoMate scientifique </td><td> Valvelink8.2 Teflon vannes </td><td></td></tr></table>

stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au hek-293t

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

L&#39;expression in vitro et l&#39;enregistrement électrophysiologique de recombinaison canaux ioniques voltage-dépendants dans des cultures de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293T) est une stratégie de recherche omniprésent. HEK-293T doivent être plaqués sur des lamelles de verre à densité assez faible de sorte qu&#39;ils ne sont pas en contact les uns avec les autres afin de permettre l&#39;enregistrement électrophysiologique sans effets confondants dus au contact avec les cellules adjacentes. Transfectées canaux doivent aussi exprimer avec une grande efficacité à la membrane plasmique des cellules entières d&#39;enregistrement patch clamp des courants détectable au-dessus des niveaux de bruit. Canaux ioniques hétérologue exigent souvent longues périodes d&#39;incubation à 28 ° C après transfection afin de parvenir à l&#39;expression membranaire adéquat, mais il ya augmentation des pertes de cellules lamelle d&#39;adhérence et stabilité de la membrane à cette température. Pour contourner ce problème, nous avons développé une stratégie optimisée pour transfecter et la plaque HEK-293T. Cette méthode nécessite que les cellules transfectées soit à un confluence relativement élevés, et incubés à 28 ° C pendant différentes périodes d&#39;incubation post-transfection pour permettre l&#39;expression d&#39;ions suffisamment de protéines canal. Les cellules transfectées sont ensuite étalées sur des lamelles de verre et incubées à 37 ° C pendant plusieurs heures, ce qui permet la fixation des cellules rigides pour les lamelles et la restabilisation membrane. Les cellules peuvent être enregistrées peu après le placage, ou peuvent être transférées à 28 ° C pour incubation. Nous constatons que l&#39;incubation initiale à 28 ° C, après transfection, mais avant le placage, est la clé pour l&#39;expression efficace des canaux ioniques hétérologue qui normalement n&#39;expriment pas ainsi à la membrane plasmique. Positivement transfectées, les cellules cultivées sont identifiés par co-exprimé eGFP ou EGFP exprimée par un vecteur bicistronique (par exemple pIRES2-EGFP) contenant les ADNc recombinants canal ionique juste en amont d&#39;un site interne d&#39;entrée du ribosome et une séquence de codage eGFP. Cellules entières d&#39;enregistrement patch clamp nécessite un équipement spécialisé, plus la artisanat des électrodes d&#39;enregistrement poli et électrodes de masse en forme de L à partir de verre de borosilicate. La livraison de drogue à l&#39;étude de la pharmacologie des canaux ioniques peuvent être obtenus directement en micropipetage médicaments dans le plat d&#39;enregistrement, ou en utilisant microperfusion ou des systèmes à écoulement par gravité qui produisent des flux ininterrompu de solution médicamenteuse sur les cellules enregistrées.

Méthode fiable pour très efficace<em&gt; In vitro</em&gt; Expression et ultérieures enregistrement électrophysiologique de recombinaison canaux ioniques voltage-dépendants dans des cultures de cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293T).

Stratégie de transfection optimisés pour l&#39;expression et l&#39;enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

L'expression in vitro et l'enregistrement électrophysiologique de canaux ioniques voltage-dépendants recombinants dans des cellules embryonnaires de rein humain cultivées (HEK-293T) ...

L'électrophysiologie est couramment utilisée pour étudier l'activité de canaux ioniques voltage-dépendants recombinants dans des cellules rénales embryonnaires humaines en culture. Un enregistrement réussi nécessite que les cellules expriment les canaux à des niveaux suffisants au niveau de la membrane cellulaire pour permettre leur détection, et qu'elles soient ensemencées à une densité cellulaire suffisamment faible pour isoler des cellules individuelles. La réalisation d'enregistrements cellulaires est fréquemment entravée par les longues périodes d'incubation à 28 degrés Celsius nécessaires à cette expression, durant lesquelles on observe généralement une perte d'adhésion cellulaire et une instabilité membranaire.Ici, une méthode optimisée de culture cellulaire et de transfection est présentée, permettant de contourner ces problèmes. Les cellules sont transfectées à une confluence modérée, puis incubées à 28 degrés Celsius jusqu'à ce qu'une expression adéquate des canaux ioniques soit obtenue. Les cellules transfectées sont ensuite ensemencées sur des lamelles de verre à faible densité et incubées à 37 degrés Celsius pendant plusieurs heures afin de permettre l'attachement cell

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Décrit ici est un procédé d'obtention de longues étendues de l'enregistrement en cours d'un canal ionique avec la technique de patch-clamp cellule attachée. Cette méthode permet d'observer, en temps réel, le modèle de conformations ouverture-fermeture de canal qui sous-tendent le signal biologique. Ces données renseignent sur les propriétés du canal dans les membranes biologiques intactes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

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Expression de protéines recombinantes pour la Biologie Structurale HEK 293F cellules en suspension: une approche nouvelle et accessible

Une méthode d’imagerie des changements de potentiel membranaire à l’aide d’indicateurs de tension génétiquement codés est décrite.

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La production à l’échelle du laboratoire de protéines eucaryotes avec une modification post-traductionnelle appropriée représente un obstacle important. Voici un protocole robuste avec une mise en place et un délai d’exécution rapides pour l’expression de protéines à l’aide d’un système d’expression de mammifères. Ce système prend en charge le marquage sélectif des acides aminés, le marquage sélectif des protéines et les modulateurs de petites molécules de la composition des glycanes.

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

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Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.

Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)

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Surveillance des changements induits par l’électroporation dans la génération de potentiel d’action dans les cellules HEK à pointes Tet-On génétiquement modifiées

Découvrez une méthode optimisée de transfection pour l'expression et l'enregistrement électrophysiologique de canaux ioniques voltage-dépendants recombinants dans les cellules HEK-293T.

Stratégie de transfection optimisés pour lexpression et lenregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T (Vidéo) | JoVE Journal

Stratégie de transfection optimisés pour l'expression et l'enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

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