Stratégie de transfection optimisés pour l'expression et l'enregistrement électrophysiologique des recombinants canaux ioniques voltage-dépendants présents au HEK-293T

L’électrophysiologie est couramment utilisée pour étudier l’activité des canaux ioniques voltage-dépendants recombinants dans des cellules rénales embryonnaires humaines en culture. Pour réussir l’enregistrement, il faut que les cellules expriment des canaux à des niveaux suffisants au niveau de la membrane cellulaire pour la détection et que les cellules soient plaquées à une densité cellulaire suffisamment faible pour l’isolement des cellules individuelles. La réalisation d’enregistrements cellulaires est souvent entravée par les longues périodes d’incubation à 28 degrés Celsius nécessaires à une telle expression, où il y a généralement une perte d’adhésion cellulaire et de stabilité membranaire.

Ici, une méthode optimisée pour la culture cellulaire et la transfection est démontrée qui contourne ces problèmes. Les cellules sont transfectées à une fluidité modérée, puis incubées à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que l’expression adéquate des canaux ioniques soit atteinte. Les cellules transfectées sont ensuite plaquées sur des lamelles de verre à faible densité et incubées à 37 degrés Celsius pendant plusieurs heures pour permettre la fixation des cellules et la stabilisation de la membrane.

Une fois plaquées de manière appropriée, les cellules sont identifiées par EGFP co-exprimé et par patch clamp de cellules entières. L’enregistrement peut être effectué ou les cellules peuvent être à nouveau incubées à 28 degrés Celsius. Pour augmenter encore l’expression de surface des canaux, les résultats d’expériences d’enregistrement sur des cellules transfectées avec des canaux calciques voltage-dépendants, tels que L CAV un, L CAV deux ou L cav trois, indiquent que les canaux ont été transfectés avec succès et exprimés par les cellules.

Bien que seuls des résultats représentatifs pour L CAV 3 soient présentés, dans notre laboratoire, nous avons développé une méthode pour améliorer l’expression des gènes de canaux ioniques peu exprimés pour l’enregistrement par patch clamp dans des lignées cellulaires humaines. Aujourd’hui, l’approche conventionnelle consiste à diviser d’abord les cellules sur les lamelles et à les transfecter avec des ADNC plasmatiques contenant les gènes des canaux ioniques, puis à les incuber pendant plusieurs jours à 28 degrés Celsius afin d’obtenir une expression efficace des canaux ioniques avant l’enregistrement électrophysiologique. Notre nouvelle approche réduit considérablement le temps d’incubation requis à 28 degrés Celsius avant l’enregistrement.

Maintenant, en diminuant le temps d’incubation de 28 degrés, nous constatons que les membranes cellulaires sont beaucoup plus stables et que les cellules transfectées adhèrent beaucoup plus aux lamelles. Cela augmente le nombre de cellules enregistrables et rend l’expérimentation considérablement plus efficace. Avant la transfection, divisez un flacon entièrement confluent de cellules HEK 2, 9 à 3 T, un à quatre dans un nouveau ballon de 25 centimètres carrés et placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone.

Laissez les cellules se fixer pendant trois à quatre heures après quatre heures, examinez les cellules par contraste d’interférence différentielle pour vérifier l’attachement. Notez que les cellules ne regardent plus autour d’elles et s’aplatissent. Des extensions ou pseudopodes sont visibles.

Moins de cellules de confluence se ressembleraient mais seraient plus espacées. Une fois les cellules fixées, combinez les réactifs nécessaires pour effectuer une transfection standard de phosphate de calcium. Préparez un total de 12 microgrammes d’ADN dans 600 microlitres de solution de transfection par flacon.

Ici, les CDNA de divers canaux ioniques sont clonés dans le plasmide P-I-R-E-S deux EGFP Transfection de ce vecteur d’expression dans une lignée cellulaire de mammifère. Aboutit à la production d’une protéine fluorescente verte améliorée à partir du même ARNm que l’insert cloné par traduction initiée à un site d’entrée interne du ribosome juste en aval de la séquence de revêtement du canal ionique et en amont de la séquence de revêtement EGFP. Cela permet d’identifier les cellules transfectées positivement sans interférence possible dans la fonction protéique qui peut être causée par la fusion directe de la protéine EGFP avec la protéine d’intérêt.

Pipetez la solution de transfection sur les cellules goutte à goutte, puis faites tourner doucement le flacon et placez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit du lendemain. Vérifiez l’efficacité de la transfection en observant les cellules au microscope à fluorescence. Les cellules transfectées positivement doivent apparaître vertes dans toute la cellule.

Une fois la transfection vérifiée, pipeter soigneusement quatre à cinq millilitres de milieu chaud dans la fiole inversée. Lavez les cellules en retournant lentement le ballon de manière à ce que la surface des cellules soit vers le bas et en basculant le ballon de sorte que la solution de lavage se déplace doucement sur eux. Retirez le milieu et répétez ce lavage.

Pas deux fois de plus. Ajoutez ensuite six millilitres de milieu dans le ballon et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures. L’expression des canaux ioniques des invertébrés présente certains défis.

Tout d’abord, ils sont souvent de grande taille et peuvent donc prendre beaucoup de temps à se traduire au niveau du réticulum endoplasmique. De plus, ils peuvent ne pas être efficacement ciblés sur la membrane cellulaire d’une lignée cellulaire de mammifère. Enfin, étant donné que différentes espèces présentent des fréquences d’utilisation des codons différentes, les ADNC hétérologues peuvent héberger des fréquences élevées de codons qui sont rares dans les cellules de mammifères telles que HEK 2 9 3 T pour surmonter certaines de ces difficultés.

Après l’incubation de deux heures à 37 degrés Celsius après le lavage parfait, transférez les flacons dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant deux à six jours pour prolonger la période d’expression. Le temps d’incubation doit être déterminé empiriquement pour chaque type de canal ionique exprimé. Étant donné que l’incubation à 28 degrés Celsius pendant des périodes prolongées entraîne un détachement cellulaire et une mauvaise stabilité de la membrane.

Une préparation cellulaire supplémentaire est nécessaire avant d’effectuer des études électrophysiologiques. Tout d’abord, retirez le milieu des cellules transfectées à l’aide d’une pipette d’aspiration d’un millilitre de solution de trypsine à 37 degrés Celsius dans une fiole inversée. Ensuite, remettez doucement le ballon à la surface de la cellule en position basse pour permettre à la trypsine de couler doucement sur les cellules.

Remettez la fiole sur elle et retirez la trypsine. Ajoutez ensuite 250 microlitres de trypsine chaude directement sur les cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent. Pendant ce temps, placez trois à huit glissières de couverture enduites de lysine poly L dans une boîte de culture de 60 millimètres et ajoutez cinq millilitres de milieu de culture chaud.

Une fois que les cellules se sont détachées, suspendez-les dans quatre millilitres de milieu chaud en pipetant de haut en bas environ six fois puis, à l’aide de la pointe de la micro-pipette, appuyez sur les lamelles pour vous assurer qu’elles sont au fond de la boîte. Ajoutez ensuite 250 à 500 microlitres de cellules remises en suspension. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois heures pour leur permettre d’adhérer aux lamelles.

Laisser les cellules trop longtemps à 37 degrés entraînera la division cellulaire et la dilution des plasmides transfectés. Les cellules transfectées doivent être plaquées à une densité suffisamment faible pour qu’elles soient isolées les unes des autres, comme indiqué ici. Cela facilitera l’enregistrement électrophysiologique.

Pour les cellules qui nécessitent des sous-unités accessoires, il est souvent nécessaire de transférer les cellules à 28 degrés Celsius et de les incuber pendant trois à quatre jours supplémentaires avant l’électrophysiologie. L’enregistrement est effectué pour les cellules qui ne nécessitent pas de sous-unités accessoires. L’enregistrement peut être effectué immédiatement après cette incubation.

Le banc d’électrophysiologie utilisé ici comprend un amplificateur, des manipulateurs à double pipette motorisés, un microscope à épifluorescence et des systèmes de perfusion. L’équipement a été monté sur une table d’isolation des vibrations et parasite. Le bruit électrique est limité par une cage de ferrett de 40 pouces de haut, de type deux systèmes de contrôle électronique, y compris un PC équipé d’un fichier de données 1440, une interface de convertisseur analogique-numérique en conjonction avec le logiciel P clamp 10.1.

L’amplificateur de l’écran d’ordinateur, le manipulateur motorisé et un système de contrôle de la profusion par liaison de soupape sont tous montés à l’extérieur de la cage de Faraday. Sur un rack électrique métallique autonome de 19 pouces, tout l’équipement électrique est mis à la terre sur un distributeur en cuivre et branché sur un transformateur d’isolement de qualité médicale, qui fournit une isolation de ligne, une mise à la terre constante et une suppression des surtensions. Préparez-vous aux expériences en montant des micro-pipettes polies au feu d’une résistance de deux à cinq méga ohms sur le support de micro-pipette sur l’étage de tête.

Les pipettes patch sont remplies d’une solution interne pour éliminer les bulles d’air et enfin montées sur la scène de tête. Ensuite, à l’aide d’une pince, transférez une lamelle avec des cellules plaquées dans une boîte de Pétri en plastique de 35 millimètres contenant trois millilitres de solution d’enregistrement externe à température ambiante. Le volume de la solution d’enregistrement doit être mesuré avec précision lors de la réalisation d’expériences sur les médicaments au cours desquelles des quantités connues de médicament sont ajoutées à la boîte avec une micro-pipette, placez la boîte sur la platine du microscope.

Remplissez ensuite une demi-cellule porte-micro-électrode avec trois molaires de chlorure de césium. Insérez ensuite l’électrode de référence dans la demi-cellule et placez l’électrode de terre dans le bain à l’aide du manipulateur microm, abaissez la pipette patch dans la solution de bain. Visualisez les cellules en mode fluorescence et centrez une cellule verte adhérente isolée et transfectée positivement au milieu du champ de vision.

En mode bain, placez la pipette patch à proximité de la cellule. Mettez à zéro la trace d’onde carrée observée sur l’écran de l’ordinateur. Ajustez la position de la pipette patch de sorte qu’elle touche juste la cellule et que la trace de courant carrée sur l’écran commence à fluctuer.

Appliquez une aspiration douce avec une seringue attachée jusqu’à ce qu’un joint giga ohm se forme. Une fois qu’une étanchéité giga ohm est obtenue, passez le programme en mode patch. Appliquez une impulsion rapide d’aspiration avec la seringue afin de percer la membrane cellulaire.

Passez ensuite en mode cellule et utilisez les paramètres de la cellule entière sur l’amplificateur. Pour compenser les transitoires capacitifs, il est nécessaire d’équilibrer le patch de sorte que la solution d’enregistrement intracellulaire se dialyse dans la cellule patchée. Entrez les protocoles de pince de tension écrits pour cette expérience ici.

L’expérimentateur a conçu un protocole pour mesurer les courants ioniques à travers les canaux ioniques voltage-dépendants qui résultent de la modulation de la tension à travers la membrane cellulaire. Dans ce cas, il s’agit d’un protocole IV qui spécifie que le logiciel maintient la cellule à moins 110 millivolts, puis SEP à moins 70 millivolts pendant 250 millisecondes. Puis redescendez à moins 110 millivolts de potentiel de maintien chaque fois que le pas augmente de 10 millivolts, de sorte que les pas sont à moins 70 millivolts, moins 60 millivolts, et ainsi de suite, jusqu’à ce que le dernier pas soit à plus 20 millivolts.

Filtrer les courants enregistrés à 10 kilohertz à l’aide d’un filtre Lowpass Bessel sur l’amplificateur et numériser à une fréquence d’échantillonnage de deux kilohertz à l’aide du logiciel clamp X 10.1 n’utiliser que des enregistrements avec une fuite minimale inférieure à 10 %Pour l’analyse, les lymphocytes T HEK 2 93 ont été cultivés et transfectés avec L Cav. Trois canaux calciques comme illustré ici. La transfection réussie des CDNA à canaux ioniques hétérologues a été indiquée par la fluorescence générée à partir du vecteur P-I-R-E-S deux eeg FP

Ici, nous montrons l’expression réussie d’un canal calcique à trois tensions chez les invertébrés. Lorsque les cellules ne sont pas transfectées, aucun courant de calcium ne peut être déclenché. Alors que les cellules transfectées génèrent des courants importants lorsque des protocoles de pince de tension de cellule entière sont appliqués aux cellules.

Les expérimentateurs peuvent utiliser diverses conditions électrophysiologiques et des régimes d’analyse de données en fonction de leurs besoins. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser votre propre jugement concernant le calendrier des expériences. Étant donné que différents canaux s’expriment avec des efficacités différentes au niveau de la membrane cellulaire, c’est à vous de déterminer la stratégie optimale à utiliser pour augmenter la viabilité des cellules et maximiser l’expression de surface des canaux qui vous intéressent.

Après avoir regardé cette vidéo, nous espérons que vous avez acquis une bonne compréhension de la façon de cultiver et de maintenir une lignée cellulaire humaine, ainsi que de la façon de transfecter des CDNA de canaux ioniques hétérologues et des CDNA sous-unitaires dans ces cellules. Pour l’enregistrement électrophysiologique.