Name: Imagerie en temps réel des leucotriènes B 4 Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel de la migration cellulaire médiée par le leucotriène B4 et les interactions BLT1-β-arrestine. Cette méthode révèle les mécanismes de chimiotaxie des leucocytes et de signalisation des récepteurs couplés aux protéines G.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La recherche est soutenue par National Institutes of Health subventions AI-52381, CA138623 et le Kentucky Lung Cancer Research Board et l&#39;appui institutionnel de James Graham Brown Cancer Center.

Méthodologie Description du microscope En direct des expériences d'imagerie cellulaire réalisée à l'aide de TE-FM épifluorescence système attaché à Nikon Eclipse TE300 microscope inversé. Le microscope équipé d'étape de chauffage. Une fraîche pression HQ numériques CCD N / B (Roper Scientific) caméra et LAMDA 10-2 filtre optique changeur (fabricant de l'appareil Sutter) est attaché à microscope. Longueurs d'onde d'excitation et d'émission sont contrôlés avec des roues de filtre et contrôlé par Lamba 10-2 contrôleur de roue à filtres, Sutter Instruments Co. Temps d'exposition de 500 ms devrait être suffisant pour voir DP ou GFP dans les cellules vivantes. Le contrôle du matériel et l'acquisition d'images sont contrôlés par le logiciel Metamorph. Le choix des filtres pour la présente étude sont, filtre fixe S480/20x, S525/40m et S565/25x, S620/60m pour la GFP et DP, respectivement; EGFP / DsRed dual dichroïque, technologie Chroma. Cette roue à filtres peut accueillir jusqu'à six ensembles de filtres. Microscope est attaché avec contrôleur étape préalable Proscan avec joystick. Tous ces attachements matériels peuvent être contrôlés par le logiciel Metamorph. Le microscope est également jointe avec Micromanipulateurs pour tenir le micropipettes. A. Mesure des leucotriènes B 4 migration dirigée des cellules dendritiques Utilisation de la mise en microscopie décrites ci-dessus, nous avons développé des méthodes pour la suite ligand migration dirigée des cellules dendritiques en temps réel. Deux micromanipulateurs (Narishige) sont attachés à la loupe. Le chimiotactisme de la moelle osseuse de souris des cellules dendritiques dérivées (BMDCs) vers LTB 4 gradient a été enregistré. Ici, nous décrivons les méthodes pour préparer le micro-pipettes utilisant des micro-pipette extracteur, le chargement du ligand dans les micro-pipette et la mise en place de l'expérience chimiotactisme sur la scène chauffée du microscope pour contrôler la migration directionnelle des cellules. Cette méthode peut être appliquée pour tester l'efficacité des chimiotactiques distinctes dans l'induction de la migration ainsi que l'effet des inhibiteurs de la chimiotaxie des cellules vivantes. L'isolement des BMDCs 21 de la souris a été décrit dans plusieurs publications dont JoVE 22. 1. Préparation de BMDCs <ol><li> Plate BMDCs (après culture pendant 10 jours) sur le plat lamelle Fluoro bas et leur permettre de croître pendant 16 heures d'avance sur l'expérience. </li><li> Laver les cellules avec 3 mL de PBS 1X au moins 2 fois (en ajoutant 3 ml de PBS 1X à la plaque et l'aspiration de la sortie du tampon). </li><li> Ajouter 2 mL de 1XPBS à l'assiette. Les cellules sont maintenant prêts pour l'expérience. Gardez les cellules de 37 ° C avant d'incubateur d'expérience. </li></ol> Préparation du ligand chargés micro pipette: <ol start="4"><li> Fixer les tubes capillaires en verre (verre standard, 0,75 mm x 0,4 mm; 6 ", Cat # 625500, AM Systems, Inc) sur la verticale extracteur micropipette (Narishige International USA, Inc.) </li><li> Maintenir la température à 52 ° C et laisser le verre pour faire fondre et séparer pour former des conseils tranchant. </li><li> Fixer la pipette sur le support micro-pipette. </li><li> Lisse les aspérités de la pipette à l'aide de micro Micro forger M-900 (Narishige International USA, Inc) en regardant sous le microscope. </li><li> Préparer au moins 10-20 pipettes pour chaque expérience. Remarque: Les micropipettes peuvent également être achetés à partir d'instruments de précision du monde (TIP μ, T1801TW1F). </li><li> Prenez concentration souhaitée (500 uL de 100 nM LTB 4 dans l'expérience actuelle) du ligand dans 1 ml effendorf tube et conserver la pointe de la pipette de micro dans la solution et permettre à la solution d'entrer dans la pipette de micro (remblayage). </li><li> Prélever 1 ml de ligand et dans la seringue (1 cc de tuberculine seringue) lentement et remplissez le ligand à l'aide de micro-aiguilles Remplir (MF 28G-5, Instruments de précision mondiale) dans la pipette de micro, de haut. </li><li> Fixez le tuyau, ce qui correspond étroitement à la pipette à la pipette et le tube de l'aiguille (21 G 11 / 2) attaché à seringue de 1 mL, qui est rempli avec le ligand. </li><li> Maintenant, déplacez le ligand attentivement remplie de micro-pipette à la platine du microscope et de fixer sur des micro manipulateurs. </li><li> Appliquer peu de pression de la seringue pour faire ligand sûr, c'est libérant lentement de la pointe. </li><li> Amener le BMDCs plaqués immatures au microscope et de les garder sur la plaque chauffée (37 ° C) étape. </li><li> Retirez le couvercle du plat fluorées. </li><li> Concentrer les cellules en utilisant l'huile à immersion lentille d'objectif 60X. </li><li> Soigneusement, faire tomber le ligand chargés pipette à l'aide «grossier manipulateur manuel MN-188NE 'à la proximité des cellules. </li><li> Concentrer l'aide de la pipette »micromanipulateur hydraulique Beaux-MN-188 NE». </li><li> Appliquer peu de pression de la seringue pour s'assurer que ligand est la libération dans le plat. </li><li> Définissez les paramètres d'acquisition d'image à acquérir dans les brillantes déposée (exposition de 10 ms) dans toutes les 15 secondes pendant 2 heures en utilisant le logiciel Metamorph. </li><li> Gardez surveillance toutes les 30 min pour la progression de migration vers le ligand. </li><li> Si les cellules sont surpeuplées à l'extrémité de la pipette, changer l'emplacement de l'extrémité de la plaque pour continuer la migration de l'expérimentation. </li></ol> B. Mesure GPCR (BLT1) et protéine cytosolique (β-arrestine) Interactions, la translocation dans les cellules vivantes 1. Préparation de constructions d'ADN plasmidique Les détails de constructions d'ADN plasmidique ont été décrites dans Jala et al. (2005) 18. 2. La transfection de l'homme BLT1-DP et β-arrestines-GFP dans les cellules RBL-2H3 <ol><li> Maintenir le Rat basophiles Leukomia (RBL-2H3) Cellules (60 à 70% de confluence) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 95% d'air, 5% de CO 2 en tant que cultures monocouches dans un milieu de croissance (DMEM supplémenté avec 15% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine) dans des flacons T75. </li><li> Détacher les cellules de la boîte / flacons en utilisant 6 ml de trypsine-EDTA (0,05% de trypsine, 0,53 mM EDTA) et incubation pendant 5 min à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 95% d'air, 5% de CO 2. Secouez doucement les flacons de surveiller l'ampleur de détachement des cellules. </li><li> Ajouter 6 mL de milieu de croissance au flacon contenant 6 ml de trypsine-EDTA et recueillir les cellules en les mélangeant par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Transférer les cellules dans des tubes de 15 ml Falcon. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et prendre 4 x 10 6 cellules dans 15 tubes à centrifuger ml et centrifuger à 480g rpm pendant 3 minutes et de remettre en suspension dans 200 uL de médias de transfection (DMEM, 20% de FBS, HEPES 50 mM). Si vous prévoyez d'effectuer trois transfections, préparer les cellules et les médias transfection en conséquence par le nombre de cellules augmente et le volume du milieu de transfection. </li><li> Préparer les plasmides transfectés à des concentrations d'au moins 1,5 ug / uL. Nous préparons l'ADN plasmidique en utilisant l'ADN plasmidique Maxi kit QIAGEN. Ajouter l'individu ou les deux ADN plasmide codant pour l'homme BLT1-DP (25 ug) et β-arrestin1-GFP (15 ug) de cuves d'électrophorèse stérile, (Bio-Rad # 16552088), qui a 0,4 cm écartement des électrodes. </li><li> Prenez 200 ul de cellules en suspension au-dessus et de les placer dans des cuvettes contenant soit hBLT1-DP ou β-arrestin1-GFP ou les deux ensemble et les mélanger délicatement avec une pipette stérile mL. </li><li> Laisser les cuvettes ci-dessus à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Électroporation dans les cellules Gene Pulser II avec une tension de 250 V et la capacité de 500 pF. </li><li> Après électroporation laisser les cellules restent à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Prélever 1 ml de milieu de croissance régulière et le mélanger avec des cellules par électroporation dans les cuvettes. </li><li> Distribuer 300 uL de ce mélange dans des boîtes de 35 mm de tissu de verre culture sur le fond (plat fluoro, Instruments de précision mondiale) contenant 2 mL de milieu de croissance régulière et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 95% d'air, 5% de CO 2. Laisser les cellules adhèrent au fond du plat. </li><li> Remplacez le support après 1 h d'incubation avec une croissance régulière des médias et leur permettre de croître à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 95% d'air, 5% de CO 2 incubateur pendant 18-24 heures. </li></ol> 3. Imagerie de cellules vivantes Acquisition d'images <ol><li> Après 18-24 heures, laver les cellules 2 ou 3 fois avec 2 ml d'eau tiède rouge de phénol contenant du RPMI sans HEPES 10 mM, pH 7,55 (Ajouter 2 mL de milieu chaud directement à l'assiette et les médias aspirer. Répétez 2 ou 3 fois). Ajouter 1,8 ml de phénol chaude RPMI rouges gratuite contenant 10 mM HEPES. </li><li> Placer 30 mm plats en verre à fond la culture lamelle contenant cellules RBL-2H3, transfectées avec hBLT1-DP et β-arrestin1-GFP sur la platine du microscope chauffée (37 ° C). </li><li> Recueillir les images à un grossissement de 600x cellulaire utilisant 60 x Objectif Nikon plan Apo 60X/1.4 lentilles numériques d'immersion d'ouverture d'huile (disponible dans notre système de microscope). </li><li> Mettez une goutte d'huile sur la lentille 60 x objectif et de concentrer les cellules avec le champ lumineux régulier lumière transmise en touchant le fond de la plaque. </li><li> Pour surveiller la fluorescence des protéines transfectées, passer de champ lumineux (lumière transmise) à la fluorescence de filtre (DP filtre, si vous voulez voir des récepteurs ou GFP, si vous voulez voir β-arrestin1). </li><li> Choisissez la cellule brillant et sain, qui exprime hBLT1-DP sur la surface de la cellule en utilisant DP filtre et capturer l'image. </li><li> Puis passage à la GFP de filtre et de s'assurer que β-arrestine-GFP exprimée dans le cytoplasme et capturer l'image. Puis pseudo couleur à la fois les images, avant que le temps écoulé capturer des images de cellules vivantes pour s'assurer que saigner à travers de la fluorescence n'est pas en prenant survenant entre DP et GFP. </li><li> Une fois le choix de votre cellule fait, définissez les paramètres en fonction de votre objectif en utilisant un logiciel (Software Metamorph dans ce cas). </li><li> Dans la démonstration actuelle, seize images bits sont acquises avec la venuemis en binning ra à 1 X 1 combiné avec l'objectif 60 du Plan X Nikon Apo 60X/1.4 lentilles numériques d'immersion d'ouverture de pétrole. </li><li> Recueillir les images de fluorescence pour DP et fluorochromes GFP simultanément à 30 intervalle de temps sec (si les interactions translocation / sont trop rapides, on peut réduire les intervalles de temps) de ces roues en utilisant un filtre contrôlé par un logiciel Metamorph. </li><li> Le temps d'exposition Appareil photo réglé à 1000 ms pour DP et GFP. (Réglez le temps d'exposition spécifique en fonction de l'intensité de fluorescence de DP et GFP). </li><li> D'abord recueillir les images pendant 1 min sans ligand ajoutant, qui sert de point 0 fois. </li><li> Ajoutez les 200 uL de ligand (en stock de 10 uM à une concentration finale de 1 uM) après 1 min sans déranger la plaque / ou position de la cellule. </li><li> Les images de fluorescence sont recueillies pendant 60 min après l'ajout du ligand et stocké sous forme d'images TIFF avec l'ordre croissant des noms de fichiers. </li><li> Tous ces fichiers peuvent être faites sous forme de fichiers individuels avec pile / combiné des images de fluorescence avec des timbres de temps en utilisant le logiciel. </li></ol> Processus d'images et de quantification de la fluorescence des protéines et la localisation <ol><li> Acquérir les images avec support ordinaire (sans cellules) avec filtres DP et GFP fluorescentes et les enregistrer comme images de fond. Utilisez ces images pour soustraire à partir d'images données réelles obtenues ci-dessus. </li><li> Préparer la pile d'images individuellement pour les images DDP et GFP. </li><li> Sélectionner / définir les différentes régions (surface vs cytosolique) pour mesurer l'intensité de fluorescence de la DP et la GFP (BLT1 et β-arrestine translocation) </li><li> Tracer les intensités de fluorescence selon le montant qu'il en fonction du temps. Ce graphique va fournir les informations sur la cinétique de la translocation de la molécule donnée. </li></ol> Les résultats représentatifs A. Mesure des leucotriènes B 4 migration dirigée des cellules dendritiques La méthode décrite dans ce protocole a été utilisé pour déterminer la migration des cellules dendritiques vers leucotriène B 4 (figure 1 et vidéo ci-jointe 1) 21. Nous pouvons appliquer la même méthodologie pour déterminer la capacité chimiotactique de cellules à un ligand particulier dans les cellules vivantes. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Moelle osseuse de la souris dérivées de migration des cellules dendritiques vers 100 nM LTB 4. Vidéo 1. Direct la migration cellulaire des BMDCs vers LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Boddulrui_Video1.AVI">Cliquez ici pour voir la vidéo</a> . B. Mesure GPCR (BLT1) et protéine cytosolique (β-arrestine) Interactions, la translocation dans les cellules vivantes A l'issue de cette procédure, on peut obtenir les informations suivantes dans les événements signalisation des RCPG. <ol class="lroman"><li> La localisation des RCPG et protéines cytosoliques et le noyau (figure 2). </li><li> Interaction ligand induit de la surface de GPCR (BLT1 dans ce cas) avec des protéines cytosoliques (β-arrestine dans ce cas) (figure 3). </li><li> Cinétique de l'internalisation du récepteur et la β-arrestine translocation vers la membrane suivie d'une internalisation long avec des récepteurs (figure 4) (Jala et al. 2005) 18. </li><li> On peut déterminer le statut de dépendance ligand activation du récepteur dans des cellules vivantes (ci-joint la vidéo 2) et de déterminer les motifs critiques ou processus impliqués dans l'activation du récepteur (Jala et al. 2005) 18. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Expression de BLT1-DP (A), β-arrestine-GFP (B), pNuc-PCP (C) dans les cellules RBL-2H3. Image couleur combinée montré dans le panneau D. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Translocation induite Ligand des récepteurs β-arrestine et. Ligne de balayage des intensités de fluorescence dans les cellules sont représentées. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Cinétique de l'internalisation du récepteur et la β-arrestine translocation lors de l'addition de 1 uM LTB 4. Les intensités de fluorescence ont été mesurées en fonction du temps à la membrane et les lieux cytosolique de la cellule. Vidéo 2 d'imagerie en direct de cellules exprimant BLT1-DP et β-arrestine-GFP à l'addition de 1 uM LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Bodduluri_Video2.AVI">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a>

<ol><li>Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein-coupled+receptors%3A+molecular+mechanisms+involved+in+receptor+activation+and+selectivity+of+G-protein+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition.</a> FASEB J. 11, 346-354 (1997).</li>
<li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).</li>
<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Lefkowitz, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptors.+III.+New+roles+for+receptor+kinases+and+beta-arrestins+in+receptor+signaling+and+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization.</a> J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).</li>
<li>Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+roles+of+beta-arrestins+in+the+regulation+of+seven-membrane-spanning+receptor+trafficking+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling.</a> Biochem J. 375, 503-515 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrest%09or%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta-arrest	or.</a> Nature. 383, 447-450 (1996).</li>
<li>Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+mediator+networks+in+cell+signaling%3A+update+and+impact+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines.</a> Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).</li>
<li>Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT1+and+BLT2%3A+the+leukotriene+B%284%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Leukot+Essent+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors.</a> Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).</li>
<li>Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukotriene+B4+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Leukotriene B4 receptors.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).</li>
<li>Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+leukotriene+B%284%29+receptor+in+mice+reveals+its+role+in+inflammation+and+platelet-activating+factor-induced+anaphylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis.</a> J Exp Med. 192, 433-438 (2000).</li>
<li>Subbarao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+leukotriene+B4+receptors+in+the+development+of+atherosclerosis%3A+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).</li>
<li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukotrienes+and+atherosclerosis%3A+new+roles+for+old+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators.</a> Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).</li>
<li>Heller, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+atherogenesis+in+BLT1-deficient+mice+reveals+a+role+for+LTB4+and+BLT1+in+smooth+muscle+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment.</a> Circulation. 112, 578-586 (2005).</li>
<li>Miyahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+leukotriene+B4+receptor+1+in+allergen-induced+airway+hyperresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).</li>
<li>Terawaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+leukotriene+B4+receptor+1+confers+resistance+to+airway+hyperresponsiveness+and+Th2-type+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses.</a> J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).</li>
<li>Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+leukotriene+B4+receptors+BLT1+and+BLT2%3A+a+critical+role+for+BLT1+in+collagen-induced+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice.</a> J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).</li>
<li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J Exp Med. 203, 829-835 (2006).</li>
<li>Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-independent+beta-arrestin+translocation+and+internalization+of+leukotriene+B4+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors.</a> J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).</li>
<li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells.</a> Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).</li>
<li>Del Prete, A., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+and+adaptive+immune+response+by+leukotriene+B4+receptors%3A+a+role+for+LTB4+in+up-regulation+of+CCR7+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function.</a> Blood. 109, 626-631 (2007).</li>
<li>Salogni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+A+induces+dendritic+cell+migration+through+the+polarized+release+of+CXC+chemokine+ligands+12+and+14%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14.</a> Blood. 113, 5848-5856 (2009).</li>
<li>Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+myeloid+dendritic+cells+from+bone+marrow+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Imagerie des cellules vivantes est un outil puissant pour démontrer les fonctions et les interactions des protéines spécifiques comme ils se produisent en temps réel. Les méthodes décrites dans ce manuscrit montrent clairement que LTB 4 peut induire une migration rapide des cellules dendritiques. Ces méthodes, non seulement d&#39;élargir les aspects de LTB 4 fonction des types cellulaires variés, ils permettent des méthodes similaires pour être appliquée à une variété d&#39;autres chimiokines et de...

<table><tbody><tr><td>Ligne cellulaire de leucémie basophile du rat (RBL-2H3) ou cellules HEK293.</td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td></td></tr><tr><td>Delbecco&amp;rsquo;s modifié de Eagle&amp;rsquo;s Milieu (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ou DMEM sans rouge de phénol</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine (10000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,05 % (1X) avec EDTA 4Na, liquide</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Plaques Fluoro à fond en verre stériles de 35 mm (épaisseur 0,17 mm) (WillCo-dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette stérile pour électroporateur (écartement des électrodes de 0,4 cm) (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>16552088</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II électroporateur </td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d'épi-fluorescence TE-FM associé à un microscope inversé Nikon Eclipse TE300</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Metamorph</td><td>Imagerie universelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetteuse verticale</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Forge M-900</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur hydraulique MO-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur manuel grossier, MN-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;fort&gt;Constructions d'ADNc :&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADNc du récepteur couplé aux protéines G marqué par une protéine fluorescente rouge à l'extrémité C-terminale (hBLT1-RFP)</td><td>Jala et al. 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ADNc d'une protéine cytosolique marquée avec GFP (&amp;#946;-arrêtin1-GFP dans la présente étude)</td><td>Jala et al. 2005</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie en temps réel des leucotriènes b 4</submigration> cell mediated et blt1 interactions avec β-arrestine

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) appartiennent à la famille de sept transmembranaire de protéines et de médiation de la transduction des signaux extracellulaires à des réponses intracellulaires. RCPG de contrôle diverses fonctions biologiques telles que le chimiotactisme, la libération de calcium intracellulaire, la régulation des gènes d&#39;une manière dépendante du ligand via protéines G hétérotrimériques 1-2. Liaison du ligand induit une série de changements conformationnels conduisant à l&#39;activation des protéines G hétérotrimériques qui modulent les niveaux de seconds messagers tels que l&#39;adénosine monophosphate cyclique (AMPc), inositol triphosphate (IP3) et du glycérol diacyle (DG). Concomitante avec l&#39;activation de la liaison d&#39;un ligand du récepteur initie également une série d&#39;événements afin d&#39;atténuer le récepteur signalisation via la désensibilisation, la séquestration et / ou l&#39;internalisation. Le processus de désensibilisation des RCPG se fait via la phosphorylation du récepteur par des kinases des récepteurs aux protéines G (GRK) et se fixer des β-arrestines 3. β-arrestines sont des protéines cytosoliques et la translocation de la membrane lors de l&#39;activation de GPCR, la liaison aux récepteurs phosphorylés (la plupart des cas), il en facilitant 4-6 internalisation du récepteur. Leucotriènes B 4 (LTB 4) est une molécule lipidique pro-inflammatoire dérivé de l&#39;acide arachidonique et voie médie ses actions via les RCPG, LTB 4 récepteurs 1 (BLT1; un récepteur de haute affinité) et LTB 4 receptor 2 (BLT2; un récepteur à faible affinité ) 7-9. Le LTB 4-BLT1 voie a été montré pour être critique dans plusieurs maladies inflammatoires, notamment, l&#39;asthme, l&#39;arthrite et l&#39;athérosclérose 10-17. Le présent document décrit les méthodologies développées pour surveiller LTB4 induite par la migration des leucocytes et les interactions des β-BLT1 avec arrestine et la translocation des récepteurs dans les cellules vivantes en utilisant des techniques d&#39;imagerie microscopique 18-19. La moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des souris C57BL / 6 ont été isolées et cultivées comme décrit précédemment 20-21. Ces cellules ont été testés en direct des méthodes d&#39;imagerie cellulaire pour démontrer LTB 4 migration cellulaire induite. Le BLT1 humaine a été marqué avec la protéine fluorescente rouge (BLT1-DP) en C-terminal et β-arrestin1 tagués avec la protéine fluorescente verte (β-arr-GFP) et les plasmides transfectés dans les deux Rat basophiles Leukomia (RBL-2H3) des lignées cellulaires 18-19. La cinétique de l&#39;interaction entre ces protéines et la localisation ont été surveillés à l&#39;aide en direct vidéo-microscopie cellulaire. Les méthodologies dans le présent document décrit l&#39;utilisation de techniques microscopiques pour étudier les réponses fonctionnelles de G récepteurs couplés aux protéines dans les cellules vivantes. Le présent document décrit également l&#39;utilisation de logiciels Metamorph pour quantifier l&#39;intensité de la fluorescence pour déterminer la cinétique de récepteurs et les interactions entre protéines cytosoliques.

Ce document décrit la méthodologie pour déterminer la réponse chimiotactique des leucocytes à des ligands spécifiques et d&#39;identifier les interactions entre les récepteurs de surface cellulaire et des protéines cytosoliques en utilisant des techniques d&#39;imagerie cellulaire direct.

Imagerie en temps réel des leucotriènes B 4</subMigration> Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) appartiennent à la famille des protéines à sept domaines transmembranaires et assurent la transduction de signaux extracellulaires vers...

Le leucotriène B quatre est une molécule pro-inflammatoire qui exerce ses effets par l'intermédiaire des récepteurs couplés aux protéines G, BT un et BT deux, présents sur divers types de cellules inflammatoires. La voie de signalisation LTB quatre/BT un s'est révélée essentielle dans plusieurs maladies inflammatoires, notamment l'asthme, l'arthrite et l'athérosclérose. Les récepteurs couplés aux protéines G, ou RCPG, assurent la transduction de signaux extracellulaires conduisant à des réponses intracellulaires telles que la chimiotaxie, la libération de calcium intracellulaire et la régulation génique.La liaison du ligand extracellulaire induit une série de changements conformationnels conduisant à l'activation des protéines G hétérotrimériques. Les protéines G modulent ensuite les niveaux de messagers secondaires, tels que l'adénosine monophosphate cyclique, un acétyl triphosphate et le glycérol DYL, afin de surveiller en temps réel la migration cellulaire induite par le leucotriène B4. Des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse, ou B MDCs, sont observées pendant qu'un chimiocaptateur est délivré par flux contrôlé à partir d'une micropipette. Une imagerie en laps de temps est réalisée pour évaluer la migration.En utilisant ces techniques d'imagerie en temps réel sur cellules vivantes, notre laboratoire a découvert que le récepteur BT1 du leukotriène B4 est fonctionnellement exprimé sur les cellules dendritiques. Nous avons également identifié les mécanismes de phosphorylation et de recrutement de la bêta-arrestine impliqués dans l'internalisation de BT1. Le Dr Jla, professeur adjoint dans notre laboratoire, qui a mis au point plusieurs de ces techniques, démontrera à la fois la migration des cellules vivantes et l'internalisation des récepteurs. Pour préparer les cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (B MDC) en vue de tests de migration cellulaire, placer 0,5 million de cellules dans un milieu de culture RPMI 1640 contenant du G-M-C-S-F recombinant, du FPS et du FLT3 recombinant, dans une boîte de 35 millimètres à fond en verre.Une fois ensemencées, incuber les cellules pendant 16 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ajouter trois millilitres de PBS, puis aspirer. Répéter ce lavage au moins deux fois supplémentaires ; après la dernière aspiration, ajouter deux millilitres de PBS dans la plaque.Les cellules sont désormais prêtes pour l'expérience et doivent être maintenues à 37 degrés Celsius. Jusqu'alors, le système d'imagerie utilisé pour les expériences présentées dans cette vidéo est constitué d'un système épifluorescent A-T-E-F-M relié à un microscope inversé Nikon Eclipse TE 300, équipé d'une platine chauffante et d'une caméra numérique CCD monochrome Cool SNAP hq.Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission sont contrôlées à l'aide de roues à filtres et d'un contrôleur de roue à filtres Lambda 10 dash two. Le logiciel MetaMorph gère le contrôle du matériel et l'acquisition des images. Deux micromanipulateurs sont fixés sur la platine du microscope pour maintenir les pipettes, qui peuvent être fabriquées selon les instructions fournies dans le texte accompagnant ou achetées prêtes à l'emploi.Transférez 1,5 millilitre d'une solution mère de 100 nanomolaire du ligand pro-inflammatoire leucotriène B quatre ou LTB quatre dans un tube fuge de 1,5 millilitre. Remplissez la micropipette par aspiration en plaçant l'embout de la micropipette dans la solution et en laissant la solution pénétrer ; cette méthode de chargement empêchera la formation de bulles d'air à l'extrémité de la micropipette. Ensuite, chargez une seringue tuberculinique d'un centimètre cube, reliée à une aiguille microfill, avec un millilitre de LTB quatre.Ensuite, utilisez-le pour remplir lentement une micropipette par le haut ; reliez un tube à la micropipette remplie de LTB. Puis, connectez la micropipette et le tube à une aiguille de 21 gauge, d'une longueur d'un pouce et demi, fixée à une seringue d'un millilitre, également remplie de ligand. Fixez maintenant soigneusement la micropipette remplie de ligand à l'un des micromanipulateurs situés sur la platine du microscope afin d'effectuer une imagerie en temps réel de cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse.En réponse à l'application du ligand LTB4, retirer les bMDC immatures ensemencés de l'incubateur et les placer sur la platine chauffante du microscope. Mettre les cellules en évidence à l'aide d'un objectif à immersion huile de 60 x. Rechercher une zone où les cellules ne sont pas trop densément groupées, afin que la migration puisse être correctement surveillée.Retirez le couvercle de la boîte fluoro. Ensuite, à l’aide du manipulateur manuel grossier, abaissez soigneusement la pipette chargée de ligand et approchez-la. Rapprochez-vous au maximum des cellules à l’aide du manipulateur microhydraulique fin.Mettre la pipette au point. Appliquer une légère pression à l’aide de la seringue pour amorcer la libération lente du ligand LTB4 à partir de l’extrémité ; le ligand doit se diffuser lentement dans le milieu par diffusion. Ensuite, à l’aide du logiciel MetaMorph, régler les paramètres d’acquisition d’image pour acquérir une image en champ clair toutes les 15 secondes pendant deux heures.Continuer la surveillance toutes les cinq minutes pour suivre la progression de la migration vers le ligand. La méthode décrite dans ce protocole a été utilisée pour déterminer la migration des cellules dendritiques vers le leucotriène B4. Ici, la migration des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de souris vers 100.L'animal Nan ou l'LTB4 est observé dans cette vidéo d'imagerie en temps réel, qui montre la migration de cellules vivantes de B MDCs vers l'LTB4. Des méthodes similaires peuvent être appliquées pour déterminer la réponse chimiotactique de nombreux types cellulaires à divers chémoattractants. Ce type d'imagerie, combiné à des molécules marquées par des protéines fluorescentes, peut être utilisé pour suivre en temps réel les mouvements et les interactions des molécules dans des cellules vivantes.Ici, nous démontrons en temps réel les interactions entre le récepteur un de la leucotriène B quatre marqué par un fluorochrome et l'arrestine bêta. RBL deux H trois est une lignée cellulaire de leucémie basophile de rat isolée à partir de rats Wistar, disponible auprès de l'A TCC. Ces cellules n'expriment pas de nombreux récepteurs de chimiokines, mais possèdent les composants cellulaires nécessaires pour médier des voies de signalisation dépendantes des chimiokines.Pour évaluer en temps réel l'internalisation induite par le ligand du BT un, des cellules RBL deux H trois sont transfectées avec le BT un RFP et la bêta-arrestine GFP. Pendant l'acquisition d'images en laps de temps, le ligand est ajouté à la plaque. Les changements de localisation de ces protéines peuvent être évalués par analyse d'image.Pour étudier l'internalisation du récepteur G PCR R en temps réel, transfectez le gène B LT one RFP et la bêta-arrestine GFP dans des cellules RBL two H three selon les instructions fournies dans le texte accompagnant. Ensuite, transférez 300 microlitres du mélange de cellules électroporées et de milieu de croissance ordinaire dans des boîtes fluoro de 35 millimètres contenant deux millilitres de milieu de croissance ordinaire. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée composée de 95 % d'air et de 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre leur adhésion au fond de la boîte. Après une heure, remplacer le milieu de transfection par du milieu de croissance ordinaire et remettre les cellules dans l’incubateur pendant 18 à 24 heures supplémentaires. À l’issue de l’incubation, laver les cellules deux ou trois fois en ajoutant deux millilitres de RPMI chaud sans rouge de phénol contenant 10 millimolaire de hippies directement dans la plaque, puis en aspirant les milieux. Ajouter ensuite 1,8 millilitre supplémentaire.Ensuite, placez la boîte de culture sur le plateau chauffé du microscope. Acquérez des images à un grossissement de 600 x à l’aide d’un objectif à immersion huile de 60 x. Puis passez au filtre de fluorescence approprié.Choisissez une cellule saine exprimant HBL BT un RFP à la surface cellulaire et capturez ici l'image. À l'aide du filtre RFP, passez au filtre GFP, vérifiez que l'arrêt bêta et GFP sont exprimés dans le cytoplasme, puis capturez l'image. Examinez ensuite les images pseudo-colorées fusionnées afin de vous assurer qu'il n'y a pas de recouvrement de fluorescence, qui peut survenir en raison d'une erreur.L'adressage des récepteurs ne se produit pas entre le RFP et le GFP. Ensuite, saisissez ici les paramètres pour l'acquisition en laps de temps. Des images en 16 bits sont acquises avec le réglage de courbure de la caméra fixé à un par un.Les images de fluorescence rouge et verte sont capturées séquentiellement à l’aide de filtres de fluorochromes RFP et GFP via un séparateur de faisceau R-F-P-G-F-P. Configurez le logiciel pour acquérir des images à des intervalles de temps de 32&nbsp;secondes pendant une heure. Réglez les temps de pose de la caméra de manière à obtenir des gammes dynamiques similaires.Pour l'intensité de fluorescence de la RFP et de la GFP, collectez des images pendant une minute, puis, à t égal à zéro, ajoutez directement les 200 microlitres du ligand dans la plaque sans la perturber.Continuer à acquérir des images de fluorescence pendant 60 minutes. Après l'ajout du ligand, les images seront automatiquement enregistrées sous forme de fichiers TIFF avec des noms de fichiers séquentiels au fur et à mesure de leur acquisition. Les fichiers peuvent ensuite être visualisés individuellement ou combinés à l'aide du logiciel.Enfin, une fois toutes les images cellulaires acquises, acquérez des images avec le milieu seul (sans cellules) en utilisant les mêmes paramètres. Enregistrez les fichiers pour les utiliser comme images de fond afin d'analyser les images. Utilisez la fonction de soustraction d'image dans MetaMorph pour soustraire le fond des images de données réelles obtenues ci-dessus.Cela permettra de prendre en compte tout fond ou autofluorescence provenant du milieu. Ensuite, dans le menu Fichier, ouvrez l'option de fichier de pile généré final et chargez les piles d'images individuelles. Ensuite, dans Mesures de région, sélectionnez Tracé de région elliptique et dessinez les régions d'intérêt ; sélectionnez les régions membranaires et cytosoliques afin de mesurer l'intensité de fluorescence de RFP et de GFP correspondant respectivement à la translocation de BLT1 et de la bêta-arrestine.À l'aide de l'option de données logarithmiques, qui crée automatiquement un lien avec Excel, reportez la quantité d'intensités de fluorescence en fonction du temps. Ce graphique fournira des informations sur la cinétique de translocation d'une molécule donnée. L'analyse d'image peut révéler la localisation des protéines G PCR R, des protéines cytosoliques et du noyau.Ici, l'expression de BT one RFP à la surface d'une cellule RBL two H three est visible. Cette image montre la localisation de beta rest et de la GFP dans le cytosol de la même cellule, et ici p nuke CFP est visible dans le noyau. L'image combinée en couleurs présentée ici indique la localisation cellulaire distincte de chaque fluorochrome. L'interaction induite par le ligand entre les RCPG de surface et les protéines cytosoliques peut également être évaluée ici.Translocation induit par un ligand du récepteur BLT1 et de la bêta-arrestine. Cette vidéo montre l'imagerie en temps réel d'une cellule exprimant BLT1-RFP et la bêta-arrestine-GFP. Après l'ajout de un micromolaire de LTB4, la quantification des profils de translocation peut être suivie à l'aide du logiciel MetaMorph.Un balayage linéaire des intensités de fluorescence dans une cellule représentative est montré à T égal à zéro. BT1-RFP est observé au niveau de la membrane et la bêta-arrestine GFP est visible dans le cytosol. Après l'ajout du ligand, un recouvrement des lignes RFP et GFP est observé, suggérant une colocalisation du récepteur et de la bêta-arrestine.En outre, la cinétique du mouvement des protéines peut être déterminée ici. La cinétique de l'internalisation des récepteurs et de la translocation de l'arrestine bêta. Elle a été examinée après l'ajout d'un micromolaire de LTB quatre.Les intensités de fluorescence ont été mesurées en fonction du temps aux emplacements membranaires et cytosoliques de la cellule. L'ajout du ligand LTB4 aux cellules RRB2H3 transfectées avec BT1-RFP et bêta-arrestine1-GFP entraîne la translocation de bêta-arrestine1-GFP du cytosol vers la membrane, observable sous la forme d'un anneau jaune apparaissant en moins d'une minute. Lors de son interaction avec bêta-arrestine1-GFP, BT1-RFP forme un complexe récepteur-bêta-arrestine1-GFP qui transloque à travers le cytosol sous forme d'endosomes, comme en témoigne l'apparition de points jaunes en cinq minutes. À l'aide de ces méthodes, il est possible de déterminer l'état d'activation du récepteur dépendant du ligand ainsi que les motifs ou processus critiques impliqués dans l'activation du récepteur.La chose la plus importante dans l'expérience est de surveiller attentivement le tampon dans la plaque pendant son fonctionnement. L'expérience se prolongeant au-delà d'une heure après son démarrage. Cette technique est apparue aux chercheurs dans le domaine des chimioquines et de leurs récepteurs pour explorer la migration cellulaire et les interactions ligand-récepteur dans divers types cellulaires de mammifères.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place des expériences d'imagerie en temps réel impliquant des chimioattractants et leurs récepteurs, ainsi que leurs interactions avec des protéines cytosoliques telles que les bêta-arrestines.

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous décrivons un non-invasive à deux photons approche microscopique (2P) pour l'étude des leucocytes homing dans le coussinet plantaire de la souris. Nous discutons des aspects techniques de notre préparation imagerie des tissus et de marcher le lecteur à travers une expérience typique de la configuration initiale à la collecte de l'exécution et des données.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

C'est une méthode pour visualiser l'adhésion des leucocytes à l'endothélium dans les vaisseaux sous pression récoltés. La technique permet l'étude de l'adhérence vasculaires sous flux de cisaillement avec différentes pressions intraluminale jusqu'à 200 mmHg donc imitent-ment les conditions physiopathologiques de l'hypertension artérielle.

Adhésion leucocytaire imagerie de l&#39;endothélium vasculaire au Haute pression intraluminale

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

Cette application simplifiée de la microscopie intravitale des veines du mésentère chez la souris peut être utilisée dans différents modèles d’inflammation pour observer les interactions leucocytes-endothéliales et plaquettes-leucocytes.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Nous présentons ici un protocole de cellules d'image exprimant vert fluorescent type récepteurs de l'angiotensine 1a protéine marqués pendant endocytose initiés par le traitement de l'angiotensine II. Cette technique comprend les lysosomes d'étiquetage avec un second marqueur fluorescent, puis en utilisant un logiciel pour analyser la co-localisation du récepteur et lysosome en trois dimensions au fil du temps.

En direct d&#39;imagerie cellulaire et l&#39;analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

Dans ce protocole, un test de microfluide biomimétique, qui peut reproduire un environnement microvasculaire physiologiquement pertinent et reproduire l’ensemble de la cascade d’adhésion / migration des leucocytes, est utilisé pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales dans les maladies inflammatoires.

Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

L’imagerie in vivo des articulations est une technique précieuse pour découvrir le comportement migratoire des leucocytes et la dynamique moléculaire des articulations enflammées. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’imagerie in vivo des articulations à l’aide d’un modèle murin de l’arthrite induite par le collagène de type II (ACI).

In vivo L’imagerie révèle le comportement migratoire des leucocytes à l’intérieur des articulations

Découvrez l'imagerie en temps réel de la migration cellulaire médiée par le leucotriène B4 et les interactions BLT1-β-arrestine. Cette méthode révèle les mécanismes de chimiotaxie des leucocytes et de signalisation des récepteurs couplés aux protéines G.

Imagerie en temps réel des leucotriènes B_{4 Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine}

Explorer plus de vidéos