Induites par l'environnement changements héréditaires dans lin

L’objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode de culture d’une variété de lin inductible dans des conditions qui entraînent une variation génomique héréditaire. De plus, les changements génomiques sont surveillés et la croissance des plantes induites dans les générations suivantes est observée dans les différents environnements. Pour ce faire, le lin est cultivé dans diverses conditions d’induction.

Les tissus des feuilles et de la tige de Maris sont ensuite collectés à divers moments de la croissance des plantes dans les différents environnements. Ensuite, l’ADN et l’ARN sont isolés à partir des échantillons de tissus. La dernière étape de la procédure consiste à effectuer une PCR à l’aide des échantillons d’ADN et Q-R-T-P-C-R à l’aide de l’ARN isolé pour identifier les changements génomiques et les changements d’expression génique résultant de la croissance dans différentes conditions environnementales.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus pour montrer la réponse génomique aux conditions de croissance avec l’apparition de l’élément d’insertion LIS un à un point spécifique du génome et les différences d’expression associées à la présence de cet élément telles que visualisées par PCR et R-T-P-C-R réalisées avec de l’acide nucléique isolé des tissus des plantes traitées. Bonjour, je m’appelle Chris Cull et je travaille au Département de biologie de l’Université Case Western Reserve. Je m’appelle Cory Johnson et je travaille au Cull Lab.

Et je m’appelle Tiffany Moss, je suis aussi du laboratoire d’abattage. Et je m’appelle Marshall Lucas. Un étudiant de premier cycle dans le programme d’été pour la recherche de premier cycle au laboratoire Cull.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les changements dans le génome et l’expression des gènes résultant des variations de l’environnement de croissance. Alors commençons. Pour faire pousser le lin dans des conditions induisantes, commencez par remplir des pots de cinq pouces avec de la terre et raffermissez.

Plante suivante, trois graines de lin par pot, à un quart de pouce de profondeur. Puis du sol sur les graines pour les conditions de contrôle non induisantes. Arrosez les plantes avec 100 millilitres d’une solution miracle de croissance de 10e force.

Traitez les plantes dans des conditions riches en nutriments avec 100 millilitres de pleine puissance. Miracle grandir. Enfin, postulez.

Seulement de l’eau du robinet pour les plantes pauvres en nutriments. Faites pousser les plantes sous la lumière naturelle pendant l’été au fur et à mesure que les plantes poussent. Arrosez toutes les plantes par un système de pulvérisation automatique deux fois par jour pendant cinq minutes.

Appliquez les conditions de croissance sur les plantes une fois par semaine. Rassemblez les feuilles en tiges de mari à intervalles hebdomadaires. Six feuilles sont collectées pour l’extraction de l’ADN, et trois tiges de mee sont nécessaires pour l’extraction de l’ARN après la collecte, placez le matériel végétal dans un flacon cryogénique, congelez-le rapidement dans de l’azote liquide et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient extraits.

Les trois génotypes se développent à des rythmes relatifs différents selon les conditions. Dans des conditions de contrôle, la variété de lin consanguine storm ou la lignée PL pousse le mieux. Plusieurs lignées ont été dérivées de ce parent, la grande variété L étant plus vigoureuse que la petite variété S.

Cependant, sous un faible taux de nutriments, le S pousse mieux que le L ou le Pl. Et dans des conditions riches en nutriments, L pousse mieux que pl, qui ne pousse que légèrement mieux que S.Une comparaison entre chacune des lignées cultivées sous les trois traitements différents révèle que PL pousse mieux dans des conditions de contrôle. L pousse mieux dans des conditions riches en nutriments, et S pousse de la même manière dans des conditions riches en nutriments et de contrôle.

Ces données montrent que les trois lignes peuvent être différenciées en fonction de leur croissance dans les trois environnements. Alors que PL et L poussent mieux dans des environnements spécifiques, S pousse à peu près de la même manière dans les trois conditions. S n’est pas en mesure de tirer parti de meilleures conditions nutritives, mais il est mieux à même de croître dans des conditions très pauvres en nutriments.

Pour l’extraction de l’ADN, ajoutez un tampon, AP un du Qiagen, la plante DNEZ, un kit de préparation d’ADN à six feuilles avec du sable stérile dans un tube de micro-fuge, broyez le tissu avec un micro pilon jusqu’à ce qu’aucun grumeau ne soit visible. Poursuivez l’extraction en suivant les instructions du kit comme indiqué pour commencer le transfert de l’extraction de l’ARN, trois tiges de maris et quelques feuilles environnantes d’un flacon cryogénique de stockage à un tube de micro-fuge. Ajoutez du sable stérile dans le tube et broyez le tissu à l’aide d’un micro-pilon jusqu’à ce qu’il soit finement moulu.

Vortex l’échantillon pendant 15 secondes pour faciliter la lyse, puis tournez-le pendant une minute à 13 000 tr/min pour recueillir le sable et les débris. Ajoutez le SNAT à la colonne de spin et poursuivez la préparation de l’ARN selon les instructions du fabricant. Une fois l’ARN extrait du tissu, transférez 10 tampons XDNA à un dixième du volume de l’échantillon d’ARN à la réaction.

Et à 30 unités de D Ns, incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Effectuez la transcription inverse à l’aide du kit ARN des biosystèmes appliqué au CD NA. Selon les instructions du fabricant et du S, incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Enfin, exécutez cinq microlitres de CDNA sur un gel AROS à 1,5 % pour déterminer le rendement. Une fois que le lin CD NA a été préparé, il est utilisé pour le QPCR. Réaliser la QPCR à l’aide d’un système A BI Step one.

Effectuez tous les tests en trois exemplaires pour chaque cycle et utilisez le gène d’entretien Acton comme contrôle du nombre de copies pour préparer les réactions pour QPCR. Ajoutez un microlitre de la paire d’amorces appropriée dans chaque tube. Diluez le CD NA à la concentration appropriée et ajoutez neuf microlitres dans chaque tube.

Enfin, ajoutez 10 microlitres du mélange maître PCR deux x cyberg green dans chaque tube. Ensuite, configurez le programme d’amplification après l’amplification. Calculez les niveaux d’expression relatifs à partir du numéro de cycle du seuil, qui est déterminé par les paramètres par défaut dans le logiciel de la première étape et confirmé par l’inspection des courbes d’amplification.

L’amplification par PCR à partir de l’ADN, isolé des feuilles à divers endroits le long de la tige, démontre l’apparition d’une seule copie de 5,7 kilobases, fragment d’ADN appelée séquence d’insertion de ligne, ou LIS lorsque les plantes sont cultivées dans des conditions inductrices. Le LIS one apparaît lorsque le PL est cultivé dans des conditions de faible apport en nutriments et finit par devenir homozygote. Ici. Les échantillons de feuilles un à six ont été isolés à intervalles hebdomadaires, le premier échantillon étant le plus tôt après que l’ADN ait été extrait des échantillons.

L’amplification par PCR révèle la présence des deux extrémités du LAS dans tous les échantillons sauf la première. Cela correspond à la disparition du site inséré par l’unins et à l’absence de preuve de celui-ci à la cinquième feuille QPCR. Les résultats montrent que la présence de LAS un ou d’autres modifications génomiques associées à l’induction affectent l’expression des gènes à proximité immédiate d’un gène S.

Les six gènes montrés ici sont tous exprimés différemment dans PL et S, quatre des gènes ont une expression plus élevée dans pl, qui n’a pas de LIS. Inversement, deux ont une expression plus élevée dans S, qui a LIS un, Nous venons de vous montrer comment cultiver des lignées de lin inductibles. Ainsi, le génome change en réponse à l’environnement de croissance et aux caractéristiques de croissance des générations suivantes.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions de croissance doivent être reproduites pour une induction reproductible des changements. Donc c’est tout. Je sais que beaucoup d’entre vous sont sceptiques à l’égard de ce phénomène, mais maintenant vous pouvez reproduire les observations par vous-mêmes.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.