Induites par l'environnement changements héréditaires dans lin

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode permettant de cultiver une variété de lin induisible dans des conditions entraînant une variation génomique héréditaire. En outre, les modifications génomiques sont surveillées et la croissance des plantes induites au cours des générations suivantes est observée dans divers environnements. Pour y parvenir, le lin est cultivé dans une variété de conditions inductrices.

Des tissus foliaires et des tiges de Maris sont ensuite prélevés à différents moments de la croissance des plantes dans divers environnements. Ensuite, l'ADN et l'ARN sont isolés à partir des échantillons de tissu. La dernière étape de la procédure consiste à réaliser une PCR à l'aide des échantillons d'ADN et une Q-R-T-PCR à partir de l'ARN isolé afin d'identifier les modifications génomiques et les variations d'expression génique résultant d'une croissance dans des conditions environnementales différentes.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus afin de montrer la réponse génomique aux conditions de croissance, avec l'apparition de l'élément d'insertion LIS-1 à un point précis du génome et les différences d'expression associées à la présence de cet élément, telles que visualisées par PCR et RT-PCR réalisées à partir d'acides nucléiques isolés des tissus de plantes traitées. Bonjour, je suis Chris Cull du Département de biologie de l'Université Case Western Reserve. Je suis Cory Johnson du laboratoire Cull.

Et je suis Tiffany Moss, également du laboratoire Cull. Et je suis Marshall Lucas, étudiant de premier cycle dans le programme estival de recherche pour étudiants de premier cycle au laboratoire Cull.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modifications du génome et de l'expression des gènes résultant de variations de l'environnement de croissance. Commençons donc. Pour cultiver le lin dans des conditions inductrices, commencez par remplir des pots de cinq pouces de terre et tassez-la.

Plantez ensuite trois graines de lin par pot, à une profondeur d'un quart de pouce. Recouvrez ensuite les graines de terre pour les conditions de contrôle non inductrices. Arrosez les plantes avec 100 millilitres d'une solution de Miracle-Gro diluée au dixième.

Traitez les plantes cultivées dans des conditions de forte concentration nutritive avec 100 millilitres de solution nutritive complète Miracle Grow. Appliquez enfin.

N'appliquez que de l'eau du robinet aux plantes à faible teneur en nutriments. Faites pousser les plantes à la lumière naturelle pendant l'été, au fur et à mesure de leur croissance. Arrosez toutes les plantes deux fois par jour pendant cinq minutes à l'aide d'un système de pulvérisation automatique.

Appliquez les conditions de croissance aux plantes une fois par semaine. Récoltez les feuilles sur tiges mari à intervalles hebdomadaires. Six feuilles sont prélevées pour l'extraction de l'ADN, et trois tiges me sont nécessaires pour l'extraction de l'ARN. Après la récolte, placez le matériel végétal dans un tube cryogénique, congélez-le rapidement dans de l'azote liquide et conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur extraction.

Les trois génotypes croissent à des taux relatifs différents selon les conditions. Dans des conditions de contrôle, la variété de lin consanguine Storm ou la lignée PL se développe le mieux. Plusieurs lignées ont été obtenues à partir de ce parent, une variété grande ou L étant plus vigoureuse que la variété petite ou S.

Cependant, en conditions de faible teneur en nutriments, S se développe mieux que L ou pl. Et en conditions de forte teneur en nutriments, L se développe mieux que pl, qui ne se développe que légèrement mieux que S. Une comparaison entre chacune des lignées cultivées dans les trois traitements différents révèle que PL se développe le mieux en conditions de contrôle. L se développe le mieux en conditions de forte teneur en nutriments, et S se développe de manière similaire en conditions de forte teneur en nutriments et en conditions de contrôle.

Ces données montrent que les trois lignées peuvent être différenciées selon leur croissance dans les trois environnements. Alors que PL et L présentent une meilleure croissance dans des environnements spécifiques, S croît à peu près de la même manière dans les trois conditions. S n'est pas capable de tirer parti de conditions nutritives améliorées, mais présente une meilleure croissance dans des conditions de très faible disponibilité en nutriments.

Pour l'extraction de l'ADN, ajouter du tampon AP du kit de préparation d'ADN végétal DNEZ de Qiagen à six feuilles avec du sable stérile dans un tube microfuge, puis broyer le tissu à l'aide d'une micro-louche jusqu'à ce qu'aucun agrégat ne soit visible. Poursuivre l'extraction en suivant les instructions du kit. Pour commencer l'extraction d'ARN, transférer trois tiges de maris ainsi que quelques feuilles environnantes depuis une fiole cryogénique de stockage vers un tube microfuge. Ajouter du sable stérile dans le tube et broyer le tissu à l'aide d'une micro-louche jusqu'à obtention d'une poudre fine.

Vortexez l'échantillon pendant 15 secondes pour faciliter la lyse, puis centrifugez pendant une minute à 13 000 tr/min pour récupérer le sable et tous les débris. Ajoutez le SNAT à la colonne de centrifugation et poursuivez la préparation de l'ARN selon les instructions du fabricant. Une fois l'ARN extrait du tissu, ajoutez 10 XDNA tampon à un dixième du volume de l'échantillon d'ARN dans la réaction.

Et à 30 unités de D Ns, incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Réaliser la transcription inverse en utilisant le kit Applied Biosystems d'ARN en ADNc, conformément aux instructions du fabricant et de S. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Enfin, déposez cinq microlitres de l'ADNc sur un gel AROS à 1,5 % pour déterminer le rendement. Une fois l'ADNc de lin préparé, utilisez-le pour la PCR quantitative. Effectuez la PCR quantitative à l'aide d'un système ABI StepOne.

Réalisez tous les dosages en triplicata pour chaque expérience, et utilisez le gène ménager Acton comme témoin de contrôle du nombre de copies afin de préparer les réactions de QPCR. Ajoutez un microlitre de la paire d'amorces appropriée dans chaque tube. Diluez l'ADNc à la concentration appropriée et ajoutez neuf microlitres dans chaque tube.

Enfin, ajoutez 10 microlitres du mélange maître PCR deux fois cybergreen à chaque tube. Ensuite, configurez le programme d'amplification après l'amplification. Calculez les niveaux d'expression relatifs à partir du nombre de cycles au seuil, qui est déterminé par les paramètres par défaut du logiciel Step One et confirmé par l'inspection des courbes d'amplification.

L'amplification par PCR à partir de l'ADN, isolé de feuilles prélevées à différentes positions le long de la tige, démontre l'apparition d'un fragment d'ADN unique de 5,7 kilobases, appelé séquence d'insertion de ligne, ou SIL un, lorsque les plantes sont cultivées dans des conditions inductrices. La SIL un apparaît lorsque le PL est cultivé dans des conditions inductrices de faible teneur en nutriments et devient finalement homozygote. Ici, des échantillons de feuilles allant de un à six ont été prélevés à intervalles hebdomadaires, l'échantillon un correspondant au prélèvement le plus précoce après semis. L'ADN a ensuite été extrait des échantillons.

L'amplification par PCR révèle la présence des deux extrémités de LAS un dans tous les échantillons, sauf le premier. Cela correspond à la disparition du site inséré non inséré et à l'absence de traces de celui-ci lors de la qPCR de la cinquième feuille. Les résultats montrent que la présence de LAS un ou d'autres modifications génomiques associées à l'induction affecte l'expression des gènes situés à proximité immédiate de S un.

Les six gènes présentés ici sont tous exprimés de manière différentielle dans le PL et le S : quatre des gènes présentent une expression plus élevée dans le PL, qui ne possède pas LIS un. Inversement, deux gènes ont une expression plus élevée dans le S, qui possède LIS un. Nous venons de vous montrer comment cultiver des lignées de lin inducibles. Ainsi, le génome évolue en réponse à l'environnement de croissance et aux caractéristiques de croissance des générations suivantes.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions de croissance doivent être reproduites afin d'obtenir une induction reproductible des changements. Voilà donc. Je sais que beaucoup d'entre vous sont sceptiques quant à ce phénomène, mais désormais vous pouvez reproduire vous-mêmes les observations.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.