Name: Induites par lenvironnement changements héréditaires dans lin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez comment induire des variations génomiques héréditaires chez le lin par stress nutritif. Cette méthode utilise PCR et Q-R-T-P-C-R pour analyser les changements d'expression génique liés à l'élément LIS one.

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1. La croissance du lin dans des conditions d'induction. <ol><li> 5 "pots sont remplis de terre et raffermie. </li><li> Trois graines par pot sont plantés ¼ de pouce de profondeur et le sol raffermi au cours des graines. </li><li> Les pots sont ensuite arrosées avec 100ml de solutions appropriées en nutriments <ol><li> Le non-induisant de contrôle (C) des conditions d'utilisation une force 1 / 10 ème Miracle-Gro chaque semaine. La condition élevée en éléments nutritifs (NPK traitement) avaient Miracle pleine force appliquée Cultivez hebdomadaire. Faible en nutriments - les plantes que l'eau du robinet avait appliqué tout au long de leur croissance. (Durrant 1971, Cullis, 1980). </li></ol></li><li> Les plantes sont cultivées sous lumière naturelle durant l'été. Pendant l'hiver, ils sont cultivés sous les lumières de sodium avec un 16 / 8 heures cycle lumière / obscurité. </li><li> A intervalles hebdomadaires feuilles et les méristèmes sont prélevés. </li><li> Le matériel végétal est rapide congelés dans l'azote liquide. </li></ol> Résultats Les trois génotypes différents croître à des taux relatifs en fonction des conditions (figure 1). Par conséquent, dans des conditions de contrôle de la ligne Pl pousse mieux avec L plus vigoureux que S (figure 1a). Sous nutriments faible (eau), S pousse mieux que ce soit L ou Pl (figure 1b). Sous élevée de nutriments (NPK) L pousse mieux que Pl qui ne pousse que légèrement mieux que S (figure 1c). Une comparaison entre chacune des lignes cultivées sous les trois traitements différents est montré dans la figure 1 D - F. Pl. pousse mieux dans des conditions de contrôle (figure 1d), la meilleure L sous nutriments élevé (figure 1e) et S de la même sous les deux nutriments élevés et des conditions de contrôle (Figure 1f). Ces données montrent que les trois lignes peuvent être différenciés en fonction de leur croissance dans les trois environnements. Il est à noter que les Pl. pousse mieux dans les conditions de contrôle tandis que L pousse mieux dans les conditions NPK (sous lequel elle a été induite). S grandit peu près le même dans tous les trois conditions, qui est, il n'est pas en mesure de profiter de l'amélioration des conditions de nutriments, mais est mieux en mesure de croître sous conditions de très faible en éléments nutritifs. Les paramètres de croissance qui sont pertinents pour la différenciation des plantes comprennent la hauteur de la plante (et associés à cette longueur internodale l', qui est la distance entre chaque feuille), la taille des feuilles et le degré de ramification. Pour Pl. dans des conditions de contrôle de l'usine est grand avec des branches et les feuilles sont vertes grande et sombre. Sous nutriments peu la plante est très court, la distance entre chaque feuille est également très court et les feuilles sont vertes petit et léger. Les feuilles à l'extrémité sont vert plus foncé que les plus bas de la tige. Sous haute nutriments de la plante ressemble beaucoup à celle des conditions de contrôle, sauf que les deux la tige principale et les pousses latérales sont plus courtes que dans les plantes témoins. Pour la grande genotroph les plantes sont très similaires à ceux de Pl, sauf que la croissance la plus vigoureuse en moins de nutriments élevés. Encore une fois sous les nutriments peu la plante est très court et a feuilles vert clair. Le genotroph S croît pareillement dans les trois environnements bien que les feuilles sont vert plus clair dans les nutriments faible. Cependant, dans les conditions pauvre en nutriments du genotroph S est beaucoup plus vigoureuse que ce soit de la PL ou des lignes L. 2. ARN et extractions d'ADN à partir de méristèmes de lin et les feuilles sont faites séparément. La Roche ARN total de préparation kit a été utilisé pour les extractions d'ARN et l'ADN de Qiagen DNeasy usine de préparation kit a été utilisé pour l'extraction d'ADN. Extraction des ARN <ol><li> 3 méristèmes plus quelques feuilles environnantes sont déplacés de cryovial stockage en tube Eppendorf et placées dans l'azote liquide avant d'être prêt à broyer. </li><li> Sable stérile est ajoutée au tube et le tissu est broyé en utilisant un micropestle jusqu'en fin. </li><li> 400 lyse ul / tampon de liaison de Roche ARN total Prep Kit est ajoutée et le tissu est broyé encore jusqu'à ce qu'il n'y touffes sont visibles. </li><li> L'échantillon est vortexé pendant 15 sec à l'aide de lyse puis centrifugée pendant 1 min à 13000 rpm pour recueillir du sable et des débris. </li><li> Le surnageant est ajouté à tourner la colonne et le reste des instructions ARN Prep Kit sont suivies comme indiqué. </li></ol> DNAse traitement <ol><li> 1 / 10 volume d'échantillon d'ARN de DNAse tampon 10X est ajouté. </li><li> 30 unités de DNAse est ajouté et la réaction est incubée à 37 ° C pendant 30 min et 70 ° C pendant 5 min. </li></ol> Reverse Transcription <ol><li> Applied Biosystems ARN pour kit d'ADNc est utilisé selon les directives, la réaction incubées à 37 ° C pendant 1 heure et 95 ° C pendant 5 minutes. </li></ol> L'ADNc est ensuite utilisée dans la PCR ou pour qPCR qPCR qPCR été réalisée en utilisant une étape ABI Un système. Tous les essais ont été réalisés en triple sur chaque course. Le gène de l'actine a été utilisée comme un contrôle du nombre de copies quele gène de mieux ménager disponibles. <ol><li> La paire d'amorces appropriée a été ajouté à chaque tube dans 1 microlitre. </li><li> L'ADNc a été dilué à la concentration appropriée et 9μl ajouté à chaque tube </li><li> 10 ul de l'Alimentation 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) et a été ajouté à chaque tube </li><li> Le programme d'amplification du programme a été: <ul><li> 10 minutes à 95 ° C </li><li> 40 cycles de 15sec à 95 ° C, 1 min à 60 ° C </li></ul> Étape de dénaturation thermique afin de vérifier la spécificité d'amplification </li><li> Les niveaux d'expression relative ont été déterminées par la valeur de 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> Préparation de l'ADN <ol><li> Tampon AP1 de Qiagen DNeasy DNA Plant Prep Kit est ajouté à 6 feuilles avec du sable stérile dans un tube de centrifugeuse. Le tissu est broyé avec micropestle jusqu'à ce qu'il n'y touffes sont visibles. </li><li> Les instructions du kit sont suivies comme indiqué. </li></ol> Résultats L'amplification par PCR de l'ADN isolé à partir de feuilles à différentes positions le long de la tige montre que l'apparition de LIS-1 survient alors que les plantes poussent dans des conditions induisant (4). Les résultats qPCR montrent que la présence de LIS-1 (ou d'autres modifications génomiques associées à l'induction) affecte l'expression des gènes dans le voisinage immédiat de la LIS-1 (figure 2). Les six gènes montre la figure 2 sont tous exprimés différentiellement dans Pl et S avec quatre ayant une expression plus élevée en PL (sans LIS-1) et deux ayant une expression plus élevée dans S (qui ne sont LIS-1). Panel 1 et 2 sont les deux gènes proches du point d'insertion de la LIS-1. L'expression de ces gènes dans le s genotroph grande (qui a connu des changements induits, mais n'a pas LIS-1) et l'expression sous différentes conditions de croissance seront nécessaires pour déterminer une relation causale entre le LIS-1 et les changements d'expression. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Pl, L et S grandi sous trois régimes différents nutriments. Panneaux a - contrôle, b - nutriments bas et c - NPK. d - Pl., E - S, f - L. Panneaux d - f de gauche à droite: les nutriments bas, de contrôle et NPK. D - Pl, e - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Figure 2 pouce" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2 pouce"> D'expression génique Figure 2. Autour du point d'insertion de la LIS-1. Gene 1 (inhibiteur de croissance) est immédiatement 5 'du gène LIS1 et 2 (Kip liés cycline-dépendante Identifiant inhibiteur de la kinase 3 "de LIS-1. Les autres gènes sont tous le long de la même échafaud (~ 500ko) construit à partir du séquence complète du génome du lin. S'il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">cliquez ici pour voir une figure plus grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Amplifications par PCR d'ADN extrait de feuilles de plantes individuelles de Stormont Cirrus cultivées sous des conditions de faible en éléments nutritifs. Les produits de PCR ont été séparés sur un agarose à 2%-TBE gel. Le site uninserted est montré dans un Panel, les deux extrémités du site insérés sont indiqués dans les panneaux B et C. Des échantillons de feuilles de 1 à 6 ont été isolés à des intervalles hebdomadaires avec l'échantillon 1 étant la plus ancienne après le semis.

<ol><li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environmentally+induced+adaptive+%28%3F%29+insertion+event+in+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Genet.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li>
</ol>

Le lin semble avoir un génome fondamentalement instable. Un certain nombre de variétés commerciales de fibre de lin rapidement devenu non-uniforme lorsqu&#39;il est cultivé pendant quelques générations. Les mêmes observations ne semblent pas vrai pour les variétés de lin huile. Par conséquent, il semble y avoir une association entre la sélection pour la qualité des fibres et de l&#39;instabilité du génome. L&#39;environnement induit des changements héréditaires dans le lin ont été initialement identifiés par l&#39;enquête sur les observations agronomiques de la croissance de la récolte de la fibre. Ces observations reproductibles des variations spécifiques phénotypiques et génomiques soulève la question de savoir comment le stress environnemental peut influencer la suite de réarrangements génomiques qui peuvent survenir. L&#39;apparition répétée de la LIS-1 en réponse à des environnements particuliers est conforme à cette mutation étant directement ou indirectement sélectionnée. La croissance des lignes induite par divers traitements indique également une amélioration des performances dans les conditions induisant pertinents. Les changements dans l&#39;expression aussi associé à la présence de SIL-1 indique à nouveau que cette insertion affecter les performances des plantes. La vidéo de présentation offre un forum pour l&#39;observation des changements phénotypiques des plantes d&#39;une manière impossible à transmettre à travers des documents imprimés traditionnels.

<ul><li> Les graines de lin de la variété initiale Stormont Cirrus notée Pl et l&#39;genotrophs L et S. </li><li> 5 «pots </li><li> terreau </li><li> Miracle-Gro </li><li> à effet de serre </li><li> Haute lampes sodium haute pression </li><li> L&#39;azote liquide </li><li> Mortier et pilon </li><li> Micropestles et microtubes de </li><li> Thermocycleur </li><li> Équipements électrophorèse sur gel d&#39;agarose </li><li> L&#39;imagerie numérique configuration </li><li> StepOne qPCR module de </li><li> Qiagen DNeasy DNA Plant de préparation kit </li><li> Applied Biosystems ARN pour kit d&#39;ADNc </li><li> Roche ARN total de préparation kit </li></ul>

induites par l&#39;environnement changements héréditaires dans lin

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Certaines variétés de lin de réagir au stress en nutriments, en modifiant leur génome et ces modifications peuvent être héritées à travers de nombreuses générations. Également associés à ces changements génomiques sont héréditaires phénotypique 1,2 variations. Le lin diverses Stormont Cirrus (Pl) lorsqu&#39;il est cultivé dans trois différentes conditions nutritives peuvent soit rester inductible (dans les conditions de contrôle), ou devenir stable modifiées soit à la genotroph grande ou petite par la croissance en haute ou basse conditions nutritives respectivement. Les lignes résultant de la croissance initiale de chacun de ces conditions semblent mieux se développer lorsqu&#39;il est cultivé dans les mêmes conditions dans les générations suivantes, notamment la ligne Pl pousse mieux dans le traitement de contrôle qui indique que la culture des plantes dans les nutriments haute et basse sont sous le stress. Une des modifications génomiques qui sont associées à l&#39;induction de changements héréditaires est l&#39;apparition d&#39;un élément d&#39;insertion (LIS-1) 3, 4, tandis que les plantes sont de plus en plus sous le stress nutritif. En ce qui concerne cet événement d&#39;insertion, le lin diverses Stormont Cirrus (Pl) lorsqu&#39;il est cultivé dans trois différentes conditions nutritives peuvent soit rester inchangé (dans les conditions de contrôle), ont l&#39;insertion apparaissent dans toutes les plantes (sous nutriments faible) et ont transmis cette à la génération suivante, ou avoir de l&#39;insertion (ou de parties de celui-ci) apparaissent mais ne pas être transmis à travers les générations (de nutriments sous haute) 4. La fréquence de l&#39;apparition de cette insertion indique qu&#39;il est sous sélection positive, qui est également conforme à la réponse de croissance dans les générations suivantes. Les feuilles ou les méristèmes récoltés à divers stades de croissance sont utilisés pour l&#39;ADN et l&#39;isolement d&#39;ARN. L&#39;ARN est utilisé pour identifier des variations dans l&#39;expression associée à la croissance des environnements différents et / ou t-il la présence / absence de LIS-1. L&#39;ADN isolé est utilisé pour identifier ces plantes dans lesquelles l&#39;insertion s&#39;est produite.

Growing certaines variétés de lin dans les résultats du stress de nutriments dans la variation génomique au sein d&#39;un sous-ensemble du génome et de la variation phénotypique. Une insertion complexes sur un site spécifique est associée à la croissance sous les divers régimes d&#39;éléments nutritifs et à des changements dans l&#39;expression des gènes dans ce site.

Induites par l&#39;environnement changements héréditaires dans lin

Certaines variétés de lin réagissent au stress nutritionnel en modifiant leur génome, et ces modifications peuvent être transmises sur plusieurs générations. De plus...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode permettant de cultiver une variété de lin induisible dans des conditions entraînant une variation génomique héréditaire. En outre, les modifications génomiques sont surveillées et la croissance des plantes induites au cours des générations suivantes est observée dans divers environnements. Pour y parvenir, le lin est cultivé dans une variété de conditions inductrices.Des tissus foliaires et des tiges de Maris sont ensuite prélevés à différents moments de la croissance des plantes dans divers environnements. Ensuite, l'ADN et l'ARN sont isolés à partir des échantillons de tissu. La dernière étape de la procédure consiste à réaliser une PCR à l'aide des échantillons d'ADN et une Q-R-T-PCR à partir de l'ARN isolé afin d'identifier les modifications génomiques et les variations d'expression génique résultant d'une croissance dans des conditions environnementales différentes.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus afin de montrer la réponse génomique aux conditions de croissance, avec l'apparition de l'élément d'insertion LIS-1 à un point précis du génome et les différences d'expression associées à la présence de cet élément, telles que visualisées par PCR et RT-PCR réalisées à partir d'acides nucléiques isolés des tissus de plantes traitées. Bonjour, je suis Chris Cull du Département de biologie de l'Université Case Western Reserve. Je suis Cory Johnson du laboratoire Cull.Et je suis Tiffany Moss, également du laboratoire Cull. Et je suis Marshall Lucas, étudiant de premier cycle dans le programme estival de recherche pour étudiants de premier cycle au laboratoire Cull.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modifications du génome et de l'expression des gènes résultant de variations de l'environnement de croissance. Commençons donc. Pour cultiver le lin dans des conditions inductrices, commencez par remplir des pots de cinq pouces de terre et tassez-la.Plantez ensuite trois graines de lin par pot, à une profondeur d'un quart de pouce. Recouvrez ensuite les graines de terre pour les conditions de contrôle non inductrices. Arrosez les plantes avec 100 millilitres d'une solution de Miracle-Gro diluée au dixième.Traitez les plantes cultivées dans des conditions de forte concentration nutritive avec 100 millilitres de solution nutritive complète Miracle Grow. Appliquez enfin.N'appliquez que de l'eau du robinet aux plantes à faible teneur en nutriments. Faites pousser les plantes à la lumière naturelle pendant l'été, au fur et à mesure de leur croissance. Arrosez toutes les plantes deux fois par jour pendant cinq minutes à l'aide d'un système de pulvérisation automatique.Appliquez les conditions de croissance aux plantes une fois par semaine. Récoltez les feuilles sur tiges mari à intervalles hebdomadaires. Six feuilles sont prélevées pour l'extraction de l'ADN, et trois tiges me sont nécessaires pour l'extraction de l'ARN. Après la récolte, placez le matériel végétal dans un tube cryogénique, congélez-le rapidement dans de l'azote liquide et conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur extraction.Les trois génotypes croissent à des taux relatifs différents selon les conditions. Dans des conditions de contrôle, la variété de lin consanguine Storm ou la lignée PL se développe le mieux. Plusieurs lignées ont été obtenues à partir de ce parent, une variété grande ou L étant plus vigoureuse que la variété petite ou S.Cependant, en conditions de faible teneur en nutriments, S se développe mieux que L ou pl. Et en conditions de forte teneur en nutriments, L se développe mieux que pl, qui ne se développe que légèrement mieux que S. Une comparaison entre chacune des lignées cultivées dans les trois traitements différents révèle que PL se développe le mieux en conditions de contrôle. L se développe le mieux en conditions de forte teneur en nutriments, et S se développe de manière similaire en conditions de forte teneur en nutriments et en conditions de contrôle.Ces données montrent que les trois lignées peuvent être différenciées selon leur croissance dans les trois environnements. Alors que PL et L présentent une meilleure croissance dans des environnements spécifiques, S croît à peu près de la même manière dans les trois conditions. S n'est pas capable de tirer parti de conditions nutritives améliorées, mais présente une meilleure croissance dans des conditions de très faible disponibilité en nutriments.Pour l'extraction de l'ADN, ajouter du tampon AP du kit de préparation d'ADN végétal DNEZ de Qiagen à six feuilles avec du sable stérile dans un tube microfuge, puis broyer le tissu à l'aide d'une micro-louche jusqu'à ce qu'aucun agrégat ne soit visible. Poursuivre l'extraction en suivant les instructions du kit. Pour commencer l'extraction d'ARN, transférer trois tiges de maris ainsi que quelques feuilles environnantes depuis une fiole cryogénique de stockage vers un tube microfuge. Ajouter du sable stérile dans le tube et broyer le tissu à l'aide d'une micro-louche jusqu'à obtention d'une poudre fine.Vortexez l'échantillon pendant 15 secondes pour faciliter la lyse, puis centrifugez pendant une minute à 13 000 tr/min pour récupérer le sable et tous les débris. Ajoutez le SNAT à la colonne de centrifugation et poursuivez la préparation de l'ARN selon les instructions du fabricant. Une fois l'ARN extrait du tissu, ajoutez 10 XDNA tampon à un dixième du volume de l'échantillon d'ARN dans la réaction.Et à 30 unités de D Ns, incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Réaliser la transcription inverse en utilisant le kit Applied Biosystems d'ARN en ADNc, conformément aux instructions du fabricant et de S. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.Enfin, déposez cinq microlitres de l'ADNc sur un gel AROS à 1,5 % pour déterminer le rendement. Une fois l'ADNc de lin préparé, utilisez-le pour la PCR quantitative. Effectuez la PCR quantitative à l'aide d'un système ABI StepOne.Réalisez tous les dosages en triplicata pour chaque expérience, et utilisez le gène ménager Acton comme témoin de contrôle du nombre de copies afin de préparer les réactions de QPCR. Ajoutez un microlitre de la paire d'amorces appropriée dans chaque tube. Diluez l'ADNc à la concentration appropriée et ajoutez neuf microlitres dans chaque tube.Enfin, ajoutez 10 microlitres du mélange maître PCR deux fois cybergreen à chaque tube. Ensuite, configurez le programme d'amplification après l'amplification. Calculez les niveaux d'expression relatifs à partir du nombre de cycles au seuil, qui est déterminé par les paramètres par défaut du logiciel Step One et confirmé par l'inspection des courbes d'amplification.L'amplification par PCR à partir de l'ADN, isolé de feuilles prélevées à différentes positions le long de la tige, démontre l'apparition d'un fragment d'ADN unique de 5,7 kilobases, appelé séquence d'insertion de ligne, ou SIL un, lorsque les plantes sont cultivées dans des conditions inductrices. La SIL un apparaît lorsque le PL est cultivé dans des conditions inductrices de faible teneur en nutriments et devient finalement homozygote. Ici, des échantillons de feuilles allant de un à six ont été prélevés à intervalles hebdomadaires, l'échantillon un correspondant au prélèvement le plus précoce après semis. L'ADN a ensuite été extrait des échantillons.L'amplification par PCR révèle la présence des deux extrémités de LAS un dans tous les échantillons, sauf le premier. Cela correspond à la disparition du site inséré non inséré et à l'absence de traces de celui-ci lors de la qPCR de la cinquième feuille. Les résultats montrent que la présence de LAS un ou d'autres modifications génomiques associées à l'induction affecte l'expression des gènes situés à proximité immédiate de S un.Les six gènes présentés ici sont tous exprimés de manière différentielle dans le PL et le S : quatre des gènes présentent une expression plus élevée dans le PL, qui ne possède pas LIS un. Inversement, deux gènes ont une expression plus élevée dans le S, qui possède LIS un. Nous venons de vous montrer comment cultiver des lignées de lin inducibles. Ainsi, le génome évolue en réponse à l'environnement de croissance et aux caractéristiques de croissance des générations suivantes.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions de croissance doivent être reproduites afin d'obtenir une induction reproductible des changements. Voilà donc. Je sais que beaucoup d'entre vous sont sceptiques quant à ce phénomène, mais désormais vous pouvez reproduire vous-mêmes les observations.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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