Name: Culture organotypique des cerveaux de rat E18 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Découvrez la culture organotypique de cerveaux de rat E18 pour la neurosciences et la médecine régénérative. Cette méthode permet d'étudier le développement cortical et la migration neuronale in vitro.

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culture organotypique des cerveaux de rat e18

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Cultures organotypique de cerveaux de rongeurs embryonnaires sont largement utilisées pour étudier le développement du cerveau. Alors il ya souvent des avantages à un système d&#39;in-vivo, cultures organotypique permettent d&#39;effectuer un certain nombre de manipulations qui ne sont pas actuellement réalisables in vivo. À ce jour, organtotypic embryonnaire cultures de tranches de cerveau ont été utilisés pour suivre les cellules individuelles en utilisant la microscopie time-lapse, manipuler l&#39;expression des gènes dans le emanances ganglionnaires (une région qui est difficile à cibler par électroporation in utero), ainsi que pour pharmacologiques des études. Dans ce protocole vidéo, nous montrer comment rendre les cultures organotypique de rat jour embryonnaire 18 embryons. Le protocole implique la dissection des embryons, les intégrant sur la glace à faible fondre l&#39;agarose, le tranchage, les cerveaux embarqué sur le vibratome, et enfin les tranches de plaquage sur des filtres dans les boîtes de culture. Ce protocole est également applicable dans sa forme actuelle à faire des cultures organotypique de différents âges embryonnaires pour les rats et les souris.

Culture organotypique des cerveaux de rat E18

Les cultures de tranches organotypiques issues de cerveaux de rongeurs embryonnaires sont largement utilisées pour étudier le développement cérébral. Bien que les systèmes in vivo présentent souvent des avantages, ...

Je m'appelle Laura Elias. Je suis étudiante diplômante en neurosciences travaillant dans le laboratoire d'Arnold K Stein. Nous sommes à l'Institut de médecine régénérative de l'UCSF, et aujourd'hui, je vais vous montrer comment réaliser une culture organotypique de tranches cérébrales de rats E18.Ainsi, cette procédure implique l'ablation des cerveaux, leur inclusion dans de l'agarose à bas point de fusion, puis leur découpe au vibratome afin d'obtenir des sections coronales, avant de les placer dans le système de culture de tranches. Il existe donc quelques outils et réactifs importants que nous utilisons pour cette procédure de culture de tranches. Vous aurez besoin d'un microscope stéréoscopique pour l'ablation des cerveaux.Nous utilisons également ce V comme un vibram VT 1000 S, et c'est un bon système pour couper vos tranches. La colle peut être importante. Nous utilisons ce type de colle verrou pour coller très bien les cerveaux, car parfois, si vous utilisez le mauvais type de colle, les cerveaux se détacheront lorsque vous tenterez de les couper, ce qui peut poser problème.Nous utilisons également ces filtres de milli-cellules, qui sont les filtres sur lesquels nous plaquons nos tranches pendant leur culture, et ceci constitue également une partie importante du processus. Très bien, donc avant de commencer le processus de culture de tranches, il y a quelques étapes que vous devrez accomplir. Tout d'abord, vous devez préparer votre A CSF, et une fois que vous avez terminé la préparation de votre A CSF, vous devez la placer sur de la glace afin qu'elle refroidisse, tout en commençant à la saturer avec du carbogène.Vous voudrez également préparer votre gélose à 4 %. Pour cela, utilisez de la gélose à bas point de fusion, dissolvez-la dans du LCR, passez-la au micro-ondes, puis maintenez-la à 50 degrés jusqu’à l’encapsulation de vos cerveaux. Vous devrez aussi préparer le milieu de culture pour tranches ; après avoir préparé ce milieu, placez-le à 37 degrés afin qu’il commence à se réchauffer, de sorte qu’il soit à la bonne température lorsque vous y placerez vos tranches à la fin.À ce stade, vous devriez être prêt à rassembler vos outils et à commencer le processus de culture de tranches. Très bien, nous allons maintenant réaliser des cultures de tranches à partir du cerveau d'embryons de rats au dix-huitième jour de développement embryonnaire. Tout d'abord, je vais vérifier que la mère est complètement anesthésiée en pinçant un orteil.Voici un exemple où le rat présente encore un minuscule réflexe et ramène légèrement sa patte arrière lorsque je serre son pied. Nous devrons donc attendre plus longtemps ou le réanesthésier un peu, jusqu'à ce qu'aucune réaction ne soit observée. Je vais donc procéder à l'ouverture pour récupérer les embryons.Et je veux simplement tirer la peau afin d'obtenir une incision bien nette. Retirer certains embryons ici, et je vais les découper. Vous pouvez donc couper entre deux embryons, puis poursuivre la découpe en longueur.Et maintenant, nous pouvons retirer cet embryon et le détacher du placenta en pratiquant une incision juste adjacente au placenta. Nous allons maintenant déplacer l'embryon dans un liquide céphalorachidien artificiel froid et retirer le reste de la membrane ici. Oui, c'est bien ça, et couper ici.Donc, maintenant, cet embryon est prêt et nous allons réaliser des coupes cérébrales. Très bien, nous avons maintenant notre embryon, et je vais enlever la tête ici avec des ciseaux. Bon, maintenant je suis prêt à disséquer le cerveau.Tout d'abord, nous devons immobiliser la tête, ce que nous faisons en insérant des broches à travers les orbites ainsi que dans le cerveau postérieur. Cela nous permet d'immobiliser le cerveau dans la boîte de culture. Comme vous le voyez ici, nous avons maintenant un cerveau immobilisé dans notre boîte, et nous allons commencer par pratiquer une incision dans le cerveau postérieur, puis avancer progressivement vers l'avant.Je vais donc commencer par faire une incision ici près du cervelet. Je vais insérer mes ciseaux sous la peau et le crâne, puis déplacer mon incision vers la région de Roswell. Ensuite, je vais faire deux autres incisions latéralement, tout au bout du cortex, près du sero meum.Je vais faire des incisions latéralement dans cette direction, puis une incision ici. Ensuite, j'utiliserai ma pince pour détacher le crâne comme ceci. Maintenant, nous avons exposé le cerveau, et je vais alors le prélever depuis la tête comme suit.Vous avez donc votre cerveau entièrement disséqué. Très bien, nous allons maintenant inclure ces cerveaux dans de l'agarose, et j'ai préparé au préalable de l'agarose à 4 % à bas point de fusion. Vous préparez ce mélange dans un liquide céphalorachidien, vous l'agitez au four à micro-ondes, puis vous le maintenez à environ 50 degrés afin qu'il reste liquide.Et maintenant, je vais commencer le processus d'encapsulation. Je vais donc prendre un peu de cet agros, le mettre dans ces boîtes, et les remplir presque jusqu'au bord, celles-ci. Très bien, ensuite la première étape consiste à prendre vos cerveaux et simplement les rincer dans une boîte contenant de l'agros.Vous ne voulez pas de liquide en excès sur les cerveaux, car cela empêche une bonne inclusion et une bonne adhérence à l'agarose. Ainsi, si vous ne les rincez pas suffisamment à la première étape, ils ont tendance à sortir de l'agarose lorsque vous essayez de les couper au vibratome. Nous les faisons donc simplement tourner doucement pour éliminer le liquide excédentaire.Ensuite, nous transférerons ces cerveaux dans d'autres boîtes remplies d'agarose à 4 %, comme indiqué ici. Nous positionnons maintenant les cerveaux dans l'agarose. Ainsi, veillez à ne pas les placer trop près du fond ou du bord supérieur de la boîte, afin qu'ils soient entourés d'agarose sur tous les côtés.Ensuite, nous allons placer le couvercle sur cette boîte, la recouvrir, puis mettre cette boîte sur de la glace afin que le ris durcisse et que le cerveau soit bien inclus dans les sourcils ; l'agarose devrait durcir en cinq à dix minutes. Très bien, nous avons maintenant nos cerveaux inclus dans l'agarose et nous allons commencer à les sectionner ici sur le vibratome pour obtenir des sections d'environ 300 micromètres d'épaisseur, que nous utiliserons pour les cultures de tranches. Nous effectuerons cette opération, tout comme toutes les autres étapes précédentes, dans du LCR froid qui est saturé avec du carbogène.Et maintenant, nous sommes prêts à commencer. Très bien, nous allons maintenant débuter par retirer le cerveau de l'agarose. Nous allons simplement enlever le dessus ici, et parfois, il faut aider à s'assurer que le bloc d'agarose sorte par le haut.Examinons cela ici. Vous pouvez simplement le placer dans la partie inférieure. Nous avons maintenant les agros, et ce que nous allons faire, c'est inciser les agros afin d'extraire fondamentalement le cerveau.Je vais donc faire quatre incisions : une à l'arrière, une à l'avant, puis deux sur les côtés. En fait, je découpe simplement le cerveau tel que nous l'avons inclus. Nous avons maintenant pratiqué des incisions et découpé notre cerveau dans l'agarose.Et maintenant, nous devrions pouvoir simplement extraire notre cerveau de l'agarose ici. Notre cerveau vient de sortir et il est inclus dans l'agarose. Et maintenant, nous allons prendre la colle et la placer sur cette petite plateforme ici. Fixez.Nous allons donc déposer un peu de colle et placer notre cerveau directement au-dessus de cette colle. En gros, le cervelet, le cerveau postérieur, est en contact avec la colle, tandis que le bulbe olfactif ou l'extrémité rostrale est orienté vers le haut. Ensuite, nous allons déplacer cet ensemble dans la chambre du vibrotrancheur.Je transfère maintenant le cerveau dans le vibrome où nous allons le sectionner. Voilà. Nous le plaçons dans le Vibram et nous le serrons ainsi.Ensuite, nous ajouterons la LCS froide et bouillonnante que j'ai ici sur de la glace. Cela durcit également la colle, ce qui est important. Notre cerveau sera donc maintenant fixé à la plaque dans le vibrotrancheur.Nous sommes maintenant prêts à commencer la section du cerveau au vibratome. Je vais retirer un peu de cet excès d'agar ici. Nous allons donc pratiquer une incision et retirer cette partie.Voici notre cerveau. Je vais maintenant placer la lame sur la tête du vibratome. La lame sera donc insérée ici et positionnée sur le vibratome.Et je vais également couper un peu cette pipette ici afin qu'elle soit suffisamment grande pour prélever les tranches une fois que je les aurai découpées. Voilà qui est fait. Et maintenant, nous sommes prêts à commencer la découpe.Comme je l'ai dit, j'ai utilisé des sections de 300 microns pour cela. Nous allons donc vouloir déplacer notre lame vers le cerveau en montant le plateau. Bon, tout d'abord, nous positionnons simplement notre lame juste avant le tissu ; les premières coupes toucheront soit du agar, soit peut-être les zones les plus superficielles, mais cela sert uniquement à positionner correctement notre lame.Nous avons la vibration à environ sept, et notre vitesse est d'environ cinq. Nous effectuons donc ici des coupes coronales corticales. Nous commençons à l'extrémité très rostrale du cerveau, et pour l'instant, nous pénétrons à peine dans le cerveau.Nous commençons donc juste. C'est donc notre première coupe, mais elle est presque trop rostrale à ce stade. Nous allons donc conserver nos sections manuelles.Ainsi, au fur et à mesure que les sections sortent, je les retire avec mon pied et les place dans un LCR à température ambiante, en agitation. Il est également facultatif d'ajouter de la glace dans la chambre ici pour maintenir une température encore plus basse avec ces cerveaux embryonnaires. Première culture sur glace.Ils semblent survivre parfaitement tant que votre LCR A est glacé. Mais pour d'autres expériences, ou si vos cerveaux sont légèrement plus âgés, vous pouvez ajouter de la glace dans votre chambre afin de maintenir une température extrêmement froide. Nous avons maintenant nos tranches dans le LCR A sous bulles.Ils peuvent rester ici pendant environ une heure, mais nous pouvons également procéder directement à leur transfert dans notre système de culture de tranches. Très bien, nous sommes maintenant prêts à préparer les boîtes et le système de culture afin d'incuber les tranches que nous venons de préparer. Nous allons donc prendre une plaque à six puits ici.Et nous allons, dans chacun de ces puits, ajouter environ un millilitre et demi de ce milieu de culture de tranches que nous avons préparé au préalable et réchauffé à 37 degrés, soit un millilitre et demi dans chacun de ces compartiments. Ensuite, je vais prendre mes filtres. Nous allons en réalité déposer les sections cérébrales sur ces filtres, mais auparavant, ces filtres doivent être placés sur ce milieu.Nous allons donc placer les filtres au-dessus du milieu que vous souhaitez éliminer, en déplaçant les bulles au moins sur le côté. Vous ne devez pas avoir de bulles sous le filtre. Ces filtres permettent aux tranches d'absorber les nutriments provenant du milieu tout en restant exposées à l'air, afin qu'elles ne s'asphyxient pas, en somme.Nous avons maintenant nos filtres dans la boîte et nous sommes prêts à récupérer nos tranches et à les transférer sur les filtres. J'ai ici mes tranches dans cette boîte, dans laquelle j'ai retiré la majeure partie du LCR artificiel. Je souhaite donc ajouter rapidement le milieu de culture de tranches, car il s'agit fondamentalement de les transférer du LCR artificiel vers le milieu de culture de tranches.Je vais donc simplement ajouter du milieu de culture sur mes tranches. Essayez de le faire délicatement afin de ne pas trop abîmer les tranches. Mes tranches sont maintenant dans le milieu de culture, et je vais simplement devoir les transférer sur ces filtres, les trois filtres que j'ai ici.Je vais donc simplement prendre ma pipette ici et aspirer la tranche, puis je vais la placer sur le filtre. Vous pouvez placer plusieurs tranches sur le même filtre, ou si vous le souhaitez, vous pouvez n’en mettre qu’une seule. Je vais mettre plusieurs tranches sur ce filtre.Ensuite, il est important d’éliminer ici ce milieu excédentaire que vous avez transféré. Je vais donc simplement aspirer le milieu supplémentaire que j’ai transféré avec les tranches, car vous ne souhaitez pas trop de milieu dans ces boîtes, sinon les tranches seraient recouvertes de milieu et ne survivraient pas aussi longtemps, n’ayant généralement pas assez d’oxygène. Voilà, j’ai retiré le milieu excédentaire et mes tranches sont désormais posées dans cette boîte ; elles sont prêtes à être placées dans l’incubateur.Très bien, ces tranches sont maintenant prêtes à être placées dans l'incubateur à 37 degrés. Elles doivent rester viables pendant cinq à sept jours. Nous changeons le milieu environ tous les trois jours, en renouvelant la moitié du milieu et en le remplaçant par du milieu frais.Je vais donc simplement placer ces cultures dans l'incubateur. Très bien, c'est terminé. Nous avons tout fini.Nous utilisons donc cette technique dans notre laboratoire pour étudier divers aspects du développement cortical, notamment les divisions des progéniteurs et la migration neuronale. Cette technique peut être particulièrement utile associée à la microscopie en temps réel, ce qui permet de suivre les cellules individuelles lorsqu'elles se divisent et migrent dans votre culture de tranches.

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