Analyse automatisée des Sholl morphologie neuronale numérisés à de multiples échelles

Ce vidéo montre une procédure permettant d'analyser la morphologie des dendrites et des axones, collectivement appelés neurites, à l'aide d'un programme semi-automatisé afin d'observer les changements locaux. Le logiciel First Neuron J est utilisé pour tracer des images TIFF 8 bits de neurones afin d'identifier la position des segments de neurites. Le logiciel Neuron Studio est ensuite utilisé pour définir les informations structurelles concernant la connectivité entre les neurites.

Enfin, le programme MATLAB bonfire est exécuté pour extraire les données morphologiques des cellules, incluant l'analyse shoal, ainsi que le nombre de points de branchement des neurites et le nombre d'extrémités des neurites. Les résultats montrent des changements locaux dans la morphologie des neurites, basés sur la performance de l'analyse shoal effectuée sur des sous-régions de l'arborisation neuronale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse shoal manuelle, réside dans le caractère semi-automatisé du programme, ce qui augmente considérablement l'efficacité de l'analyse et permet une vérification des données afin d'en contrôler la précision.

La procédure sera démontrée par Hirsch AWA, étudiant de licence travaillant au laboratoire Firestein pendant l'été. Afin d'utiliser le programme Bonfire pour analyser les caractéristiques morphologiques des neurites, des images TIFF 8 bits de neurones individuels doivent être obtenues après avoir téléchargé le programme Bonfire. Les paramètres du programme doivent être ajustés en fonction de la résolution d'image des images que vous souhaitez analyser ; dans la section Paramètres Bonfire du programme Bonfire, remplacez la valeur actuelle de la variable picks conversion par la valeur de la résolution d'image de vos images.

Pour que bonfire puisse analyser les données, les fichiers doivent être organisés selon une structure spécifique, comprenant un dossier principal, un dossier bonfire contenant les fichiers MATLAB M de bonfire, des sous-dossiers contenant chacun des différents conditions, et les fichiers d'images cellulaires situés à l'intérieur des dossiers correspondant aux différentes conditions. Commencez par préparer l'image pour le traçage. Pour cette expérience, seules les dendrites seront tracées afin d'analyser les modifications de la morphologie dendritique. Commencez par préparer l'image pour le traçage.

Ouvrez l'image en sélectionnant le bouton d'ouverture dans la barre d'outils neuron J, puis choisissez l'image que vous souhaitez tracer. Redimensionnez maintenant l'image en cliquant sur le bouton de maximisation afin d'ajuster la luminosité et le contraste de l'image, de manière à visualiser tous les neurites. Sélectionnez l'image dans la barre d'outils neuron J, puis choisissez ajuster la luminosité et le contraste. Pour commencer le traçage, cliquez sur le bouton ajouter des tracés dans la barre d'outils neuron J, puis tracez autour du périmètre du corps cellulaire.

Ensuite, sélectionnez le bouton de traçage des étiquettes dans la barre d'outils neuron J, choisissez N un dans le menu déroulant d'ID de traçage, sélectionnez le type zéro six dans la fenêtre d'attributs neuron J, puis cliquez sur OK. Pour commencer le traçage des neurites, sélectionnez le bouton ajouter des tracés dans la barre d'outils neuron J et ajoutez un tracé le long de chaque branche de neurite d'intérêt. Il est préférable que les segments que vous dessinez s'arrêtent à chaque point de branchement, chaque branche fille démarrant à ce point comme un nouveau tracé.

Sélectionnez le bouton « enregistrer les tracés » dans la barre d'outils neuron J et enregistrez le tracé que vous venez de créer dans le même dossier que le fichier image d'origine. Ensuite, exportez les fichiers de tracé et les fichiers d'identifiants de tracé depuis neuron J. Sélectionnez le bouton « exporter le tracé » dans la barre d'outils neuron J. Choisissez maintenant l'option « fichiers texte séparés avec délimitation par tabulations, un fichier par tracé » dans la boîte de dialogue d'exportation de neuron J, puis cliquez sur « OK ». Laissez neuron J choisir les noms des fichiers et l'emplacement d'enregistrement.

Sélectionnez le bouton « measure tracings » dans la barre d'outils neuron J, puis choisissez l'option « display tracings measurements » dans la fenêtre de mesures neuron J et sélectionnez « run Select file » dans la fenêtre de tracés neuron J, puis sélectionnez « save as » et enregistrez le fichier. Le nom du fichier doit correspondre exactement au nom du fichier image d'origine, suivi de « _info », et ne doit pas comporter d'extension de fichier à trois lettres. Vérifiez que votre ordinateur n'ajoute pas automatiquement une extension de fichier XLS.

S'il existe, l'extension du fichier doit être supprimée manuellement. Tout d'abord, réorganisez les dossiers à l'aide de la commande bonfire load en ouvrant Matlab, puis en cliquant sur le bouton avec les trois points dans le coin supérieur droit de la fenêtre de commande. Sélectionnez le dossier bonfire dans votre dossier principal dans la fenêtre « Parcourir pour le dossier », saisissez bonfire load dans la fenêtre de commande, puis appuyez sur Entrée.

Sélectionnez le dossier de condition que vous souhaitez analyser dans la fenêtre de navigation, puis cliquez sur OK. Ceci réorganisera la structure des dossiers en créant des sous-dossiers cellulaires contenant toutes les données pour chaque cellule individuelle. Pour créer des fichiers avec un nom de fichier suivi de « underscore premium swc », saisissez bonfire_underscore_NDF_two_s_WC dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrée.

Sélectionnez le même dossier de condition qui vient d'être réorganisé avec le chargement de bonfire dans la fenêtre de navigation vers le dossier, puis cliquez sur OK. Cela créera un fichier WC dans chaque dossier de cellule pour la condition choisie. Chaque dossier de cellule contiendra cinq fichiers.

L'image TIF d'origine, le fichier NDF, les informations de soulignement, le fichier d'identification des traces, un fichier TXT et un fichier swc. Avant d'utiliser Neuron Studio, nous vous recommandons de vous familiariser avec les fonctionnalités et les raccourcis du programme. Ils disposent d'un excellent manuel utilisateur en ligne, et la connaissance des raccourcis clavier vous fera gagner beaucoup de temps.

Pour commencer, ouvrez le programme NeuronStudio et sélectionnez Fichier Ouvrir dans la barre d'outils de NeuronStudio, puis recherchez l'image TIF du neurone que vous souhaitez modifier et ouvrir. Sélectionnez Paramètres d'exécution et saisissez un dans chacune des trois cases.

Dans la fenêtre de taille du voxel, sélectionnez l'importation de fichier s wc. Sélectionnez le fichier s WC approprié qui correspond au fichier avec lequel vous souhaitez travailler. Le fichier image sera désormais superposé à l'image de traçage.

Le corps cellulaire doit être recouvert d'un cercle rouge afin de relier les neurites. Utilisez l'outil neurite pour joindre les nœuds de manière à ce que chaque point de branchement, représenté par des nœuds jaunes, ne puisse créer que deux branches. Toutes les tracés doivent être continus avec le soma.

Maintenant, pour exporter les données de Neuron Studio, sélectionnez Fichier, Enregistrer les neurites, puis enregistrez sous le nom par défaut. Pour vérifier les erreurs dans les fichiers swc, saisissez bonfire trace. Accédez à la fenêtre de commande et appuyez sur Entrée. Sélectionnez le dossier correspondant à la condition contenant les données qui viennent d'être traitées dans la fenêtre Parcourir pour le dossier, puis cliquez sur OK. S'il existe des erreurs dans l'une des images du dossier, celles-ci seront indiquées.

Le programme produira des images indiquant l'emplacement de l'erreur afin d'extraire les données morphologiques à partir des fichiers dot S WC. Saisissez bonfire dans la fenêtre de commande et appuyez sur Entrée. Sélectionnez le dossier de condition que vous souhaitez analyser dans la fenêtre Parcourir pour le dossier, puis cliquez sur OK pour chacun des neurones d'intérêt.

L'analyse bonfire produira un graphique de la morphologie neuronale accompagné des anneaux latéraux utilisés dans l'analyse. De plus, la commande bonfire générera le fichier MAT contenant toutes les informations morphologiques extraites de l'analyse. Pour visualiser les graphiques préliminaires des résultats, saisissez bonfire results dans la fenêtre de commande MATLAB, sélectionnez le dossier de condition correspondant à la condition à afficher dans la fenêtre de navigation vers le dossier, puis cliquez sur OK.

La fenêtre de navigation vers le dossier se fermera temporairement puis se rouvrira pour permettre la sélection de conditions supplémentaires. Une fois les conditions sélectionnées, cliquez sur « Annuler » pour quitter le processus de sélection. Le résultat de Bonfire affichera des graphiques récapitulatifs incluant les données provenant des dossiers de conditions que vous avez sélectionnés pour exporter les données morphologiques vers Excel. Exportez vers la fenêtre de commande MATLAB.

Sélectionnez le dossier de condition contenant les données que vous souhaitez exporter dans la fenêtre de navigation des dossiers, puis cliquez sur « OK ». Bonfire Export créera des fichiers Excel contenant les données morphologiques et les placera dans le dossier de condition sélectionné. Nous allons maintenant vous montrer un exemple des données générées par le programme Bonfire sur un jeu de données comprenant deux conditions.

Voici des exemples d'images inversées pour les deux conditions. On peut observer sur ces images que la condition un contient plus de dendrites que la condition deux. Ce phénomène peut également être observé sur divers graphiques générés par le programme bonfire.

Étant donné que le programme bonfire effectue son analyse sur des sous-régions des dendrites, les dendrites accrues dans la condition un peuvent être facilement identifiées ; tracer la courbe du total de l'arborisation dendritique montre qu'il existe davantage de dendrites distales par rapport au corps cellulaire pour les neurones de la condition un. Tracer le nombre moyen de points de branchement et de points terminaux par cellule indique que la condition un contient à la fois plus de points de branchement et plus de points terminaux que la condition deux. Le nombre moyen de prolongements par cellule est indiqué pour les dendrites primaires, secondaires, tertiaires ou d'ordre supérieur. Il existe davantage de dendrites tertiaires et d'ordre supérieur dans la condition un. Tracer le nombre moyen de prolongements par cellule pour les dendrites racines, intermédiaires et terminales montre que la condition un possède plus de prolongements intermédiaires ou terminaux que la condition deux.

Les courbes d'analyse de banc spécifiques à l'identité des segments sont présentées ici, les segments étant regroupés en primaire, secondaire ou tertiaire et plus. L'augmentation des dendrites tertiaires se produit au niveau distal du corps cellulaire pour les neurones de la condition un. Les courbes d'analyse de banc spécifiques à l'identité des segments sont montrées, les segments étant regroupés en segments racines, segments intermédiaires ou segments terminaux.

L'augmentation des dendrites intermédiaires et terminales dans la condition un se produit de façon distale par rapport au corps cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une analyse de banc à l'aide du programme bonfire afin d'observer les changements locaux de la neuro-morphologie.