Utiliser l'imagerie Bioluminescent chargé d'enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

L’objectif global de cette procédure est de surveiller l’effet de la grippe, une infection virale, sur la progression de la pneumonie à S chez les souris nouveau-nées colonisées de manière asymptomatique. Les premières tiges infectieuses sont préparées en cultivant les organismes dans une culture en bouillon standard. Dans le cas de S pneumoniae bioluminescente, ou dans les œufs de poule pour la grippe a, des souris âgées de cinq jours sont ensuite colonisées par S pneumoniae par infection intranasale.

Une fois que les souris ont entre huit et 14 jours, elles sont soit infectées par la grippe A, soit faussement infectées. L’imagerie bioluminescente in vivo peut ensuite être utilisée pour surveiller la dissémination de la pneumonie S dans les poumons de souris co-infectées. Avec la grippe A, on peut finalement obtenir des résultats qui montrent une exacerbation et une dissémination de S pneumoniae bioluminescents.

Dans le cas de la grippe, un virus a infecté des souris infantiles. Ainsi, le principal avantage de l’utilisation de cette technique par rapport à d’autres techniques couramment utilisées, telles que la dissection d’animaux à chaque moment après l’euthanasie, est que vous pouvez suivre l’infection chez le même animal au fil du temps. Le deuxième avantage majeur est que vous pouvez suivre la cinétique de l’infection dans l’organe ou d’autres sites qui ne sont pas aussi facilement accessibles, comme l’oreille moyenne.

La démonstration des procédures sera faite par mon collègue Patrick Redding, qui est chercheur principal dans le département, Kirsty Short, qui est étudiante de troisième cycle dans mon laboratoire, et moi-même. Culture de bioluminescent. S pneumoniae recueille une seule colonie bactérienne, inocule la colonie dans une bouteille McCartney stérile contenant 10 millilitres de bouillon Todd Hewitt.

Complété par 0,5 % d’extrait de levure et un morceau de sang Auger et incuber. La culture statique à 37 degrés Celsius. Une fois que la densité optique de la culture à 600 nanomètres atteint 0,4 à 0,45, placez la culture sur de la glace humide et incubez-la pendant cinq minutes.

Placer la culture sur de la glace arrêtera la croissance des cellules bactériennes et maintiendra les cellules dans cette phase de croissance. Pour déterminer le titre infectieux de la plaque de crosse, dilution en série de la crosse sur des plaques de tarière de sang et incubation des plaques à 37 degrés Celsius. Pendant 18 à 24 heures, la concentration de bactéries viables dans le stock peut être dérivée de la colonie résultante.

Comptez pour stocker le stock bactérien, ajoutez un millilitre de glycérol stérile à 80 % à la culture de 10 millilitres. Faites des aliquotes de 200 à 500 microlitres et conservez les échantillons à moins 70 degrés Celsius. Un virus est cultivé dans le liquide aoïque d’œufs de poule embrétés âgés de 10 jours par perçage.

Un petit trou dans le virus de la coquille de l’œuf est injecté dans la cavité d’Allan Toic via le sac d’air. Afin de localiser la cavité d’Allan Toic, allumez d’abord l’œuf à la bougie en plaçant une source de lumière sur l’œuf. Marquez l’emplacement du sac d’air en un point exempt de veines avec de l’éthanol à 70 %.

Désinfectez la surface de l’œuf avec le scribe bijoutier qui perce un petit trou dans la coquille de l’œuf au niveau du sac d’air juste au-dessus de la marque. Positionnez l’œuf avec le trou vers le haut. Porte-oeuf en carton.

Remplissez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26, 100 microlitres de virus. Passez l’aiguille à travers le trou et, pointant directement vers le bas, percée à travers le sac aérien dans la cavité Alan Toic sous-jacente où le virus peut être distribué, retirez soigneusement l’aiguille à l’aide de cire fondue. Fermez le trou dans la coquille de l’œuf et placez l’œuf dans un incubateur d’œufs humidifié.

Réglé à 35 degrés Celsius. Après une incubation de deux jours, retirez l’œuf et mettez-le à la bougie pour surveiller la viabilité de l’embryon. Si les vaisseaux sanguins sont visibles, l’embryon est vivant.

Si l’intérieur de l’œuf est noir, l’embryon est mort et l’œuf doit être jeté. Incuber l’œuf pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour tuer l’embryon tout en resserrant les vaisseaux sanguins. Cela aidera à préserver l’intégrité des vaisseaux sanguins et à minimiser la perte de virus qui peut se produire si les particules virales entrent en contact avec le sang et lient les globules rouges.

Une fois que l’embryon a été tué, le liquide Alan Toic peut être récolté. Désinfectez la surface de l’œuf avec de l’éthanol à 70 %. Retirez le sceau de cire et, à l’aide de ciseaux incurvés, coupez le haut de l’œuf pour retirer le sac d’air au-dessus de la membrane Alan Toic.

À l’aide d’une pince stérile, percez et décollez la membrane, exposant ainsi le liquide. Utilisez une pipette pour tenir l’embryon d’un côté et une autre pipette de 10 millilitres. Pour récolter le liquide Alan Toic, recueillez et extrayez le liquide de plusieurs œufs dans un tube conique de 50 millilitres.

Jetez tout liquide s’il est contaminé par une centrifugeuse de jaune ou de sang, les fluides Alan Toic accumulés à 2000 tr/min pendant cinq minutes pour éliminer les débris de granulés, recueillir le surnageant, l’aliquote dans des tubes cryogéniques d’un à deux millilitres et le stocker à moins 70 degrés Celsius. Le titre viral des aliquotes peut être déterminé par dosage sur plaque, décongélation, une aliquote congelée de S pneumoniae bioluminescente et diluée à 2000 UFC par inoculum de trois microlitres dans un PBS stérile, prélever délicatement une souris de cinq jours en la tenant debout. Utilisez une pipette stérile pour déposer trois microlitres de bactéries ou de PBS pour simuler les infections sur les narines.

Une fois que tout l’inoculum a été inhalé, remettez la souris dans la cage trois à neuf jours après la colonisation. Avec la pneumonie S bioluminescente, les souris peuvent être infectées par la grippe. Un virus décongèle d’abord une aliquote de liquide aoïque infecté et dilué à 20 PFU par inoculum de trois microlitres dans du PBS stérile, comme indiqué pour la pneumonie à S.

Répétez l’infection intranasale comme indiqué précédemment. Le liquide Alan Toic provenant d’œufs non infectés peut être utilisé pour simuler des infections. Préparez une solution anesthésique de 0,75 milligramme par millilitre de kétamine et de 1,76 milligramme par millilitre de xylazine dans de l’eau injectable.

Injectez la solution anesthésique dans la cavité péritonéale de la souris en utilisant 100 microlitres pour 10 grammes de poids corporel. Une fois la souris complètement anesthésiée, placez-la à l’intérieur du boîtier d’imagerie en positionnant soigneusement la région anatomique d’intérêt parallèlement à la caméra. Une image ventrale permettra de visualiser les voies respiratoires tandis qu’une image latérale fournira une capture plus sensible des oreilles.

Placez la boîte contenant la souris à l’intérieur de l’IVIS et laissez entrer le fluor Isof à un débit de 0,5 litre par minute. Pour maintenir l’anesthésie, réglez l’appareil IVIS sur la bonne plate-forme d’imagerie et Benning pour préparer la capture d’image. Réglez le temps d’imagerie sur sept minutes et démarrez l’imagerie pendant que sept minutes suffisent pour les souris C 57 black six de 20 jours infectées par notre souche bioluminescente S pneumoniae.

Le moment optimal de capture peut varier en fonction de la force et de l’emplacement du signal, ainsi que de la souche de souris ou de bactérie utilisée. Une fois l’imagerie terminée, transférez la souris dans une boîte de préchauffage à l’aide d’un coussin chauffant et laissez-la récupérer de l’anesthésique avant de la remettre dans sa cage. Les images peuvent être analysées à l’aide du progiciel d’images vivantes version 3.0 de Caliper Life Sciences chez des souris, colonisées uniquement par une pneumonie S et co-infectées avec du liquide stérile Alan Toic.

De faibles niveaux variables de luminescence sont détectables à partir de la région nasale, trois jours et quatre jours après l’infection. En revanche, les souris infectées à la fois par la pneumonie et la grippe. Un signal de luminescence fort peut être détecté dans toute la région nasopharyngée et l’intensité et la taille du signal de luminescence augmentent du troisième au quatrième jour après l’infection par la grippe.

Conformément au signal de bioluminescence plus fort, la charge bactérienne dans la cavité nasale des animaux co-infectés est environ 100 fois plus élevée que celle d’un animal colonisé. Dans le cas de la pneumonie S uniquement, un virus peut être détecté dans le nez et les poumons d’animaux infectés. Comme le montre le tableau, le titre du virus de la grippe A est similaire dans le nez et les poumons de l’animal co-infecté au quatrième jour après l’administration intranasale du virus.

Ainsi, en suivant cette méthode, des méthodes telles qu’un dosage de la plaque virale ou un gage de tissu homogène peuvent être utilisées pour obtenir une détermination plus précise de la charge virale et de la charge bactérienne dans les tissus d’intérêt.