Name: Western Blot: préparation déchantillons à la détection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Apprenez le Western blot pour la détection de protéines spécifiques en biochimie. Cette méthode couvre la préparation des échantillons, l'électrophorèse, le transfert sur membrane et la détection par anticorps.

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1. Préparation des échantillons La première étape de Western blot est la préparation d&#39;échantillons. Pour préparer les échantillons pour l&#39;exécution d&#39;un gel de cellules et de tissus doivent être lysées pour libérer les protéines d&#39;intérêt. <ul><li> Une pratique, prêt à utiliser de réactifs qui est polyvalent et facile à utiliser pour l&#39;extraction des protéines solubles est CytoBuster ou PhosphoSafe. Ces tampons d&#39;extraction contiennent des détergents optimisé pour une extraction efficace des protéines solubles provenant de cellules de mammifères et d&#39;insectes. Le doux, non ioniques de composition de réactif CytoBuster Extraction des protéines permet l&#39;isolement des actifs endogènes fonctionnellement ou protéines exprimées sans avoir besoin d&#39;un traitement secondaire tels que sonication ou de gel / dégel. PhoshoSafe a l&#39;avantage de contenir quatre inhibiteurs de phosphatase. <ol><li> Pellet les cellules par centrifugation à faible vitesse (par exemple 5 min à 2500 xg), égoutter le culot cellulaire ainsi. </li><li> Resuspendre les cellules dans le réactif CytoBuster Extraction des protéines en utilisant 150 pi par 10 6 cellules (quantité optimale de réactif CytoBuster Extraction des protéines peut varier en fonction de la taille des cellules). </li><li> Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Transférer dans un tube approprié et de spin pendant 5 min à 16000 xg à 4 ° C. </li><li> Transfert effacé surnageant (extrait cellulaire) dans un nouveau tube et procéder à l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Pour l&#39;extraction des protéines spécialisées, nous recommandons d&#39;utiliser notre haute qualité Kits ProteoExtract. EMD a plus d&#39;une douzaine des kits pour l&#39;isolement des mitochondries, l&#39;extraction du protéome subcellulaire, l&#39;extraction des protéines transmembranaires, et bien d&#39;autres. S&#39;il vous plaît visitez notre page d&#39;atterrissage Ouest blot pour plus de détails. </li><li> EMD vend également une grande variété de protéase et inhibiteur de phosphatase ensembles cocktail. Dès que survient la lyse, la protéolyse, la déphosphorylation et de dénaturation de commencer. Ces événements peuvent être considérablement ralentie si les échantillons sont conservés sur la glace ou à 4 ° C en tout temps et les inhibiteurs appropriés sont ajoutés frais à la mémoire tampon de lyse. S&#39;il vous plaît visitez notre page d&#39;atterrissage Ouest blot pour plus de détails. </li></ul> 2. SDS-PAGE La deuxième étape du Western blot est la séparation des protéines. Les protéines sont séparées en fonction du poids moléculaire. <ul><li> Vous pouvez faire votre propre gel PAGE, cependant, nous allons utiliser une commercialement préfabriqués gel. <ol><li> Après la préparation de votre échantillon, vous êtes prêt à déterminer la concentration en protéines. EMD a deux kits pour ce pour mesurer la concentration, l&#39;un étant le Kit de non-ingérence et de protéines Assay l&#39;autre étant le kit BCA Protein Assay. </li><li> Une fois que la concentration en protéines est évaluée, nous sommes prêts à préparer notre échantillon pour le chargement du gel. Anticorps reconnaissent généralement une petite portion de la protéine d&#39;intérêt (appelé l&#39;épitope) et ce domaine peut résider dans la conformation 3D de la protéine. Pour permettre l&#39;accès de l&#39;anticorps à cette partie, il est nécessaire de déplier la protéine. </li><li> Pour dénaturer, utilisez un tampon de chargement avec le sulfate de détergents anioniques dénaturant dodécylsulfate de sodium (SDS), et faire bouillir le mélange à 95-100 ° C pendant 5 minutes. Un tampon de chargement facile et pratique à utiliser est tampon d&#39;échantillon 4X. </li></ol></li><li> Chargez la première voie du puits avec marqueur protéique Trail Mix. Ce marqueur a trois bandes de référence qui vous permettent de surveiller l&#39;électrophorèse. Lorsque le gel est coloré, les bandes 10 sont visibles allant de 10 à 225 kDa. </li><li> Remplir l&#39;appareil d&#39;électrophorèse avec beaucoup d&#39;tampon. Pour les gels PAGE, ce n&#39;est généralement 1X Tris-glycine. Pour les recettes de mémoire tampon détaillées, visitez la page Western blot. EMD offre de haute qualité réactifs tampons avec notre ligne de produit chimique OmniPur. Exécutez le gel à 220 pendant 1 heure. </li><li> Une fois que les protéines sont séparés, le gel coloration au bleu de Coomassie pour assurer les protéines ont migré équitablement et uniformément. RAPIDstain est une tache ultra-sensible qui est prêt à utiliser. Pas de décoloration est nécessaire. </li></ul> 3. La protéine de transfert Tout comme les protéines avec une charge électrique peut être amené à voyager à travers un gel dans un champ électrique, ne peut donc les protéines être transféré dans un champ électrique à partir du gel sur une membrane, étant soit PVDF ou de nitrocellulose. <ul><li> Aujourd&#39;hui, nous allons faire un transfert humide. En transfert humide, le gel et la membrane sont pris en sandwich entre une éponge et du papier (éponge / papier / gel / membrane / papier / éponge) et tous sont serrés ensemble, après s&#39;être assuré de bulles d&#39;air ont formé entre le gel et la membrane. Le sandwich est immergé dans du tampon de transfert à laquelle un champ électrique est appliqué. Les protéines chargées négativement de voyage vers l&#39;électrode chargée positivement, mais la membrane ne les arrête, les lie, et les empêche de continuer le. </li><li> Deux types de membranes sont disponibles: la nitrocellulose et de PVDF. Les deux fonctionnent bien. Aujourd&#39;hui, nous allons utiliser le PVDF. Membranes PVDF nécessitent trempage dans méthanol pour quelques minutes, suivi par du tampon de transfert de la glace froide pendant 5 minutes. Le gel a également besoin de s&#39;équilibrer pendant quelques minutes dans un tampon de transfert de la glace froide. Ne pas le faire peut rétrécir le gel pendant le transfert. </li><li> Le tampon pour le transfert par voie humide est 1X Tris-glycine avec 20% de méthanol. Les préparatifs de tampon détaillées sont disponibles sur notre site Web. </li><li> Une fois le transfert est terminé, c&#39;est une bonne idée de visualiser des protéines pour assurer le transfert, même avec des poches d&#39;air. Cela peut se faire facilement avec RedAlert Western Blot Stain. Cette tache est prêt à utiliser et de décoloration peut se faire facilement avec de l&#39;eau. </li></ul> 4. Les anticorps et les réactifs accessoires <ul><li> La première étape en faisant sonder et d&#39;anticorps à l&#39;antigène est de bloquer la membrane. Blocage de la membrane empêche la liaison de fond non spécifique. </li><li> Soit non gras du lait ou des BSA peut être utilisé comme une solution de blocage. Toutefois, lorsque vous utilisez anticorps phospho-spécifiques, il n&#39;est pas recommandé d&#39;utiliser du lait car cela fera de fond élevé. </li><li> EMD offre plusieurs de haute qualité réactifs de blocage, notamment SeaBlock, qui est un agent non-bloquant et de mammifères QuickBlocker BLOT, qui est préparé, prêt à utiliser bloquant. Nous avons aussi de haute qualité BSA (Fraction V) disponibles. <ol><li> Incuber la membrane 1 heure à température ambiante sous agitation douce. </li><li> Laver trois fois dans TBST ou PBST après incubation. Un moyen facile et pratique de faire ou de TBST PBST est d&#39;utiliser notre comprimés (PBS TWEEN Comprimés / SCT Tablets TWEEN) </li></ol></li><li> Une fois la membrane a été bloquée, vous êtes prêt à incuber avec l&#39;anticorps primaire. EMD a été propose un portefeuille étendu d&#39;anticorps exceptionnelle avec la meilleure garantie d&#39;anticorps dans l&#39;industrie depuis plus de 30 ans. N&#39;oubliez pas que tous les anticorps EMD, nous offrons un plein 100% sans risque de garantie. Achat d&#39;un anticorps et l&#39;utiliser pour toute la spécificité d&#39;espèce ou de l&#39;application que vous désirez. Si les anticorps ne fonctionnent pas à votre satisfaction, nous vous fournirons un crédit complet pour être utilisé sur n&#39;importe quel autre produit. Pour plus de détails, s&#39;il vous plaît visitez notre page web occidentaux buvard. <ol><li> Aujourd&#39;hui, nous allons être en incubation de nos anticorps primaire avec une solution d&#39;une SignalBoost. SignalBoost est un excellent produit qui permet à votre signal pour être amélioré de manière significative. Simplement incuber votre anticorps primaire dans la Solution 1 et incuber pendant 1 heure ou comme vous le feriez normalement. Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;ajouter d&#39;autres agents de blocage. Alternativement, vous pouvez utiliser BSA ou poudre de lait écrémé comme agent de blocage. </li><li> Laver avec du TBST. Nous faisons TBST utilisant le prêt-à-dissoudre le comprimé TBST. </li><li> Incuber vos anticorps secondaire en utilisant la solution 2 de SignalBoost. Incuber l&#39;anticorps secondaire dans le tampon de blocage pendant 1 heure. Lavez la membrane à nouveau plusieurs fois avec TBST. </li></ol></li></ul> 5. Détection Pour conjuguer HRP Anticorps secondaires, ECL est traditionnellement utilisé. Un excellent réactif ECL que nous offrons est RapidStep. Les avantages de RapidStep sont que pas de mélange de luminal ou un amplificateur est nécessaire. Il suffit de vaporiser la membrane à quelques reprises et de développer en utilisant les films radiographiques. RapidStep offre une sensibilité faible pictogramme ainsi que émettant de la lumière pour un maximum de 2 heures après l&#39;addition du substrat.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs Anna Eslami et Jesse Lujan sont employés par EMD Chemicals Inc qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans le présent article.

Dans cette vidéo de présentation, nous avons mis en évidence les grandes étapes de Western blot qui sont la préparation des échantillons, SDS-PAGE, la membrane bloquant / sondage avec des anticorps, et de détection. Pour chaque étape du processus, des protocoles et des réactifs appropriés appropriés devraient être utilisés pour atteindre des résultats de haute qualité.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Réactif d'extraction des protéines</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Réactif d'extraction</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dosage protéique sans interférence&amp;#8482; Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit d'analyse des protéines BCA </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tampon d'échantillonnage SDS 4X </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mélange protéiné&amp;#8482; Marqueurs protéiques</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Protéines&amp;#8211;xtract&amp;#8482; Kits d'extraction de protéines</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Produits</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Réactif</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; Coloration pour immunoblotting 10X</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Réactif, plasma de saumon</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Réactif BLOT-QuickBlocker</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albumine, sérique bovine, fraction V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Comprimés</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Comprimés</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Kit d'amélioration de l'immunoréaction</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; Réactif ECL</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

western blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blot est une technique d&#39;analyse utilisée pour détecter des protéines spécifiques dans un échantillon donné d&#39;homogénat de tissu ou de l&#39;extrait. Elle utilise l&#39;électrophorèse sur gel pour séparer les protéines natives ou dénaturées par la longueur du polypeptide (conditions dénaturantes) ou par la structure en 3-D de la protéine (natif / non-dénaturantes). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane (typiquement de nitrocellulose ou PVDF), où ils sont sondés (détectée) utilisant des anticorps spécifiques à la protéine cible.

Western blot est une technique d&#39;analyse utilisée pour détecter des protéines spécifiques dans un échantillon donné d&#39;homogénat de tissu ou de l&#39;extrait.

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Le Western blot est une technique analytique utilisée pour détecter des protéines spécifiques dans un échantillon donné d'homogénat ou d'extrait tissulaire. Elle utilise un gel...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la facilité d'exécution d'un immunotransfert (Western blot) lorsqu'on utilise des produits adaptés. Après la préparation des échantillons, les protéines sont séparées selon leur taille, puis transférées sur une phase solide. Les protéines sont ensuite révélées à l'aide d'anticorps, et leur détection, réalisée selon des protocoles appropriés et à l'aide de réactifs de haute qualité et économiques, permet d'obtenir des résultats améliorés en immunotransfert. Bonjour, je suis Jesse Luhan, scientifique en recherche et développement chez EMD Chemicals à San Diego, en Californie. EMD est une filiale de Merck KGaA à Darmstadt, en Allemagne. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de western blot.Commençons. La première étape du western blot consiste à préparer les échantillons. Commencez par la préparation des échantillons en centrifugeant les cellules à faible vitesse, par exemple cinq minutes à 2 500 ×g.Après centrifugation, éliminer le surnageant des culots cellulaires. Bien resuspendre les cellules dans le réactif d'extraction protéique Cyto buster en utilisant 150 microlitres par 106 cellules. Incuber l'échantillon à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, centrifuger l'échantillon pendant cinq minutes à 16 000 ×g et à quatre degrés Celsius après la centrifugation. Transférer le surnageant clarifié dans un tube neuf et procéder à l'analyse. Une fois la concentration en protéines de l'échantillon déterminée, préparer l'échantillon pour le chargement sur gel afin de dénaturer les protéines.Utilisez un tampon d'échantillonnage contenant un détergent dénaturant anionique tel que le dodécylsulfate de sodium ou SDS. Portez une ébullition le mélange à 95 à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l'aide d'un gel préfabriqué disponible dans le commerce, les protéines peuvent être séparées rapidement selon leur masse moléculaire.Remplissez l'appareil d'électrophorèse avec du tampon de migration, qui peut être préparé à partir des réactifs proposés dans la gamme chimique Omni PU. Chargez la première lame du puits avec le marqueur protéique trail mix. Ce marqueur comporte trois bandes de référence permettant un suivi pendant l'électrophorèse.Une fois le gel coloré, 10 bandes sont visibles, allant de 10 à 225 kilodaltons. Chargez l'échantillon dénaturé dans les puits restants. Faites migrer le gel à 220 volts pendant une heure.Une fois que les protéines se sont séparées, colorer le gel avec du bleu kumasi afin de s'assurer que les protéines ont migré de manière uniforme et régulière, en utilisant une coloration rapide et ultrasensible, prête à l'emploi, sans qu'une coloration DS soit nécessaire. De même que les protéines chargées électriquement peuvent être induites à migrer à travers un gel sous l'effet d'un champ électrique, elles peuvent être transférées, sous l'effet d'un champ électrique, du gel vers une membrane telle que la nitrocellulose ou le PVDF. Lors de l'utilisation de membranes en PVDF, les imbiber dans du méthanol pendant quelques minutes, puis les équilibrer dans du tampon de transfert glacé pendant cinq minutes. Imbiber également le gel pendant quelques minutes dans du tampon de transfert glacé ; cette étape d'équilibrage empêche le rétrécissement du gel pendant le transfert.Pour un transfert humide, assemblez un sandwich composé du gel et de la membrane entre une éponge et du papier. Ensuite, serrez fermement l'ensemble après vous être assuré qu'aucune bulle d'air ne s'est formée entre le gel et la membrane. Plongez le sandwich dans du tampon de transfert et appliquez un champ électrique.Les protéines chargées négativement migrent vers l'électrode chargée positivement. La membrane les arrête ensuite, les fixe et les empêche de progresser davantage. Une fois le transfert terminé, visualisez les protéines afin de vérifier un transfert uniforme, sans poches d'air.Cela peut facilement être réalisé avec le colorant rouge d'alerte pour immunoblot. Ce colorant est prêt à l'emploi et la décoloration peut être effectuée facilement à l'eau. Il s'agit du gel une fois qu'il a été décoloré par lavage à l'eau. Avant que la membrane ne soit révélée par un anticorps, celle-ci est bloquée.Pour éviter la liaison non spécifique, bloquez la membrane avec des réactifs de blocage de haute qualité. Pour prévenir un fond élevé, incubez-la dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante sous agitation douce, puis lavez la membrane trois fois dans du TBST ou du PBST après l'incubation. Ces tampons peuvent être préparés facilement et commodément à l'aide respectivement de comprimés TBS tween et de comprimés PBS tween.Une fois que la membrane a été bloquée et lavée, elle peut être incubée avec l'anticorps primaire. Appliquez l'anticorps primaire à l'aide de la solution, l'un des amplificateurs de signal, ce qui permet d'amplifier considérablement le signal. Préparez l'anticorps primaire dans la solution un et incubez la membrane pendant une heure.Il n'est pas nécessaire d'ajouter d'autres agents de blocage après l'incubation. Lavez la membrane avec du TBST. Ensuite, incubez la membrane avec l'anticorps secondaire dilué dans la solution deux du signal boost pendant une heure.Enfin, lavez à nouveau la membrane plusieurs fois avec du TBST pour la détection des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase (HRP) par chimiluminescence améliorée ou ECL, méthode traditionnellement utilisée ici. L'étape rapide du réactif ECL est employée car elle ne nécessite aucun mélange de luminol ou d'agent amplificateur.Il suffit de pulvériser la membrane plusieurs fois, de l'incuber pendant deux minutes, puis de la révéler à l'aide d'un film radiographique. Rapid Step offre une sensibilité de l'ordre du pictogramme ainsi qu'une émission lumineuse durable jusqu'à deux heures après l'ajout du substrat. Les marqueurs protéiques Trail mix permettent le suivi des protéines durant l'électrophorèse, par comparaison avec les protocoles standards de transfert Western blot.Signal Boost permet une gamme dynamique et une sensibilité accrues. Enfin, une sensibilité supérieure peut être obtenue en utilisant le réactif Rapid au lieu des réactifs ECL traditionnels. Nous venons de vous montrer comment réaliser un immunoblotting de manière efficace et économique à l'aide d'une gamme complète de produits.N'oubliez pas que la qualité de vos résultats dépend de la qualité de vos réactifs. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Cet article technique décrit un standard occidental buvard procédure en utilisant l'électrophorèse commercialement disponibles NuPAGE Mini-Gel du système d'Invitrogen.

Western blot en utilisant l&#39;Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Immunoblot (western blot) est un test rapide et sensible pour la détection et la caractérisation des protéines qui fonctionne en exploitant la spécificité inhérente à la reconnaissance antigène-anticorps. Cette vidéo fournit des protocoles de séparation des protéines, des protéines sur des membranes de blotting, immunoprobing, et la visualisation en utilisant des substrats chromogènes ou chimioluminescence.

Analyse immunoblot

Cette vidéo présente une technique de transfert de points quantitatifs, ou QDB, pour la quantification absolue des protéines d’intérêt dans un échantillon de tissu. Les protéines de l’échantillon sont immobilisées sur la membrane de nitrocellulose à l’intérieur des puits d’une plaque QDB. À l’aide d’anticorps spécifiques à la protéine cible marqués avec une enzyme peroxydase, un substrat chimiluminescent est oxydé pour produire de la lumière, qui est mesurée pour déterminer la concentration en...

Transfert de points quantitatif pour estimer les protéines cibles dans un lysat tissulaire

La vidéo présente une technique de transfert Western basée sur la normalisation des protéines totales pour quantifier l’expression de la protéine cible dans un échantillon. En utilisant la coloration protéique totale de l’échantillon, une analyse ratiométrique est effectuée pour déterminer le niveau d’expression relatif de la protéine cible.

Transfert Western quantitatif pour estimer les niveaux d’expression des protéines

Cette vidéo décrit le transfert western basé sur la chimiluminescence des lysats immunoprécipités. La technique aide à déterminer le traitement et l’activation des protéines. Le signal chimiluminescent détecté est proportionnel au niveau de traitement des protéines lors de son activation.

Dosage par transfert Western chimiluminescent pour le traitement des protéines

Ce protocole explore les dernières avancées dans l'exécution des analyses Western blot. Ces nouvelles modifications utilisent un système de gel Bis-Tris avec une électrophorèse temps de fonctionnement de 35 min, un système de transfert de buvard sec 7 min, et la détection de la protéine fluorescente infrarouge et l'imagerie qui génère de plus haute résolution, la qualité, la sensibilité et l'amélioration de la précision des données occidentaux.

Le plus rapide de l&#39;Ouest dans la ville: une touche contemporaine sur l&#39;analyse classique western blot

L’avancement du western blot à l’aide de la fluorescence a permis de détecter des changements subtils dans l’expression des protéines, permettant des analyses quantitatives. Nous décrivons ici une méthodologie robuste pour la détection d’une gamme de protéines à travers une variété d’espèces et de types de tissus. Une stratégie pour surmonter les problèmes techniques courants est également fournie.

Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage

Cette méthode décrit une approche fiable et reproductible pour la comparaison des niveaux de protéine dans différents tissus et en différents points du développement en utilisant une approche de buvard ouest quantitative standardisée.

Robuste comparaison des niveaux de protéine tissus et partout ailleurs au développement aide à éponger occidental quantitatives standardisées

Cette vidéo montre la préparation d'un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Désorption Ionisation Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

Formol archives fixé et inclus en paraffine (FFPE) échantillons cliniques sont un matériel précieux pour l'étude des maladies. Ici, nous démontrons une préparation flux d'échantillons permettant une analyse en profondeur protéomique des tissus FFPE microdissection.

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Apprenez le Western blot pour la détection de protéines spécifiques en biochimie. Cette méthode couvre la préparation des échantillons, l'électrophorèse, le transfert sur membrane et la détection par anticorps.

Western Blot: préparation d'échantillons à la détection

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