Western Blot: préparation d'échantillons à la détection

L’objectif global de cette procédure est de démontrer la facilité avec laquelle il est possible d’effectuer un transfert Western lorsqu’on utilise des produits appropriés. Après la préparation de l’échantillon, les protéines sont séparées en fonction de leur taille, puis transférées dans une phase solide. Les protéines sont ensuite sondées avec des anticorps et détectées à l’aide de protocoles appropriés, et des réactifs de haute qualité et rentables produisent des résultats améliorés par western blot.

Bonjour, je suis Jesse Luhan, scientifique chez EMD Chemicals à San Diego, en Californie. EMD est une filiale de Merck, KGAA à Dharmstat Allemagne. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de transfert western.

Alors commençons. La première étape du western blot est la préparation de l’échantillon. Commencez la préparation de l’échantillon en granulant les cellules à l’aide d’une centrifugation à basse vitesse, par exemple cinq minutes à 2 500 fois la gravité.

Après la centrifugation, égouttez les granulés de cellules. Eh bien, remettez en suspension les cellules dans le réactif d’extraction de protéine cyto buster en utilisant 150 microlitres par 10 pour les six cellules. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, faites tourner l’échantillon pendant cinq minutes à 16 000 fois la gravité à quatre degrés Celsius après la centrifugation. Transférez le SNA effacé dans un tube frais et procédez à l’analyse. Une fois la concentration en protéines de l’échantillon évaluée, préparez l’échantillon pour le chargement du gel afin de dénaturer la protéine.

Utilisez un tampon d’échantillon contenant un détergent dénaturant onique, tel que le sulfate d’huile de sodium ou le SDS. Faites bouillir le mélange à 95 à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’un gel préfabriqué disponible dans le commerce, les protéines peuvent être rapidement séparées en fonction de leur poids moléculaire.

Remplissez l’unité d’électrophorèse avec un tampon courant, qui peut être fabriqué à partir de réactifs proposés par la gamme chimique Omni PU. Chargez la première allée du puits avec un marqueur protéique à mélange montagnard. Ce marqueur dispose de trois bandes de référence qui permettent un suivi lors de l’électrophorèse.

Une fois le gel coloré, 10 bandes sont visibles, allant de 10 à 225 kilos Daltons. Chargez l’échantillon dénaturé dans les puits restants. Faites fonctionner le gel à 220 volts pendant une heure.

Une fois que les protéines se sont séparées, colorez le gel avec du bleu kumasi pour vous assurer que les protéines ont migré uniformément et uniformément en utilisant une coloration rapide et une coloration ultrasensible, qui est prête à l’emploi sans DS. La coloration est nécessaire tout comme les protéines avec une charge électrique peuvent être induites à voyager à travers un gel dans un champ électrique, de sorte que les protéines peuvent être transférées dans un champ électrique du gel sur une membrane telle que la NITROCELLULOSE ou le PVDF. Lorsque vous utilisez des membranes PVDF, trempez la membrane dans du méthanol pendant quelques minutes, puis équilibrez-la dans un tampon de transfert glacé pendant cinq minutes. Faites également tremper le gel pendant quelques minutes dans un tampon de transfert glacé L’équilibre E empêche le rétrécissement du gel pendant le transfert.

Pour un transfert humide, assemblez un sandwich de gel et de membrane entre l’éponge et le papier. Ensuite, serrez fermement l’ensemble après vous être assuré qu’aucune bulle d’air ne s’est formée entre le gel et la membrane. Immergez le sandwich dans le tampon de transfert et appliquez un champ électrique.

Les protéines chargées négativement se déplaceront vers l’électrode chargée positivement. La membrane les arrête alors, les lie et les empêche de continuer. Une fois le transfert terminé, visualisez les protéines pour assurer un transfert uniforme sans poches d’air.

Cela peut facilement être fait avec une coloration Western blot d’alerte rouge. Cette teinture est prête à l’emploi et la coloration peut être faite facilement avec de l’eau. Il s’agit du gel une fois qu’il a été coloré par lavage à l’eau avant que la membrane ne puisse être prouvée avec des anticorps, la membrane est bloquée.

Pour éviter une liaison non spécifique, bloquez la membrane avec des réactifs de blocage de haute qualité. Pour éviter une augmentation du bruit de fond, incubez-la dans une solution bloquante pendant une heure à température ambiante sous une légère agitation, puis lavez la membrane trois fois dans du TBST ou du PBST après l’incubation. Ces tampons peuvent être fabriqués facilement et commodément à l’aide de tablettes TBS tween et de tablettes PBS tween respectivement.

Une fois que la membrane a été bloquée et lavée, elle peut être incubée avec l’anticorps primaire. Appliquez l’anticorps primaire à l’aide d’une solution d’amplification du signal, qui permet d’améliorer considérablement le signal. Préparez l’anticorps primaire dans la première solution et incubez la membrane pendant une heure.

Il n’est pas nécessaire d’ajouter d’autres agents bloquants après l’incubation. Lavez la membrane avec du TBST. Ensuite, incubez la membrane avec l’anticorps secondaire dilué dans la solution deux de signal boost pendant une heure.

Enfin, lavez à nouveau la membrane plusieurs fois avec du TBST pour HRP conjugué. La détection d’anticorps secondaires par chimiluminescence améliorée ou ECL est traditionnellement utilisée ici. L’étape rapide du réactif ECL est utilisée car elle ne nécessite aucun mélange de luminol ou d’exhausteur.

Il suffit de vaporiser la membrane plusieurs fois, d’incuber pendant deux minutes et de la développer à l’aide d’un film à rayons X. Rapid Step offre une faible sensibilité au picogramme ainsi qu’une mission plus légère jusqu’à deux heures après l’ajout du substrat. Les marqueurs protéiques Trail Mix permettent de suivre les protéines pendant l’électrophorèse par rapport aux protocoles standard de Western blot.

Signal Boost permet une plus grande plage dynamique et une plus grande sensibilité. Enfin, une sensibilité supérieure peut être obtenue en utilisant l’étape rapide au lieu des réactifs ECL traditionnels. Nous venons de vous montrer comment effectuer l’aveuglement Western de manière efficace et rentable grâce à une gamme complète de produits.

N’oubliez pas que la qualité de vos résultats dépend de la qualité de vos réactifs. Voilà. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.