En injection intraventriculaire Utero et l'électroporation d'embryons de rat E16

Bonjour, je m'appelle William Ti. Je viens du laboratoire Arnold Creek Stein. Aujourd'hui, moi et d'autres chercheurs allons vous montrer une injection intra-utérine d'embryons de rat au stade E 16. Bonjour, je m'appelle Laura Elias.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment préparer les pipettes de microinjection et les charger pour les injections intraventriculaires et l'électroporation que nous allons réaliser aujourd'hui. Je vais également vous montrer comment effectuer les injections intraventriculaires et l'électroporation chez des embryons de rat à J16. Ainsi, les injections et l'électroporation in utero chez le rat sont particulièrement utiles, car le rat est un système dans lequel les manipulations génétiques ne sont pas aisément réalisables.

D'accord, il existe un certain nombre d'instruments chirurgicaux que nous utilisons pour cette procédure. Nous utilisons un séparateur, deux paires de pinces à épiler, une paire à mâchoires striées et une autre paire présentant une petite dent à l'extrémité. Nous utilisons également une paire de pinces hémostatiques.

Ceci est une paire de ciseaux, puis nous utilisons ces deux agrafeuses. Voici les plus grandes, que nous utilisons pour les rats. Voici la plus petite, que nous utilisons pour les souris, qui utilise une agrafe de taille sept, et celle-ci utilise une agrafe de taille neuf ; elles sont simplement à ressort.

Certains des éléments que nous utilisons ici pour faciliter les interventions chirurgicales comprennent une simple source de lumière à fibres optiques équipée d'une double tête. Nous utilisons un tapis chauffant qui fait circuler de l'eau tiède à l'intérieur afin de maintenir la température. Pour la surface de travail, nous utilisons ce système d'électroporation élective fabriqué par BTX.

Nous disposons de plusieurs tailles différentes de spatules que nous utilisons en fonction de la taille des embryons. Le côté bleu est le côté positif. Très bien, nous allons maintenant affûter nos pipettes d'injection.

Et ceci est très important afin que votre pipette possède une ouverture suffisamment large pour charger votre ADN, mais aussi qu'elle soit très, très fine afin de ne pas endommager l'embryon lors de l'injection. Et si vous endommagez l'embryon pendant l'injection, vous observerez un taux de mortalité beaucoup plus élevé. Ce qui n'est donc pas souhaitable.

Donc, ce processus est en réalité très important dans cette intervention chirurgicale. Tout d'abord, nous allons verser un peu d'eau sur cette pierre de façonnage qui tourne ici. Ensuite, nous allons prendre, voyons ici, simplement un bâtonnet.

Nous allons placer notre pipette, que nous venons de tirer, sur ce bâtonnet à l’aide d’un ruban adhésif. Nous utiliserons l’un de ces micro-manipulateurs pour maintenir la pipette par le tranchant et permettre son affûtage ici. Nous positionnons simplement ceci et nous utilisons un microscope afin de visualiser l’extrémité de la pipette.

Et nous allons simplement le placer dans l'eau, juste au-dessus du biseau formé précédemment, de manière à exercer une légère pression. Vous pouvez voir la pointe appuyer contre la pierre ici. Laissez-le biseauter pendant un certain temps, au moins, disons, 15 minutes.

J'aime les laisser même pendant, vous savez, une heure. Parfois, ils deviennent vraiment, vraiment pointus, mais cela dépend certainement de la personne pour savoir combien de temps ils affûtent leurs pipettes. Très bien, donc ici nous avons, vous pouvez voir en haut une pipette qui a été étirée mais qui n'a pas encore été biseautée.

Donc, bien qu'elle soit pointue, cette pipette ne possède aucune ouverture permettant de charger votre ADN. En revanche, la pipette du bas a été biseautée, et vous pouvez voir cette belle ouverture inclinée, qui vous permettra désormais de charger votre ADN, tout en conservant une extrémité fine afin de réaliser l'injection sans causer de dommages. Très bien, nous allons maintenant remplir nos pipettes d'injection avec de l'ADN.

Il est donc important que vous prépariez votre ADN de manière exempte de pyrogènes afin de ne pas injecter de lipopolysaccharides lorsque vous administrez votre ADN. Nous allons donc prendre notre ADN et, ici, préparer notre paraffine. Vous allez donc préparer votre paraffine à cet endroit et récupérer votre ADN, puis le déposer simplement sous forme d’un petit point sur cette paraffine.

Ensuite, nous allons prendre, pour chaque 10 microlitres de mon ADN — que j'utilise habituellement à une concentration d'environ 1,5 à 1,7 microgrammes par microlitre — environ un microlitre de ce colorant rapide. Ce colorant facilite la localisation de notre injection et nous permet de vérifier que nous avons correctement injecté dans le ventricule.

Ensuite, je vais simplement mélanger ce colorant vert rapide avec mon ADN. Puis vous prenez votre électrode d'injection et nous allons remplir la pipette en tirant sur le piston. Et vous pouvez voir ici que, si la pipette est correcte et possède une ouverture suffisamment grande, l'ADN devrait s'aspirer assez facilement.

Parfois, vous devez simplement déplacer le piston d'avant en arrière pour l'aider à se charger correctement. Ensuite, vous pouvez charger la pipette comme ceci. Nous avons donc chargé complètement l'ADN dans cette pipette, et elle est prête pour l'injection.

D'accord, je vais anesthésier l'animal. Nous utilisons ces cônes de décaptation. Je ramène simplement le bord vers l'arrière pour faciliter la prise en main.

Commençons donc. J'ai l'habitude de simplement le placer au bord de la cage pour former un petit tunnel agréable où il peut entrer comme ceci. Bon, cet animal semble être endormi.

Nous allons effectuer une pincée du orteil pour confirmer cela ; il suffit de saisir l'orteil et de pincer fermement, sans trop forcer. Vous ne voulez pas blesser l'animal, mais simplement vous assurer qu'il est inconscient.

Et cet animal est certainement inconscient. Je vais donc procéder à raser son ventre. Je veux simplement éviter le tétrafil, afin que vous ne coupiez pas les extrémités.

Je pense que cela pourrait être très douloureux pour l'animal. L'animal est donc rasé. Maintenant, je vais l'apporter sous la hotte.

Nous allons la nettoyer et commencer la procédure. OK, nous avons confirmé que cet animal est de nouveau inconscient et nous sommes prêts à commencer par la nettoyer. Ce que je souhaite faire, c'est appliquer un peu de pommade oculaire, simplement pour éviter que ses yeux ne s'assèchent.

Ensuite, nous allons alterner des lavages avec des compresses d’alcool et des compresses d’iode. Nous effectuons cette procédure trois fois, soit trois passages alternés. Nous devons être très délicats afin de ne pas endommager les embryons pendant cette opération.

Vous devez donc effectuer un mouvement vers le bas, puis attendre en revenant en arrière. Ceci est la première étape. Je dois d'abord bien l'humidifier afin de pouvoir effectuer les prélèvements. Bien.

Cela fait deux et cela fait trois. Très bien, nous avons placé cette protection pour aider à la stérilité et maintenant je vais procéder à l'ouverture de l'animal. Commençons par inciser.

Très bien, la première chose que je dois faire est de mettre la stérile. Nous mettons des gants stériles et nous sommes prêts à ouvrir ici. Il faut toujours s'assurer que l'animal est toujours inconscient.

Je vais donc effectuer une autre pincée au niveau de l'orteil, et nous répéterons cela tout au long de la procédure. Habituellement, je pince légèrement un peu de tissu, je fais une incision rapide, je le saisis par le haut et je coupe vers le bas, puis je prends une autre paire de forceps, et j'écarte le tissu.

Ensuite, vous saisissez le muscle souhaité et incisez précisément sur la ligne médiane afin de ne pas toucher de vaisseaux ni de nerfs. Veillez à ne pas saisir trop fermement. On dirait que nous avons un bon rendement ici.

Je veux m'assurer de bien le lubrifier afin qu'il ne se dessèche pas. Et j'ajoute une autre goutte pour être certain que tout est en ordre, et tout semble correct. J'oriente toujours ces embryons pour Laura, et ce que je fais habituellement, ou plutôt ce que je fais toujours, c'est de positionner la tête de l'embryon du côté droit de la rate mère, simplement pour assurer une uniformité.

Je vais donc commencer maintenant. Ici, nous pouvons voir l'embryon. Nous pouvons distinguer la queue et le cristallin postérieur ici, ainsi que la tête plus haut.

Ici, nous examinons la tête de cet embryon. Vous pouvez voir la ligne médiane, représentée par cette ligne foncée. On distingue l'hémisphère gauche et l'hémisphère droit, ainsi qu'un cervelet.

Maintenant, je vais cibler l’hémisphère gauche lors de l’injection. Aspirer avec la pipette, remonter légèrement et injecter le colorant. Vous voyez maintenant qu’il se diffuse dans le ventricule latéral gauche.

Et cela ressemble donc à une injection réussie. Très bien, nous voyons maintenant que les ventricules se sont bien remplis. Le colorant est en réalité passé du ventricule gauche au ventricule droit.

Nous avons donc du D et de l'ADN dans les deux ventricules. À ce stade, je vais prendre mes électrodes d'électroporation et les positionner de part et d'autre du cerveau, avec une électrode positive du côté gauche. Ainsi, l'ADN pénétrera dans les progéniteurs et la paroi corticale de l'hémisphère gauche.

Et maintenant, je fais passer le courant. Lorsque nous commençons à faire circuler le courant électrique, vous observez une mousse à l'extrémité négative de l'électrode. Cela est rassurant et vous indique que vous avez établi les bons contacts.

Très bien, maintenant que nous avons électroporé ces embryons, je vais les remettre en place et suturer l'incision. Je vais maintenant lui administrer 10 ml d'antibiotique en suture chirurgicale. J'aime utiliser des points bloqués.

Ensuite, nous allons suturer la peau à l’aide d’un agrafeuse cutanée. D’accord ? Très bien. Je lui ai administré une dose de buprénorphine afin de s’assurer qu’elle ne ressente aucune douleur lors de son réveil. Maintenant, je vais simplement la placer dans l’incubateur, ce qui permettra de la maintenir au chaud pendant qu’elle émerge, afin d’éviter toute hypothermie.

Très bien, nous venons de vous montrer comment réaliser des injections intraventriculaires et une électroporation in utero. Chez le rat, vous pouvez injecter plusieurs types de substances. Vous pouvez simplement injecter un virus, notamment un lentivirus ou un rétrovirus, directement dans le ventricule.

Et dans ce cas, vous n'aurez pas besoin de faire l'électroporation, car le virus s'intégrera dans les cellules. Si vous injectez un plasmide, des plasmides d'ADN, comme nous l'avons fait aujourd'hui, vous devrez réaliser l'électroporation afin d'introduire les plasmides dans les cellules tapissant le ventricule. Ainsi, vous pouvez utiliser ces vecteurs pour diverses applications.

Vous pouvez les utiliser simplement pour suivre les cellules exprimant la GFP, ce qui vous permet d'observer la division et la migration de ces progéniteurs. Vous pouvez également utiliser ces vecteurs pour manipuler les cellules. Ainsi, vous pouvez exprimer des hétéroduplexes d'ARN court (S-H-R-N-A), et par conséquent inhiber l'expression de gènes spécifiques.

Vous pouvez également surexprimer des gènes spécifiques, et ainsi manipuler les cellules que vous avez électroporées ou infectées avec le virus. Cette approche peut constituer une technique très puissante pour étudier le rôle de protéines spécifiques dans le processus qui vous intéresse. Cela revêt une importance particulière pour les études chez le rat, car il n'est pas aussi aisé d'effectuer des manipulations génétiques chez le rat que chez la souris.