Name: Rapide par PCR en utilisant thermocyclage Microscale convection thermique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Découvrez la PCR rapide par convection thermique microscale pour l'amplification d'ADN. Cette méthode simplifie le thermocyclage par mouvement continu des réactifs entre zones de température.

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Nous tenons à remercier T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, et B. Wallek au Lynntech, Inc pour l&#39;assistance technique et de nombreuses discussions utiles. Ce travail a été soutenu par le US National Science Foundation (NSF) titre de la subvention CBET-0933688.

1. Conception de base du Thermocycleur convective <ol><li> Nous avons construit un dispositif simple, thermocyclage convectifs composé de plastique interchangeables chambre de réaction "cartouches" qui sont pris en sandwich entre deux plaques d'aluminium dont les températures sont contrôlées indépendamment 7 (figure 2). </li><li> Puits réacteur cylindrique sont intégrés par des réseaux de l'usinage des trous dans des blocs en polycarbonate, avec différentes combinaisons de diamètre du trou et l'épaisseur de feuille de plastique utilisées pour atteindre les ratios d'aspect souhaité (hauteur / diamètre = h / j). Deux géométries différentes sont considérées comme des réacteurs dans les résultats présentés ici: H / D = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 volumes uL; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 uL volume. </li><li> La surface inférieure du réacteur est chauffé à l'aide d'un bloc d'aluminium contenant cartouches chauffantes interfacé avec un contrôleur de température microprocesser entraînée. </li><li> La température à la surface supérieure du réacteur est régulée à l'aide d'un bloc en aluminium relié à un bain d'eau de recirculation. </li><li> L'ensemble est serré ensemble à l'aide des vis en nylon pour limiter la conduction thermique entre les blocs en aluminium adverse. </li></ol> 2. Préparation et chargement du mélange de réaction PCR <ol><li> Un typique de 100 uL mélange réactionnel contient 10 uL d'une solution tampon 10x, 6 pl de 25 mM MgCl 2, 10 pi de dNTP (2 mM chacun), 41,2 uL d'eau DI, 10 pi de β-actine de sonde, 10 pi de β -actine amorce directe, 10 uL d'amorce reverse β-actine, 2 pl de l'ADN matrice génomique humaine (10 ng / uL) et 0,8 uL d'ADN polymérase KOD (2,5 unités / uL). </li><li> Avant de charger les réactifs, de sceller la surface inférieure de la chambre de PCR en utilisant une feuille mince de ruban adhésif aluminium. </li><li> Rincer les puits avec un réacteur de 10 mg / ml de solution aqueuse d'albumine sérique bovine suivie par Rain-X anti-buée. </li><li> Réactifs pipette dans les puits de réacteur utilisant de longues pointes de pipettes de gel de chargement et de sceller la surface supérieure avec Téflon FEP bande. </li></ol> 3. L'exécution de la réaction dans le thermocycleur convective <ol><li> Avant le début de la réaction, des blocs en aluminium à la fois pour préchauffer les températures souhaitées surface supérieure et inférieure. </li><li> Sandwich du réacteur en plastique chargé de réactifs de PCR entre les blocs de chauffage en aluminium, et rapidement pince l'assemblage ainsi que l'aide de vis en nylon. </li><li> Après la réaction s'est produite pendant le temps voulu, éteindre le chauffe et le lieu de la plus faible (à chaud) de surface de l'appareil au sommet d'un bloc de métal refroidi rapidement le refroidir et arrêter le flux de convection. </li><li> Retirez le réacteur en plastique et la pipette les produits hors des puits (en utilisant les astuces à long chargement de gel) pour une analyse ultérieure. </li></ol> 4. Exécution d'une analyse électrophorèse sur gel <ol><li> Préparer un 2% en poids gel d'agarose par chauffage de 10 g d'agarose avec 500 ml de tampon 1x sur une plaque chaude jusqu'à agitant la solution devient limpide. </li><li> Chargez le gel d'agarose dans le bac de coulée et d'insérer le peigne. Soit l'ensemble de gel pour ~ 30 min. </li><li> Retirer le peigne et ajouter 1x tampon TAE jusqu'à ce que le gel est immergé. </li><li> Fluorescence des échantillons d'ADN teinté contiennent 2 uL 100x SYBR Green I solution, deux échantillons d'ADN ul, 2 ul Dye 6x Chargement d'Orange, et 4 pi de tampon TAE. </li><li> Ajouter les échantillons d'ADN dans les puits et exécuter la séparation à 60 V pendant 1 h avec un 100 pb d'ADN échelle de marqueur de taille. </li><li> Retirer le gel et le photographier sous lumière UV afin d'obtenir le résultat. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: La conception optimale des thermocycleurs convection consiste à choisir la géométrie du réacteur correcte qui va générer un flux circulatoire capable de transporter des réactifs à travers les températures clés impliqués dans le processus de PCR. Les paramètres géométriques qui peuvent être modifiées dans les réacteurs cylindriques considérés ici sont la hauteur (h) et le diamètre (d), ou de manière équivalente le ratio d'aspect (h / j). Nous avons exploré les champs d'écoulement 3-D à l'intérieur par convection réacteurs PCR sur une gamme de ratios d'aspect différent en utilisant la dynamique des fluides computationnelle (DFC), et a constaté que les modèles complexes peuvent surgir inopinément. Plus important encore, notre analyse a révélé un sous-ensemble de ces champs d'écoulement complexes que d'accélérer considérablement la réaction 12. Ces effets géométriques peuvent être clairement visible en comparant les champs d'écoulement dans les réacteurs à rapport d'aspect élevé et bas. Dans le cas allongement élevé (H / D = 9; un grand cylindre maigres), des éléments fluides sont advecté le long de trajectoires traçant des chemins qui sont essentiellement des boucles fermées, et ils sont immobilisés à suivre les mêmes chemins pour de longues périodes de temps (figure 3a). Par conséquent, il ya peu d'opportunités pour l'échange entre ftrajectoires basses qui exposent les réactifs à la séquence optimale des conditions thermiques pour la PCR (oscillant entre le recuit et la dénaturation extrêmes à faces supérieure et inférieure du réacteur) et l'ensemble beaucoup plus vaste de trajectoires restants qui ne contribuent pas à l'amplification (localisés près du centre du réacteur). Le champ d'écoulement est très différente à un ratio plus petite dimension (h / j = 3; une plus courte, plus large cylindre), de plus en plus chaotique dans le sens où les trajectoires élément liquide ne suivent plus les chemins fermés (figure 3B). Ainsi, même si les réactifs sont soumis à un profil de température plus complexes, des éléments de fluide sont en mesure d'explorer un éventail beaucoup plus large de trajectoires afin que davantage de volume de réactif a l'occasion d'une expérience optimale de profils thermiques. Ces résultats suggèrent que les contre-intuitivement tout en trajectoires individuelles à des flux h / d = 9 semblent être plus favorables pour la PCR en produisant des profils de température qui "regarde" similaires à celles employées dans un thermocycleur conventionnel, la nature chaotique du champ d'écoulement à h / d = 3 domine finalement à l'échelle mondiale par la promotion de l'échange amélioré de façon que les réactifs ne sont piégés dans des trajectoires défavorables pour très longtemps. Pour tester cette hypothèse et déterminer la géométrie du réacteur a été plus favorable pour la PCR, nous avons utilisé deux d'entre eux pour effectuer la réplication de PCR de 295 pb d'une cible associée avec le gène β-actine à partir d'un modèle d'ADN génomique humain. Fait remarquable, nous avons systématiquement réalisé l'amplification du produit cible correct dans seulement 10 min à H / D = 3 (figure 4a), tandis que la même réaction nécessaire au moins 20 minutes avant que les produits détectables ont été observés à H / D = 9 (figure 4b) . La spécificité de la réaction est aussi beaucoup plus grande à H / D = 3 où un seul produit PCR est obtenu, alors que plusieurs produits non spécifiques sont générés à H / D = 9, où les pièges champ d'écoulement de fluide dans les éléments défavorables trajectoires thermiques pour des périodes de temps prolongées. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Convection thermique dans une chambre cylindrique dont le haut et le bas des surfaces sont maintenus à différentes températures fixes. Si la température à la surface inférieure est plus élevé que dans la partie supérieure, un gradient de densité verticale est établi dans le fluide, enfermé qu'il est capable de générer un modèle de flux circulatoires. Avec le bon choix des paramètres géométriques (hauteur h et de diamètre d), le champ d'écoulement de convection peut être exploité pour actionner thermocyclage PCR lorsque les surfaces supérieure et inférieure sont manintained près de recuit et la dénaturation des températures, respectivement (la gravité agit verticalement vers le bas). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. (A) Les éléments clés d'un flux de convection PCR thermocycleur. Une cartouche de réacteur est constitué d'un bloc de polycarbonate contenant un tableau de chambres cylindriques. Le bloc est pris en sandwich entre une plaque supérieure conçu pour être relié à un bain d'eau circulant et une plaque inférieure incorporant chauffages intégrés. (B) Les réactifs de PCR sont chargés et scellés à l'intérieur de la cartouche de réacteur, après quoi l'appareil est assemblé pour effectuer la réaction. À la fin, le procucts peut être facilement pipette pour analyse ultérieure. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Simulations de calcul de la 3-D des champs d'écoulement convectif générés à l'intérieur des réacteurs cylindriques avec des températures de 53 et 96 ° C imposées sur les surfaces supérieure et inférieure, respectivement. Les résultats sont présentés au rapport d'aspect de (a) H / D = 9 (38,2 uL volume du réacteur) et (b) h / d = 3 (18,5 volume du réacteur uL). Une trajectoire suivie par un représentant élément fluide traversant le champ d'écoulement 3D est affiché à gauche ainsi que des projections vue de dessus et d'autre du chemin, le tracé correspondant de la température en fonction du temps suite à un élément de fluide est indiqué à droite. Le profil thermique à H / D = 9 apparaît proche de celle d'un thermocycleur classique, mais le champ d'écoulement chaotique à H / D = 3 est contre-intuitivement plus favorable pour la PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Résultats de la figure 4. Réplication de l'ADN obtenu dans les géométries de réacteur de la figure 3 (surfaces supérieures et inférieures ont été maintenus à 53 et 96 ° C, respectivement). (A) La PCR est fortement accélérée au H / D = 3, comme en témoigne les produits solides visibles après seulement 10 minutes de temps de réaction (M: 100 échelle de pb, pistes 1-4: les produits de réactions en parallèle dans 4 différentes chambres cylindriques). (B H / D = 9 exige au moins 20 minutes avant que les produits visibles sont observées, et plusieurs bandes sont évidents indiquant la réplication de l'ADN cible non-spécifiques, en plus de produit souhaité (M: 100 pb échelle, voies 1-2: produits de réactions parallèles dans deux différentes chambres cylindriques).

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</ol>

L&#39;interaction entre le flux et la réaction chimique peut changer de façon spectaculaire sous l&#39;influence de l&#39;advection chaotique. Mais ces états d&#39;écoulement complexes sont difficiles à étudier, notamment dans des géométries réalistes où les effets 3D deviennent importants. Convection de Rayleigh-Bénard à h / j&gt; 1 ne fournit pas seulement une plate-forme pratique pour explorer ces phénomènes, leur application pour effectuer la PCR permet également le couplage entre les réactions chimiques de flux et d&#39;être sondé. Cette capacité unique permet de sélectionner états de flux optimale où chaotiques Loi effets (contre-intuitivement) pour accélérer le taux de réplication de l&#39;ADN.

<table><tbody><tr><td>Kit de polymérase KOD ADN</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs de contrôle TaqMan &amp;#946;-actine</td><td>Applied Biosystems</td><td>401846</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif en aluminium</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique de bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X Anti-Buée</td><td>SOPUS Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette longues pour gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-151</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif en téflon FEP</td><td>McMaster-Carr</td><td>7562A17</td><td></td></tr><tr><td>Gel d'agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3107</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de migration TAE</td><td>Bio-Rad</td><td>141-0743</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Vert I</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de chargement orange 6x</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur d'échelle d'ADN échelle de 100 pb</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8202</td><td></td></tr></tbody></table>

rapide par pcr en utilisant thermocyclage microscale convection thermique

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Beaucoup de tests de biologie moléculaire dépendent d&#39;une certaine manière sur la réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour amplifier un échantillon cible d&#39;abord diluer l&#39;ADN à un niveau de concentration détectable. Mais la conception de matériel thermocyclage PCR conventionnelle, essentiellement basée sur massifs blocs de chauffage métallique dont la température est régulée par des radiateurs thermoélectriques, limite sévèrement la vitesse de réaction possible 1. Considérable d&#39;énergie électrique est également nécessaire pour chauffer et refroidir plusieurs reprises le mélange réactif, limitant la capacité de déployer ces instruments dans un format portable. La convection thermique est apparue comme une approche alternative prometteuse thermocyclage qui a le potentiel pour surmonter ces limitations 2-9. Flux de convection sont monnaie courante dans un large éventail de paramètres allant de l&#39;atmosphère terrestre, les océans, et l&#39;intérieur, de lampes à lave décoratif et coloré. Mouvement fluide est lancé de la même manière dans chaque cas: une instabilité de flottabilité conduit survient quand un volume confiné de liquide est soumis à un gradient de température spatiale. Ces mêmes phénomènes offrent un moyen attractif pour effectuer thermocyclage PCR. En appliquant un gradient de température statique à travers une géométrie du réacteur bien conçu, un flux circulatoire continu peut être établi que le transport sera répétée réactifs de PCR à travers des zones de température associée à la dénaturation, d&#39;hybridation et les étapes d&#39;extension de la réaction (figure 1). Thermocyclage peut donc être actionné de manière pseudo-isotherme en tenant simplement deux faces opposées à des températures fixes, en éliminant complètement la nécessité de chauffer et de climatiser plusieurs reprises l&#39;instrument. Un des principaux défis de conception de thermocycleurs convection est la nécessité de contrôler avec précision la vitesse spatiale et les distributions de température dans le réacteur afin de s&#39;assurer que les réactifs de façon séquentielle occuper les zones de température correcte pour une période de temps suffisante 10,11. Nous décrivons ici les résultats de nos efforts pour sonder la pleine vitesse de 3-D et les distributions de température dans microéchelle convectifs thermocycleurs 12. De façon inattendue, nous avons découvert un sous-ensemble des trajectoires d&#39;écoulement complexes qui sont très favorables pour la PCR en raison d&#39;une combinaison synergique de (1) échange continu entre les chemins d&#39;écoulement qui offre une possibilité accrue pour les réactifs à l&#39;échantillon de la gamme complète des profils de température optimale, et ( 2) l&#39;augmentation du temps passé dans la zone de température d&#39;extension de l&#39;étape limitante de la PCR. Extrêmement rapide temps de l&#39;amplification d&#39;ADN (de moins de 10 min) sont réalisables dans des réacteurs conçus pour générer ces flux.

Nous décrivons une nouvelle méthode pour effectuer la réplication d&#39;ADN par la réaction de polymérase en chaîne (PCR). Convection thermique est mise à profit pour les réactifs de navette continue entre dénaturation, d&#39;hybridation et les conditions d&#39;extension par le maintien des surfaces opposées du réacteur à température constante. Cette conception intrinsèquement simple, promet de faire rapidement PCR plus accessible.

Rapide par PCR en utilisant thermocyclage Microscale convection thermique

De nombreux essais de biologie moléculaire dépendent d'une manière ou d'une autre de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier un échantillon d'ADN cible initialement dilué jusqu'à un niveau détectable...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment le principe de thermocyclage PCR par convection thermique peut être appliqué pour réaliser une réaction réelle. Cela est accompli en introduisant d'abord le concept de thermocyclage par convection naturelle, ainsi que les principes de conception de base. La deuxième étape de la procédure consiste à montrer comment préparer la cartouche réactionnelle et charger les réactifs à l'intérieur.La troisième étape de la procédure consiste à assembler la cartouche du réacteur dans l'unité de chauffage et à effectuer la réaction. La dernière étape de la procédure consiste à retirer les réactifs après la réaction et à vérifier les résultats par électrophorèse sur gel. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant une réplication rapide de l'ADN par amplification en chaîne par polymérase (PCR) à thermocyclage par convection naturelle.Bonjour, je suis Radha OU du laboratoire UGAs à l'université Texas A&M. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'effectuer un thermocyclage PCR rapide par convection naturelle, similaire au fonctionnement d'une lampe à lave. Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la conception et l'optimisation de dispositifs de thermocyclage exploitant ce principe.Commençons. Ce protocole débute par la conception et la construction d'un dispositif simple de thermocyclage convectif. Le dispositif utilisé pour cette démonstration comprend des cartouches interchangeables en plastique servant de chambres à réaction, insérées entre deux plaques d'aluminium dont les températures sont contrôlées indépendamment.Des puits réacteurs cylindriques ont été intégrés en usinant des réseaux de trous dans des blocs de polycarbonate, en utilisant différentes combinaisons de diamètre de trou et d'épaisseur de feuille plastique afin d'obtenir les rapports d'aspect souhaités. La conception optimale consiste à choisir la géométrie de réacteur appropriée qui générera un écoulement circulatoire capable de transporter les réactifs à travers les températures clés impliquées dans le processus de PCR. Les paramètres géométriques pouvant être modifiés dans les réacteurs cylindriques considérés ici sont la hauteur et le diamètre, ou de manière équivalente, le rapport d'aspect.La surface inférieure du réacteur est chauffée à l’aide d’un bloc en aluminium contenant des cartouches chauffantes reliées à un contrôleur de température piloté par microprocesseur. La température à la surface supérieure du réacteur est régulée à l’aide d’un bloc en aluminium connecté à un bain d’eau régénérée. L’ensemble est fixé à l’aide de vis en nylon afin de limiter la conduction thermique entre les deux blocs d’aluminium opposés.Préparez chaque libération de 100 µL de réaction PCR en mélangeant une solution tampon 10 fois, du chlorure de magnésium 25 mM, deux DTPs d'eau distillée, la sonde d'amorce avant et arrière de l'actine bêta, un modèle génomique humain, de l'ADN et la polymérase K-O-D-D-N-A. Avant de charger les réactifs, scellez la surface inférieure de la chambre PCR à l'aide d'une fine feuille de ruban d'aluminium, rincez les puits du réacteur avec une solution aqueuse d'albumine de sérum bovin à 10 mg/mL, suivie de Rain X anti-buée. Enfin, pipetez les réactifs dans les puits du réacteur à l'aide de pointes de chargement de gel et scellez la surface supérieure avec du ruban en téflon FEP.Avant de commencer la réaction, préchauffez les deux blocs d'aluminium aux températures souhaitées pour les surfaces supérieure et inférieure. Insérez le réacteur en plastique chargé avec les réactifs de PCR entre les blocs chauffants en aluminium et fixez rapidement l'ensemble à l'aide de vis en nylon. Une fois la réaction terminée après le temps souhaité, éteignez les chauffages et placez la surface chauffante inférieure de l'appareil sur un bloc métallique refroidi afin de le refroidir rapidement et d'arrêter l'écoulement convectif.Retirez le réacteur en plastique et pipetez les produits hors des puits pour une analyse ultérieure. Préparez un gel d'agarose à 2 % en chauffant 10 grammes d'agarose avec 500 millilitres de tampon 1× sur une plaque chauffante agitée jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Chargez le gel d'agarose dans le moule de coulée et insérez le peigne.Laisser la gélose durcir pendant environ 30 minutes. Retirer le peigne et ajouter du tampon TAE 1 fois jusqu'à ce que la gélose soit recouverte. Préparer les échantillons d'ADN marqués au fluorochrome avec deux microlitres de vert cyber 100 fois concentré.Une solution composée de deux microlitres d'échantillon d'ADN, de deux microlitres de colorant de charge orange six fois concentré et de quatre microlitres de tampon TAE. Chargez un marqueur de taille d'ADN de 100 paires de bases et les échantillons d'ADN dans les puits du gel. Séparez l'ADN en faisant migrer le gel à 60 volts pendant une heure.Retirez le gel et photographiez-le sous lumière UV pour obtenir le résultat. Les champs d'écoulement tridimensionnels à l'intérieur des réacteurs PCR convectifs ont été étudiés pour une gamme de rapports d'aspect différents à l'aide de la dynamique des fluides numérique ou CFD. Ces données ont révélé que des motifs complexes peuvent apparaître et qu'un sous-ensemble de ces écoulements complexes peut accélérer significativement la réaction.Ces effets géométriques peuvent être clairement observés en comparant les champs d'écoulement dans des réacteurs ayant des rapports d'aspect élevés et faibles, avec un rapport d'aspect élevé. Les éléments fluides sont affectés le long des trajectoires, décrivant des chemins qui sont essentiellement des boucles fermées et sont contraints de suivre les mêmes parcours pendant de longues périodes. Par conséquent, il existe peu d'opportunités d'échange entre les trajectoires d'écoulement qui exposent les réactifs à la séquence optimale de conditions thermiques pour la PCR et l'ensemble beaucoup plus vaste des trajectoires restantes qui ne contribuent pas à l'amplification.Le champ d'écoulement est très différent à un plus petit rapport d'aspect. Le champ d'écoulement est plus chaotique, car les trajectoires des éléments fluides ne suivent plus des trajectoires fermées. Bien que les réactions soient soumises à un profil thermique plus complexe, les éléments fluides peuvent explorer un éventail beaucoup plus large de trajectoires, ce qui permet à une plus grande partie du volume du réactif d'être exposée à des profils thermiques optimaux.Ces résultats suggèrent que, bien que les trajectoires d'écoulement individuelles à H sur D égal à neuf puissent sembler plus favorables à la PCR en produisant des profils de température similaires à ceux utilisés dans un thermocycleur classique, la nature chaotique du champ d'écoulement à HOD égal à trois domine finalement à l'échelle globale en favorisant un échange accru, de sorte que les réactifs ne restent pas piégés longtemps dans des trajectoires défavorables. Pour tester cette hypothèse et déterminer quelle géométrie de réacteur était la plus favorable à la PCR, les deux cylindres ont été utilisés pour réaliser la réplication par PCR d'une cible de 295 paires de bases associée au gène de l'actine bêta à partir d'un ADN génomique humain comme matrice ; l'amplification du produit cible correct a été obtenue de façon répétée en seulement 10 minutes à H sur D égal à trois.À l’inverse, la même réaction nécessitait au moins 20 minutes avant que des produits détectables n’apparaissent à un rapport H/D égal à neuf. La spécificité de la réaction est également beaucoup plus élevée à un rapport H/D égal à trois, où un seul produit PCR est obtenu. Alors que plusieurs produits non spécifiques sont générés à un rapport H/D égal à neuf, où le champ d’écoulement piège les éléments fluides dans des trajectoires thermiques défavorables pendant des périodes prolongées.Nous venons de vous montrer comment réaliser une réaction de PCR en utilisant un thermocycleur à flux convectif. Lors de cette procédure, il est important de bien sceller les réactifs à l'intérieur de la chambre réactionnelle sans emprisonner de bulles d'air. Celles-ci perturberaient le champ d'écoulement interne et inhiberaient la réaction.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Nous allons démontrer la configuration et l'analyse des pré-microARN de 96 puits pour les tableaux QPCR aide d'un robot ainsi que par la main avec une pipette multicanaux Thermo Scientific Matrix.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

PCR a émergé comme une technique courante dans de nombreux laboratoires de biologie moléculaire. Pourvu voici un guide rapide à plusieurs protocoles de PCR classiques. Parce que chaque réaction est une expérience unique, les conditions optimales nécessaires pour générer un produit varie. Comprendre les variables dans une réaction permettra d'améliorer grandement l'efficacité de dépannage, augmentant ainsi les chances d'obtenir le résultat souhaité.

Polymerase Chain Reaction: Protocole Basic Plus Stratégies de dépannage et d&#39;optimisation

Repliement des protéines amplification cyclique (PMCA) est un test in vitro pour l'étude de la conversion du prion et les obstacles souche et l'espèce. Il peut également être utilisé comme un test de détection de prion.

Protein Misfolding Cyclic Amplification des prions

Pyroséquençage est une technique polyvalent qui facilite le séquençage du génome microbien qui peut être utilisé pour identifier des espèces bactériennes, de discriminer les souches bactériennes, et de détecter des mutations génétiques qui confèrent une résistance aux agents anti-microbiens. Dans cette vidéo, la procédure pour la production microbienne de l'amplicon, amplicon pyrosequencing et analyse de la séquence d'ADN sera démontrée.

Pyrosequencing pour l&#39;identification microbienne et Caractérisation

Nous décrivons un protocole de PCR en temps réel pour le profil de microARN dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). A l'exception des protocoles d'extraction d'ARN, la procédure peut être étendue à l'ARN extrait à partir d'autres fluides corporels, des cellules en culture, ou des échantillons de tissus.

Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

Ce protocole décrit les étapes critiques et les précautions nécessaires afin d’effectuer seule cellule transcription réverse multiplex PCR après patch clamp. Cette technique est une méthode simple et efficace pour analyser le profil d’expression d’un ensemble prédéterminé de gènes d’une cellule unique, caractérisé par des enregistrements de patch clamp.

Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

La réticulation cinétique et l’analyse de l’ADNc est une méthode qui permet d’étudier la dynamique des interactions protéine-ARN dans les cellules vivantes à haute résolution temporelle. Ici, le protocole est décrit en détail, y compris la croissance des cellules de levure, la réticulation UV, la récolte, la purification des protéines et les étapes de préparation de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération.

Surveillance de la dynamique d’interaction protéine-ARN in vivo à haute résolution temporelle à l’aide de χCRAC

Ce protocole décrit comment construire un système de chaîne polymérase à flux continu basé sur une puce microfluidique et comment construire un système d’électrophorèse capillaire en laboratoire. Il présente une méthode simple pour l’analyse des acides nucléiques en laboratoire.

Amplification d’Escherichia coli dans une puce microfluidique PCR à flux continu et sa détection à l’aide d’un système d’électrophorèse capillaire

Le génotypage complet d'un échantillon de queue de souris, y compris la digestion des tissus et la lecture de PCR, se fait en une heure et demie au moyen de Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue kit de PCR.

Génotypage rapide des tissus de souris en utilisant Sigma Extract-N-Amp PCR Kit Tissu

Les analyses qPCR Solaris expression des gènes sont de nouveaux pré-conçus qPCR amorce / sonde combinaisons conçues pour simplifier le processus de qPCR sans pour autant sacrifier la spécificité et la robustesse de l'analyse.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Découvrez la PCR rapide par convection thermique microscale pour l'amplification d'ADN. Cette méthode simplifie le thermocyclage par mouvement continu des réactifs entre zones de température.

Rapide par PCR en utilisant thermocyclage Microscale convection thermique

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