L'induction et le suivi des actifs d'hypersensibilité de type retardé (DTH) chez les rats

Bonjour, je suis Christine Beaton. Je travaille dans le laboratoire de George Chandy, au Département de physiologie et de biophysique de l'UCI. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment induire une réaction de type hypersensibilité retardée (DTH) active chez le rat.

Pour cela, je vais préparer une émulsion de KLH, qui est mon antigène, dans un adjuvant de Freund. Ensuite, je vais injecter cette émulsion à la base de la queue de rats Lewis. Cela va induire une immunisation des rats contre le KLH. Et une semaine plus tard, je vais provoquer une réaction chez les rats avec le KLH et mesurer la réaction d'hyper-sensibilité retardée (HSR) par la mesure du gonflement.

C'est le site de l'épreuve et nous l'utilisons au laboratoire pour observer l'effet des bloqueurs des canaux PO sur les réactions inflammatoires telles que l'hypersensibilité retardée (HSR). Voici l'adjuvant trans incomplet que je vais utiliser pour préparer l'émulsion. Je pourrais également utiliser un adjuvant trans complet.

Voici du quartz de KLH, qui est mon antigène aujourd'hui, et j'ai une solution à deux milligrammes par ml. Dans du PBS, je vais utiliser cette seringue de 5 ml pour prélever l'adjuvant incomplet et le transférer dans un tube de 15 ml. Je vais ensuite placer le tube sur le vortex et, tout en agitant, ajouter mon antigène goutte à goutte à l'adjuvant.

Ensuite, je vais vortexer pendant cinq minutes supplémentaires. Une fois cela terminé, je vais remplir cette seringue en verre de 5 ml avec mon mélange, et elle doit être en verre car l'adjuvant a tendance à attaquer le plastique. Nous avons constaté que les seringues de 5 ml sont les plus adaptées pour préparer l'émulsion.

Des tailles plus petites ou plus grandes ne sont pas aussi bonnes. Une fois que j'ai rempli ma seringue avec le mélange, je vais utiliser ce pont métallique pour relier cette seringue en verre à une autre seringue en verre de cinq millilitres. Ensuite, j'appliquerai une pression sur les seringues afin que mon mélange passe d'une seringue à l'autre le plus rapidement possible, jusqu'à ce qu'il durcisse vraiment, jusqu'à ce que l'émulsion devienne bien ferme, puis il sera prêt à être injecté.

Je vais donc ajouter 2,5 ml de mon adjuvant. J'injecte donc de l'air pour pouvoir extraire l'adjuvant plus facilement, puis je verse tout l'adjuvant dans mon tube. Ensuite, je vais prélever 2,5 ml de ce mélange et les ajouter en vortexant.

Étant donné que j'ai prélevé 2,5 ml d'adjuvant, je vais prélever 2,5 ml de mon KLH. Au fur et à mesure que j'ajouterai la solution goutte à goutte, vous verrez la couleur du mélange changer et devenir blanche. J'ai maintenant ajouté tout l'antigène à l'adjuvant.

Donc, ce que je vais faire, c'est de mettre le mélange en vortex pendant encore cinq minutes. Mais comme je ne veux pas tenir le tube pendant cinq minutes, je vais plutôt l'attacher au vortex afin de créer un vortex à l'intérieur du tube. Vous ne voulez pas qu'il tourne lentement, mais aussi vite que possible sans déborder. Je vais donc le laisser ainsi pendant cinq minutes.

Les cinq minutes sont donc écoulées. Je vais maintenant arrêter le vortex et mon mélange est blanc. J'enlève donc le tube. Oups.

Le mélange est maintenant complètement blanc, mais il est encore assez liquide. Or, je voulais une consistance plus ferme pour l'injection. Je vais donc transférer la totalité du mélange dans une seringue en verre de 5 ml.

Ces seringues ont donc été autoclavées. J'associe donc une seringue complète à mon pont. Et pour l'autre seringue, je ne relie que le corps.

Je laisse le piston à l'extérieur, puis je vais verser mon mélange dans la seringue supérieure. Je vais transférer le tout vers la seringue inférieure. Ensuite, je dois chasser la bulle d'air que j'ai ici.

Je vais donc déconnecter la seringue supérieure et je vais chasser la bulle d'air. La bulle est difficile à voir, mais elle est juste ici. J'expulse donc la bulle d'air.

Je l'extrais également du pont, puis je reconnecte la seringue supérieure. Je m'assure que tout est solidement raccordé, puis je vais transférer mon mélange d'une seringue à l'autre. Au départ, c'est facile, mais rapidement le mélange va devenir dur.

Ce soir, c'est de plus en plus difficile et je ne veux pas casser le pont, alors je tourne simplement mes seringues. Parfois, cela prend plus de temps. Cela varie d'une émulsion à l'autre.

Cela dépend probablement de la température et du taux d'humidité également. Mais je pense que mon émulsion est prête. Elle est beaucoup plus épaisse qu'au moment où je l'ai versée.

Il est complètement blanc. Et il n’y a qu’une seule phase. Vous ne devez jamais observer de séparation de la phase ACO par rapport à l’huile.

Il est donc prêt à être injecté. L'immersion est donc prête à être injectée. Pour l'injecter, j'utilise 200 microlitres par hutte.

Pour cela, j'utiliserai des seringues de trois millilitres. J'utilise des seringues à embout lu pour m'assurer que l'aiguille ne se détache pas, car l'émulsion peut être très épaisse et difficile à injecter. Pour les aiguilles, j'essaie d'utiliser les plus petites aiguilles possibles qui permettent tout de même à l'émulsion de passer.

Et j'ai constaté que les seringues de 20 mL à 3G sont suffisamment adaptées pour cette émulsion. Pour des émulsions plus épaisses, vous devrez peut-être utiliser des seringues plus grandes. Notre méthode consiste à faire tenir le rat par une personne tandis qu'une autre effectue l'injection.

Et pour une sécurité maximale, la personne qui tient les rats, bien que ces rats soient très calmes et habitués à être manipulés, porte des gants résistants aux dents de rongeurs, par mesure de sécurité maximale, afin de ne pas se faire mordre par le rat. J'ai donc mis toute l'émulsion dans une seringue en verre et j'ai déconnecté la seringue en verre vide du pont. À sa place, j'ai placé ma seringue en plastique de trois millilitres à verrou inférieur.

Maintenant, je transfère plus que nécessaire pour une injection d'émulsion. J'élimine la bulle d'air. Puisque je vais injecter 200 microlitres par injection, je laisse 300 microlitres dans mon seringue.

Je déconnecte le pont, je place mon aiguille sur ma seringue en plastique, puis je remplis mon aiguille et j'abaisse mon piston à 200 microlitres. C'est ainsi que je m'assure de ne pas avoir de bulles d'air. Et maintenant, nous sommes prêts à injecter.

Nous voulons donc nous assurer que le rat ne bouge pas. Nous prenons donc le rat et je place un doigt au-dessus de l'épaule, un autre en dessous, puis, avec l'autre main, je maintiens les pattes arrière et la queue, et nous allons injecter sur les flancs ici, en microlitres de ce côté, puis en microlitres de l'autre côté. La semaine dernière, j'ai immunisé les rats avec une émulsion contenant la KLH comme antigène.

Aujourd'hui, je vais les stimuler par voie intradermique sur le dos avec la KLH, qui est mon antigène, et avec l'albumine ovoïde, qui est un antigène pertinent, mais pour pouvoir les injecter intradermiquement sur le dos, je dois d'abord les raser. Pour cela, j'utilise simplement un rasoir électrique. Oui, eh bien, je change d'aiguille entre chaque rat afin de m'assurer que l'aiguille n'est pas émoussée.

Il est ainsi beaucoup plus facile d'effectuer une injection intradermique, en particulier lorsque je dois injecter de petits volumes de 20 microlitres de chaque antigène. J'ai donc injecté mes deux antigènes à tous les rats et je vais les laisser dans leurs cages jusqu'à demain. Et demain, nous pourrons observer une inflammation.

Ainsi, le site d'injection sera rouge et gonflé, et nous pourrons mesurer le diamètre du site inflammatoire comme indicateur de l'inflammation. Hier, j'ai injecté aux rats, par voie intradermique dans le dos, un antigène pertinent, la KLH, et un antigène non pertinent, l'albumine. Maintenant, 24 heures plus tard, je vais examiner les rats pour vérifier la présence d'une inflammation.

Je m'attends donc à une inflammation uniquement au site de KLH, et l'inflammation se manifestera par une rougeur et un gonflement. Une fois l'inflammation observée, je vais mesurer la zone enflammée en relevant simplement le diamètre de la région. Ici, il s'agit du site injecté avec le KH, et on peut voir sans difficulté une inflammation importante.

Il est très rouge par rapport à la peau normale et il est gonflé. Si nous examinons maintenant l'autre site ayant reçu de l'albumine, vous pouvez voir le site d'injection juste ici, mais il n'y a ni rougeur ni gonflement significatif. Le témoin négatif a donc fonctionné.

Je vais maintenant mesurer l'endroit de l'inflammation. Pour cela, j'utiliserai une règle ordinaire et effectuerai une mesure en millimètres. Cela mesure six millimètres et je prends une deuxième mesure.

Ceci mesure cinq millimètres. Il y a très peu de rougeur ; je vais prendre la mesure, mais elle atteint à peine un millimètre. Ce que je vous ai montré ici correspond donc à la préparation d'une émulsion contenant un antigène, à l'immunisation de rats avec cette émulsion, puis à la stimulation une semaine plus tard avec l'antigène utilisé pour l'immunisation ainsi qu'avec un antigène pertinent, et enfin à la visualisation et à la mesure du degré d'inflammation dans les conditions utilisées et dans le laboratoire Chan.

Nous utilisons couramment cette technique comme un test simple pour mesurer l'effet des bloqueurs des canaux potassiques sur l'inflammation chez le rat.