Name: Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Apprenez la nucléofection et la culture de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex pour étudier la croissance axonale et la synaptogenèse. Cette méthode permet l'expression de protéines fluorescentes pendant plus de deux mois.

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Toutes les procédures ont été approuvées par l&#39;Université du Wisconsin Comité de protection des animaux et ont été en conformité avec les directives du NIH. Nous remercions le Dr Katherine Kalil pour l&#39;utilisation généreuse de son dispositif de Nucleofector. Nous remercions également les membres du laboratoire de la Dent de commentaires sur le protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-NS064014, Dana Foundation et la Fondation de Whitehall EWD Christopher Viesselmann, Jason et Derek Ballweg Lumbard contribué également à ce document.

1. Préparation des Lamelles et Chambers <ol><li> Préparation des lamelles propres et des chambres est indispensable pour les cultures en bonne santé. Raccourcis doit pas être pris à n'importe quel de ces étapes. </li><li> Lavez les lamelles (rond de 12mm ou 22mm, verre allemand - Caroline adjoint Marque) pendant la nuit dans l'acide nitrique concentré (HNO3) dans un bocal en verre dédié ou bécher. </li><li> Retirez les lamelles de l'acide nitrique et laver abondamment (5-7x) dans de l'eau déminéralisée. </li><li> Séparer les lamelles et sec dans une hotte à flux laminaire ou enceinte de biosécurité. Une fois sèches, les stériliser avec une lumière UV pendant 30 minutes. Placez des lamelles stérilisés dans une des boîtes de Pétri stériles pour le stockage. Si les neurones plaquage sur des lamelles de 12mm de placer directement des lamelles dans un plat stériles 35mm et passer à la section 2. </li><li> Chambres d'imagerie sont construits en perçant un trou de 15mm dans le fond de boîtes de Pétri de 35mm (supprimer tous les bavures) et attacher le couvre-nettoyées avec un mélange 3:1 de paraffine et de vaseline. </li><li> Faire fondre la paraffine / vaseline mélange dans un tube conique dans un bain d'eau bouillante. Utilisez un petit pinceau et enduire la face inférieure de la vaisselle autour du trou de 15mm. Veillez à garder en remuant la paraffine / vaseline mélange comme il se séparera. Cela se traduit généralement dans des chambres collées ensemble avec une concentration plus élevée de gelée de pétrole, qui va devenir visqueux quand les plats sont placés dans l'incubateur, ce qui entraîne un détachement lamelle. La paraffine restante / gelée de pétrole peut être conservé à température ambiante. </li><li> Placer le plat à l'envers sur un plateau plat et placer la lamelle sur le trou. Chauffer au four à 80 ° C jusqu'à ce que le mélange de paraffine est fondue (~ 10 minutes). Retirez les plats sur une surface plane et laissez le jeu mélange de paraffine. </li><li> Tournez les plats plus et stériliser la fois l'intérieur des couvertures et le fond des chambres avec la lumière UV. </li><li> Manteau des lamelles de verre ou de régions de chambres avec 1.0mg/mL Poly-D-lysine (30 kDa) en tampon borate (borate de sodium 0,1 M, pH 8,5) pendant une heure. Rincez 3-5 fois avec de grandes quantités d'eau de qualité culture de tissus déminéralisée. Assurez-vous d'enlever toute trace de tampon borate. Sec et l'utiliser immédiatement ou stocker des chambres / lamelles pour une utilisation ultérieure. Nous utilisons généralement des lamelles de nettoyer en un mois de préparation. </li></ol> 2. Préparation de la dissection neuronale et milieu de culture <ol><li> Préparer le milieu de dissection (DM) en ajoutant des quantités appropriées d'HBSS 10x et 100x HEPES à l'eau de qualité culture de tissus. Conserver à 4 ° C. Restez sur la glace lors de la dissection. </li><li> La veille de la dissection de préparer le milieu d'étalement (PM) et un milieu sans sérum (SFM). PM se compose de milieu Neurobasal, B27 supplément, 2 mM de glutamine, glucose 0,3%, 37,5 mM de NaCl et 5% de sérum fœtal bovin (FBS). GDF se compose de milieu Neurobasal, B27 supplément, 2 mM de glutamine, glucose 0,3% et 37,5 mM de NaCl. </li><li> Faire juste assez pour la dissection et de stocker dans une culture tissulaire pendant la nuit avec le bouchon incubateur légèrement entrouverte afin que la température et la teneur en CO 2 de l'équilibre les moyennes. Nous ajoutons de glucose supplémentaires et augmenter l'osmolalité à environ 310mOsm avec NaCl. Nous retrouvons les cultures réussissent mieux à une osmolalité plus physiologique (osmolalité Neurobasal est généralement de 205 245mOsm). </li></ol> 3. Préparation gliales corticales couche nourricière pour les cultures à long terme <ol><li> Si à long terme, les cultures doivent être préparés, d'effectuer cette partie de deux à trois semaines du protocole avant de continuer avec les dissections corticales ou hippocampiques. </li><li> Préparer le milieu gliales (GM) avec du MEM, le glucose 0,3%, pénicilline / streptomycine et du sérum de cheval 10%. </li><li> Euthanasier souriceaux P1-P3 par refroidissement sur de la glace pendant 5 minutes. Retirez chaque chiot de la glace et de pulvérisation avec de l'éthanol à 70%. Vite décapiter avec des ciseaux. Retirer l'ensemble du cerveau dans un plat contenant froide DM (étape 2.1). </li><li> Retirez les deux hémisphères cérébraux et des méninges. D'accise du néocortex et de supprimer d'un nouveau plat contenant aucun média. Préparer cortex de 4 cerveaux total. </li><li> Émincer le cortex avec un chiffon propre, lame de rasoir stérile aussi fine que possible et éliminer les tissus hachés avec une pipette en plastique à un tube conique de 50 ml contenant 12 ml de froid DM. Ajouter la trypsine et la DNase à des concentrations finales de 0,25% (1,5 ml) et 0,1% (1,5 ml), respectivement. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 minutes en remuant par intermittence. </li><li> Retirez le tube contenant le tissu cortical et bien nettoyer avec de l'éthanol à 70% avant la mise en culture de tissus de la hotte. Tissus corticaux Pipet haut et en bas avec une pipette de 10 ml environ 10-15 fois, ou jusqu'à ce que la plupart des morceaux de disparaître. </li><li> Retour le tube à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 10 minutes avec intermittente tourbillonnant. </li><li> Bien nettoyer le tube avec de l'éthanol 70% et le ramener à la hotte de culture de tissus. Déposer le tissu cortical de haut en bas avec un 5 mL pipette environ 10-15 fois, ou jusqu'à ce que les morceaux de disparaître. </li><li> Ajouter 15 ml d'eau tiède GM et centrifuger à 200xg (1000rpm) pendant 10 minutes. </li><li> Rejeter le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 20 ml de frais de GM et compter avec un hématimètre. Planche 5-7.5x10 6 cellules dans 15 ml de GM par 75cm 2 flacon. </li><li> Après un jour et tous les 2-3 jours suivants dans la culture, de déloger les cellules non adhérentes par frapper dans le ballon contre votre main. Retirez le support ainsi que toutes les cellules délogées et remplacer par 15 ml de frais de GM. </li><li> Glia peuvent être récoltées après 1-2 semaines de croissance dans les flacons, quand ils sont environ 70-100% de confluence. Pour préparer des lamelles individuelles revêtu de cellules gliales, l'acide nitrique lieu 6 nettoyé et stérilisé 25mm lamelles rondes dans un plat de 10cm, et la place 3 points du mélange 03:01 de paraffine / vaseline sur chaque lamelle dans un schéma triangulaire avec un petit pinceau . Traiter plats ouverte avec la lumière UV pendant 30 minutes. Enduire les lamelles avec 0,1 mg / ml de poly-D-lysine (30 kDa) dans un tampon borate pour une heure, puis laver abondamment (3-5x) avec de l'eau des tissus de qualité stériles culture déminéralisée et laissez sécher. </li><li> Retirer la fiole contenant gliales de l'incubateur, jetez le support et rincer avec 5 ml de pré-chauffé trypsine / EDTA. Retirer la solution de trypsine / EDTA de la fiole et la pipette 3 ml de frais préchauffé trypsine / EDTA dans le ballon. Incuber le ballon pendant 1 minute à 37 ° C avant d'ajouter 5 ml de GM à arrêter le traitement à la trypsine. </li><li> Retirez la glie du ballon par pipetage répété 10-15 fois, puis de transférer les médias à un tube conique 15 ml. Centrifuger à 200xg (1000rpm) pendant 8 minutes. Enlever le surnageant et ajouter 10 ml de GM, les cellules comptent, et la plaque de 5x10 5 cellules dans 12,5 ml de GM par plat 10cm contenant les lamelles. </li><li> Bourse du support avec des produits frais pré-chauffé GM tous les 2-3 jours. Le jour avant la dissection neurone, retirez le GM et le remplacer par l'AFD (section 2.2). Utilisez cette GDF gliales conditionné à l'étape où les inondations 4,12 cultures corticales ou hippocampiques. </li></ol> 4. Dissection corticale et / ou l'hippocampe et l'électroporation <ol><li> Retirer des quantités appropriées de solutions nucléofection (Lonza), combiner et se réchauffer à température ambiante avant de commencer la dissection. Depuis solution nucléofection a une durée de vie limitée lorsqu'elles sont combinées, nous ne combinent la quantité nécessaire pour chaque préparation (100 ul par transfection). </li><li> Euthanasier une souris enceinte à E15.5 avec du CO 2 (jour de la fiche est E 0,5) et enlever l'utérus à une boîte de Pétri de 10 cm. Retirez les foetus et les décapitent en froid DM (section 2.1). </li><li> Enlever le cerveau entier dans un plat à part du froid et de DM avec une aiguille de tungstène courbé, enlever les deux neocortices. Retirez les méninges avec microforceps et placez-le dans les cortex nouveau plat de froid DM. Avec une paire de ciseaux iris ou Wecker petits, retirez le cortex ou l'hippocampe et le placer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml remplie de 1,0 ml de froid DM. Gardez ce tube sur la glace. </li><li> Après dissection tous les corticales ou hippocampes, ajouter 110 ul de trypsine de 2,5% au tube Eppendorf contenant le tube de tissu et placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 20 minutes. </li><li> Retirez le cortex surnageant et laver ou hippocampes avec 1,0 mL PM (article 2.2) en retournant doucement le tube Eppendorf. Répétez le laver deux fois, en laissant 1 mL de PM dans le tube. </li><li> Triturer les morceaux 15 fois avec une pipette P1000, et éliminer les cellules surnageant / à un nouveau 15 ml tube conique contenant 4 ml de PM, laissant toute morceaux qui restent dans le tube Eppendorf. </li><li> Spin le tube de 15 ml à 20xg (350rpm) pendant 7 minutes avec le frein off. Jeter le surnageant et ajouter 100 ul de prémélange, la solution de nucléofection température ambiante (Lonza) pour chaque transfection. Triturer 5 fois avec un léger mouvement de haut en bas de la pipette P1000. </li><li> Retirer 100 pl de la solution de nucléofection / cellule mélange à chaque nouveau tube Eppendorf et ajoutez la quantité appropriée d'ADN. Pour les cultures à long terme que nous utilisons généralement 1-2μg d'ADN par transfection. Cependant, cette étiquette seule une petite proportion &lt;10% des neurones dans la culture. Nous utilisons généralement 5-10 pg d'ADN par transfection si vous voulez une plus grande efficacité de transfection pour la culture à court terme. Nous avons utilisé jusqu'à un total de 40μg d'ADN quand transfection avec deux plasmides différents. Les plasmides sont stockées dans un tampon TE à 1 pg / mL. </li><li> Ajouter suspension cellulaire / ADN à la cuve (Lonza) et électroporation des cellules dans le Nucleofector (Lonza), en utilisant le programme O-005 (SNC souris neurones). </li><li> En travaillant rapidement, ajouter 500 ul de PM préchauffé et équilibrée dans la cuvette et retirez solution / cellules dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml. Ajouter PM suffisante pour ramener le volume de chaque transfection à 1,0 mL. Compter les cellules avec un hémocytomètre et la plaque au 3-5x10 3 cellules / cm 2 pour les cultures jeunes, ou 5-10x10 3 cellules / cm 2 pour les cultures à long terme. &lt;/ Li&gt; </li><li> Pour cultures de courte durée, d'une inondation des boîtes de culture 35mm avec 2,0 mL de réchauffé, CO 2-GDF équilibrée après une heure de placage. Si vous utilisez des lamelles, nous supprimons la moitié de la PM et le remplacer par l'AFD, puis répéter deux fois plus. Soit les inondations les chambres d'imagerie ou de laver les résultats des lamelles dans une très faible teneur sérique (&lt;0,5%). Cultures à court terme n'ont pas besoin d'être cultivée avec une couche nourricière gliales et n'ont pas besoin d'être ré-alimentés. </li><li> Pour cultures à long terme, nous supprimons une lamelle glie couverts contenant trois points de paraffine / vaseline et l'inverser sur le trou de 15mm dans le plat de 35mm, une heure après plaquage initial. Deux millilitres de l'AFD conditionnée par le plat gliales est alors ajouté à la chambre d'imagerie. Pour nourrir les cultures à long terme, nous enlevons un tiers de la SFM tous les 2-3 jours et de le remplacer avec des produits frais, pré-chauffé et le CO 2-GDF équilibrée. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Vivre dans les neurones de l'hippocampe stades successifs de développement. Images appariées de représentant vivant neurones de l'hippocampe sont montrés à la fois comme une image de contraste interférentiel différentiel et une micrographie correspondante fluorescentes. Chacune de ces cellules a été transfectées avec EGFP-tubuline et DsRed2 dans des vecteurs pCAX. Les neurones ont été imagées à des jours suivants in vitro (DIV): Étape 1 (1div), Stade 2 (1div), Phase 3 (2DIV), étape 4 (11DIV) et l'étape 5 (32DIV). La barre d'échelle est 20μm.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
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Ce protocole de culture embryonnaire, les neurones de souris de l&#39;hippocampe et du cortex a été développé comme une modification du protocole de banquier, qui utilise le rat neurones 1,2. Nous avons utilisé ce protocole pour la souris et les neurones en culture de hamster ainsi 3,4,5,6,7. Ce protocole fonctionne aussi bien pour les neurones de l&#39;hippocampe et du néocortex fois et est similaire à un protocole publié par Meberg et Miller 8. Généralement, nous utilisons neurones de l&#39;hippocampe à long terme de culture, car ils sont bien caractérisés et un système modèle plus établies. Par ailleurs, ils sont susceptibles de contenir une population plus homogène de neurones que néocortex. Cependant, les neurones du néocortex cultivés en utilisant ce protocole aussi survivre et de se différencier de façon similaire (données non publiées). Nous utilisons régulièrement neurones de l&#39;hippocampe et le néocortex pour la culture à court terme. Dissection du néocortex se traduit également dans les neurones beaucoup plus élevés (1.5x10 6 neurones par paire de cortex) que la dissection hippocampique (2.5x10 5 neurones par paire de hippocampes), ce qui en fait un meilleur choix du matériau pour Western blot, par exemple. Comme pour toute culture primaire, il est essentiel de minimiser le temps que cela prend de la mort de l&#39;animal au bordé de cellules. Elle prendra généralement 10 à 20 dissections de devenir toujours rapide à la dissection et le placage. Aussi, lorsque vous travaillez avec le Nucleofector Lonza, il est essentiel de travailler rapidement pendant la procédure d&#39;électroporation, comme la viabilité des neurones diminue rapidement si elles sont laissées dans la mémoire tampon nucléofection. La plupart de nos images est réalisée avec un total de microscopie par fluorescence réflectance interne (TIRFM). Ce type de microscopie est seulement capable de l&#39;imagerie plusieurs centaines de nanomètres au-delà des lamelle. Par conséquent, les zones des neurones qui nous avons souvent l&#39;image, le cône de croissance axonal et des épines dendritiques, ont besoin d&#39;être collée directement sur la lamelle. Ainsi, nous utilisons des cultures à faible densité qui nécessitent l&#39;alimentation gliales pour la culture à long terme. Nous avons utilisé des cultures de densité plus élevée (&gt; 2x10 4 cellules / cm 2), sans couches nourricières gliales, à long terme des cultures et a constaté qu&#39;ils survivent très bien avec une alimentation peu. Cependant, les épines dendritiques de ces neurones sont souvent trop éloignés du substrat à l&#39;image de TIRFM, même si elles peuvent être facilement détectés par microscopie à champ large ou de microscopie confocale. Dans la plupart de nos études, nous transfecter des neurones, avant le placage, et ont imagé protéines marqués à la fluorescence pour un maximum de trois mois en culture. Cette expression à long terme des protéines marqués à la fluorescence nous donne confiance qu&#39;en utilisant de faibles concentrations de l&#39;ADN (1-2μg) nous ne produisons pas des artefacts surexpression dans les neurones. Cependant, cette procédure peut également être utilisé pour étudier la surexpression de protéines, si de grandes quantités d&#39;ADN sont utilisées (10-20 pg). Les plasmides que nous utilisons pour transfecter des neurones contiennent habituellement des protéines de fusion EGFP ou mCherry, bien que nous avons aussi l&#39;étiquette du cytoplasme neuronal avec DsRed2 ou EGFP seul. Cette technique d&#39;électroporation fonctionne bien avec un certain nombre de vecteurs. Nous préférons les plasmides qui contiennent un promoteur β-actine avec un enhancer du CMV et de β-globine queue poly-A (ou pCAGGS pCAX plasmides) 9, en raison des niveaux relativement élevés d&#39;expression, et le fait qu&#39;ils sont bien tolérés par les neurones dans les deux cultures à court et à long terme. Généralement, les protéines commencent à exprimer au sein d&#39;environ 4 heures de placage et atteindre un niveau suffisant pour l&#39;imagerie dans les 10-24h 10. Nous avons utilisé avec succès CMV promoteur axée plasmides à court terme, les cultures, mais ils ont constaté qu&#39;ils peuvent causer des niveaux élevés de surexpression qui tuent les neurones à long terme de la culture. Néanmoins, nous avons constaté que le conditionnement des cultures gliales faible densité contribue à la survie des neurones transfectées avec des plasmides promoteur CMV-conduit, par rapport à une densité plus élevée (non-gliales nourris) des cultures.

* La plupart des réactifs que nous conserver à -80 ° C peuvent être stockés à -20 ° C ainsi. Leur stockage à -80 ° C allonge leur durée de vie et les résultats dans les cultures un peu plus cohérent.

nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Neurones de l&#39;hippocampe et le cortex ont été largement utilisées pour étudier le système nerveux central (SNC) la polarisation des neurones, l&#39;axone / dendrite excroissance, et la formation des synapses et la fonction. Un avantage de la culture de ces neurones est qu&#39;ils polarisent facilement, formant des axones et des dendrites distinctifs, sur un substrat en deux dimensions à des densités très faibles. Cette propriété rend extrêmement utile pour déterminer de nombreux aspects du développement neuronal. Par ailleurs, en fournissant conditionné glial pour ces neurones, ils continueront à se développer, formant connexions synaptiques fonctionnelles et survivre pendant plusieurs mois en culture. Dans ce protocole, nous présentons une technique de disséquer, de culture et de transfecter des neurones embryonnaires de souris de l&#39;hippocampe et du cortex. La transfection est réalisée par électroporation ADN dans les neurones avant l&#39;étalement via nucléofection. Ce protocole a l&#39;avantage d&#39;exprimer des protéines de fusion par fluorescence marqués au début de développement (~ 4-8h après le placage) pour étudier la dynamique et la fonction des protéines au cours excroissance axonale polarisation, et la ramification. Nous avons également découvert que cette transfection unique avant plaquage maintient marqués par fluorescence expression des protéines de fusion à des niveaux appropriés pour l&#39;imagerie pendant toute la durée du neurone (&gt; 2 mois en culture). Ainsi, cette méthodologie est utile pour étudier la localisation des protéines et la fonction à travers le développement du SNC avec peu ou pas de perturbations de la fonction neuronale.

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à disséquer, transfecter par électroporation et de neurones de souris de la culture de l&#39;hippocampe et du cortex. Cultures à court terme peut être utilisé pour des études d&#39;excroissance axonale et d&#39;orientation, tout en cultures à long terme peut être utilisé pour des études de la synaptogenèse et l&#39;analyse des épines dendritiques.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Les neurones hippocampiques et corticaux ont été largement utilisés pour étudier la polarisation neuronale du système nerveux central (SNC), la croissance axonale et dendritique, ainsi que...

Les neurones hippocampiques et corticaux sont largement utilisés pour étudier la polarisation neuronale du système nerveux central, la croissance des axones et des dendrites, ainsi que la formation et la fonction des synapses. Un avantage de la culture de ces neurones est qu'ils se polarisent facilement, formant des axones et des dendrites distincts sur un substrat bidimensionnel à très faible densité. Cette vidéo montre une technique permettant de disséquer, cultiver et transfecter des neurones embryonnaires hippocampiques et corticaux de souris par nucléofection, méthode qui permet l'expression de protéines de fusion marquées par un fluorophore dès les premiers stades du développement, environ quatre à huit heures après le semis. L'expression des protéines marquées par un fluorophore est maintenue tout au long de la vie du neurone, pendant plus de deux mois en culture. Cela permet d'étudier la fonction des protéines durant les événements précoces du développement, tels que la croissance axonale, ainsi que lors d'événements ultérieurs comme la synaptogenèse et la plasticité synaptique.Les premières cellules gliales sont isolées à partir des hémisphères corticaux de souriceaux postnataux âgés d'un à trois jours et mises en culture dans des flacons. Une fois la confluence atteinte entre 70 et 100 %, les cellules gliales sont ensuite resemées sur des lamelles de verre.Ensuite, des neurones hippocampiques ou corticaux sont isolés à partir de souris E 15,5 et transfectés par nucléofection avec des plasmides codant pour des protéines de fusion fluorescentes telles que la protéine fluorescente rouge. Les neurones transfectés sont ensuite mis en culture dans des chambres d'imagerie pour des études à court terme. Pour les cultures à long terme, des cellules gliales sur des lamelles de verre sont inversées au-dessus des cultures hippocampiques ou corticales afin d'assurer un soutien trophique ; des neurones individuels peuvent alors être observés afin de montrer la localisation dynamique des protéines de fusion dans les axones ou les dendrites des neurones.Bonjour, je suis Eric Dent, professeur adjoint d'anatomie à l'Université du Wisconsin à Madison. Aujourd'hui, trois de mes étudiants de premier cycle, Chris Wezelman, Jason Bwe et Derek Lombard, vont démontrer une procédure permettant d'isoler, de semer et de maintenir en culture des neurones corticaux et hippocampiques pour des cultures à court et à long terme. Ces cultures peuvent être utilisées pour étudier la dynamique de protéines de fusion fluorescentes tout au long du développement neuronal, depuis la sortie initiale des neurites jusqu'au développement des axones et des dendrites, ainsi que la synaptogenèse.Pour préparer les chambres d'imagerie destinées aux neurones embryonnaires de la région hippocampique et corticale de la souris, commencez par des boîtes de Pétri de 35 millimètres munies d'un trou de 15 millimètres percé dans le fond, tous les rebords étant soigneusement éliminés. Faites fondre un mélange de paraffine et de vaseline dans un rapport de trois à un dans un tube conique en le plaçant dans un bain d'eau bouillante.Ensuite, utilisez un petit pinceau pour enduire la face inférieure de la boîte autour du trou. Veillez à bien remuer le mélange de paraffine et de gelée de pétrole entre les chambres, car il a tendance à se séparer. Placez la lame couvre-objet au-dessus du trou.Une fois que tous les plats ont été préparés, placez-les dans un four à 80 degrés Celsius jusqu'à ce que le mélange de paraffine soit fondu. Cela devrait prendre environ 10 minutes. Ensuite, retirez les plats sur une surface plane et laissez le mélange de paraffine durcir pendant au moins une minute.Retournez les boîtes et placez-les sous une hotte. Allumez la lumière UV pendant 30 minutes afin de stériliser l'intérieur des couvercles ainsi que le fond des chambres. Ensuite, appliquez un revêtement.Incubez les lamelles recouvertes avec du poly-D-lycine pendant une heure. Rincez ensuite soigneusement les lamelles recouvertes de trois à cinq fois avec de l'eau déionisée stérile filtrée afin d'éliminer toute trace de tampon borique. Après le dernier rinçage, utilisez un vide pour sécher les chambres. Celles-ci peuvent être utilisées immédiatement ou conservées dans une chambre de culture tissulaire pour une utilisation ultérieure.Les chambres revêtues doivent être utilisées dans la semaine suivant leur préparation si l'on prévoit des cultures à long terme. Les couches de cellules gliales corticales servant de support devront être mises en place deux à trois semaines avant de poursuivre les dissections corticales ou hippocampiques. Placer les cerveaux de quatre souriceaux âgés de P1 à P3 dans une boîte contenant un milieu de dissection froid et la placer sous la loupe stéréoscopique.Retirer les bulbes olfactifs, les deux hémisphères cérébraux et les méninges. Transférer les hémisphères dans un nouveau plat ne contenant aucun milieu. À l’aide d’une lame de rasoir stérile propre, hacher les corticaux le plus finement possible.Ensuite, à l’aide d’une pipette en plastique, transférer le tissu haché dans un tube conique de 50 millilitres contenant 12 millilitres de milieu de dissection froid. Ajouter la trypsine et l’ADN à des concentrations finales respectives de 0,25 % et 0,1 %. Incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avec des rotations intermittentes.Après l'incubation, retirez le tube du bain-marie et nettoyez-le soigneusement avec de l'éthanol à 70 % avant de l'introduire dans la hotte de culture de tissus. Pipetez le tissu cortical plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Avec une pipette de 10 millilitres, aspirez et expulsez environ 10 à 15 fois ou jusqu’à ce que la plupart des morceaux disparaissent, puis remettez le tube au bain-marie pendant encore 10 minutes avec des rotations intermittentes. Nettoyez soigneusement le tube avec de l’éthanol à 70 % et ramenez-le sous la hotte de culture cellulaire.Pipetez le tissu cortical de haut en bas. Cette fois, comme précédemment, à l’aide d’une pipette de cinq millilitres, ajoutez 15 millilitres de milieu glial chaud et centrifugez à 1000 tr/min pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules en culot dans 20 millilitres de milieu glial frais.Utilisez un cytomètre à hématies pour compter les cellules. Ensuite, ensemencez cinq à 7,5 millions de cellules dans 15 millilitres de milieu glial par flacon de 75 centimètres carrés. Placez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius ; après un jour, puis tous les deux à trois jours suivants en culture, détachez les cellules libres en tapant le flacon contre la surface de la hotte.Retirer le milieu ainsi que les cellules éventuellement détachées, puis le remplacer par 15 millilitres de milieu glial frais. Les cellules gliales peuvent être récoltées après une à deux semaines de croissance dans les flacons, lorsqu'elles sont sur le point d'atteindre une confluence d'environ 100 %. Pour préparer des lamelles individuelles recouvertes de cellules gliales, commencer par placer six lamelles nettoyées à l'acide nitrique et stérilisées.Des lamelles rondes de 25 millimètres dans une boîte de 10 centimètres et, à l’aide d’un petit pinceau, déposez trois points de mélange de vaseline paraffinée et de pétrole dans un rapport trois pour un. Sur chaque lamelle, disposez-les en motif triangulaire. Placez deux points sur les bords de la lamelle afin de l’ancrer à la boîte. Traitez les boîtes ouvertes avec de la lumière UV pendant 30 minutes. Recouvrez les lamelles de poly-D-lysine pendant une heure. Ensuite, lavez-les abondamment trois à cinq fois avec de l'eau déionisée stérile filtrée et laissez-les sécher. Retirez les cellules gliales de l'incubateur.Jetez le milieu et lavez avec cinq millilitres de trypsine préchauffée. Ajoutez trois millilitres de trypsine dans le flacon et incubez une minute à 37 degrés Celsius. Une fois les cellules détachées, ajoutez cinq millilitres de milieu glial pour arrêter la trypsine.Retirez le GL du flacon en pipettant de haut en bas de 10 à 15 fois. Ensuite, transférez le milieu dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 1000 tr/min pendant huit minutes. Après la centrifugation, resuspendez les cellules dans 10 millilitres de milieu glial.Ensuite, après avoir compté les cellules, plaquez cinq fois dix puissance cinq cellules dans 12,5 millilitres de milieu glial par boîte de 10 centimètres contenant les lamelles. Remplacez le milieu par du milieu glial frais préchauffé tous les deux à trois jours, la veille de la dissection des neurones. Retirez le milieu glial et remplacez-le par un milieu sans sérum.Utilisez ultérieurement ce milieu sans sérum conditionné par les cellules gliales. Lors de l'ajout sur des cultures corticales ou hippocampiques, un C est ajouté à une concentration finale de cinq micromolaire. Afin d'empêcher la prolifération gliale, ajoutez les réactifs de nucléofection selon les instructions du fabricant, puis réchauffez la solution à la température ambiante.Placer une boîte contenant des cerveaux de souris E 15,5 dans un milieu de dissection froid. Sous microscope de dissection, utiliser une aiguille courbée en tungstène pour retirer les deux néocortices. Puis, à l’aide de micro-forceps, enlever les méninges et placer les corticaux dans une nouvelle boîte contenant du milieu de dissection froid.Le hippocampe et le cortex sont visibles le long du côté médial de l'hémisphère cérébral à l'aide de petites ciseaux à iris. Retirez soigneusement l'hippocampe. Ensuite, retirez le cortex restant.Répétez la dissection sur les cerveaux de toute la portée. Placez les corticales de l’hippocampe dans des microtubes séparés de 1,5 millilitre contenant un millilitre de milieu de dissection froid. Placez les tubes sur de la glace après avoir disséqué toutes les corticales des hippocampes.Ajouter 110 microlitres de trypsine à 2,5 % dans les tubes microfuge contenant le tissu, puis placer les tubes dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. À l’aide d’une pipette P1000, retirer autant de liquide que possible du tube. Ensuite, ajouter un millilitre de milieu de culture dans chaque tube et laver le tissu en inversant doucement le tube microfuge.Répétez le lavage deux fois. Après le dernier lavage, ajoutez un millilitre de milieu de culture. Utilisez une pipette P1000 pour trier les fragments 15 fois. Transférez ensuite le surnageant et les cellules dans un nouveau tube conique de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu de culture, en laissant les éventuels fragments restants dans un tube microfuge.Faire tourner le tube de 15 millilitres à 350 tr/min pendant sept minutes avec arrêt sans frein après la centrifugation, jeter le surnageant et ajouter 100 microlitres de solution de nucléofection pré-mélangée à température ambiante. Pour chaque transfection, pipeter cinq fois de haut en bas pour bien mélanger, puis transférer 100 microlitres de la solution de nucléofection et du mélange cellulaire dans chaque nouveau tube microfuge contenant une quantité appropriée d'ADN (un à deux microgrammes d'ADN par transfection). Pour les cultures à long terme, cela marquera moins de 10 % des neurones présents dans la culture.Bien que cinq à dix microgrammes d'ADN par transfection permettent d'obtenir une efficacité de transfection plus élevée pour la culture, ajoutez le mélange de suspension cellulaire et d'ADN dans une cuvette d'électroporation. Puis placez la cuvette dans l'électroporateur. Pour les neurones du SNC de la souris, réglez le programme du nucléofecteur sur oh 0 0 5 ; travaillez rapidement, ajoutez 500 microlitres du milieu de mise en culture préalablement réchauffé et équilibré dans la cuvette et transférez la solution cellulaire dans un nouveau tube microfuge de 1,5 millilitre.Ajouter suffisamment de milieu de culture pour amener le volume de chaque transfection à un millilitre. Après avoir dénombré les cellules, ensemencer trois à cinq fois 10³ cellules par centimètre carré pour les cultures jeunes, ou cinq à dix fois 10³ cellules par pour cent de mètre carré pour les cultures à long terme, généralement cinq fois 10⁵ ou une fois 10⁶. Les cellules sont utilisées par transfection pour préparer des cultures à court terme.Une heure après le semis, inonder les boîtes de culture de 35 millimètres avec deux millilitres de milieu sans sérum, préchauffé et équilibré au dioxyde de carbone. Les chambres d'observation présentent une teneur très faible en sérum, inférieure à 0,5 %. Les cultures à court terme n'ont pas besoin d'être cultivées avec une couche de cellules gliales nourricières et ne doivent pas être resemées. Pour préparer des cultures à long terme, ajouter un millilitre de milieu conditionné par les cellules gliales au milieu sans sérum.Retirez une lamelle recouverte d’un film de vaseline paraffinée composé de trois points et retournez-la au-dessus du trou de 15 millimètres dans la boîte de 35 mm. Ensuite, ajoutez un autre millilitre de milieu pour nourrir les cultures à long terme. Remplacez un tiers du milieu sans sérum tous les deux à trois jours.Après cinq à sept jours en culture, de la cytosine arabinoside (Ara-IDE) ou de l'AEE est ajoutée à une concentration finale de cinq micromoles afin d'empêcher la prolifération gliale. Les images appariées suivantes de neurones hippocampiques vivants représentatifs montrent à la fois une image en contraste interférentiel différentiel et une micrographie fluorescente correspondante. Chacune de ces cellules a été transfectée avec l'EGFP, la tubuline et le DS red deux dans des vecteurs PA.Au cours de la phase un, les neurones s'attachent initialement et, sur une période d'environ un jour, émettent des lamellipodes en forme de feuillet et des filopodes en forme de doigts autour de la périphérie du corps cellulaire. Au cours de la phase deux, les protrusions initiales se différencient en plusieurs neurites émanant du corps cellulaire, restant généralement d'une longueur d'environ 30 à 50 micromètres. Au cours de la phase trois, de manière stochastique, l'un des neurites commence à s'allonger rapidement pour devenir l'axone.Les autres neurites restent courtes et sont appelées processus mineurs. La plupart des neurones hippocampiques et corticaux passent au stade trois entre deux et trois jours en culture. Pendant le stade quatre, qui se déroule au cours de la semaine ou des deux semaines suivantes, les processus mineurs s'épaississent, s'allongent et se ramifient pour devenir les dendrites ; ceux-ci sont représentés en vert ici. Pendant ce temps, l'axone s'amincit tout en continuant à croître et à se ramifier entre deux et trois semaines.En culture, les dendrites se différencient en formant des épines dendritiques, de petites protubérances le long des dendrites. Les neurones au stade cinq varieront selon leur forme et leur taille, mais la plupart devraient suivre cette série d'étapes de développement. Les neurones transfectés peuvent ne pas progresser à travers ces stades si la surexpression de protéines perturbe le développement neuronal.De plus, les neurones peuvent ne pas progresser à travers toutes les étapes du développement. Si les lamelles ne sont pas correctement nettoyées ou si le polylysine n'adhère pas correctement, les cellules gliales peuvent également se multiplier abondamment, surtout si un C n'est pas utilisé. Il s'agit d'une image en contraste de phase d'une culture âgée de deux semaines dans laquelle les cellules gliales ont envahi la culture dans les cultures à long terme.Changer le milieu trop fréquemment ou pas assez souvent peut également compromettre la viabilité des neurones. Il s'agit d'une image en contraste de phase d'une culture dans laquelle la majorité des neurones sont morts et les neurones restants présentent des corps cellulaires rétractés et des prolongements en chapelet. À titre de comparaison, voici une image en contraste de phase de neurones hippocampiques sains après deux semaines en culture. Remarquez les corps cellulaires plus volumineux et l'absence de bourrelets dans les prolongements.À ce stade, les processus dendritiques se sont épaissis et un réseau dense de prolongements axonaux est visible. Une fois maîtrisées, les étapes d'isolement embryonnaire, de dissection corticale, de transfection et de mise en culture de la portée entière de fœtus peuvent être réalisées en deux heures si elles sont effectuées correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de garder à l'esprit que les neurones hippocampiques et corticaux sont très sensibles aux perturbations mécaniques.En outre, il est important de maintenir les solutions aussi froides que possible pendant l'isolement des neurones afin de réduire l'activité métabolique au minimum. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'imagerie de cellules vivantes et l'enregistrement physiologique de l'activité peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la manière dont les protéines de fusion fluorescentes d'intérêt se répartissent dans différentes régions du neurone. Si la localisation des protéines est associée à des changements de l'activité synaptique, ou comment les fonctions de ces protéines sont affectées par différents traitements pharmacologiques.

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