Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Les neurones hippocampiques et corticaux sont largement utilisés pour étudier la polarisation neuronale du système nerveux central, la croissance des axones et des dendrites, ainsi que la formation et la fonction des synapses. Un avantage de la culture de ces neurones est qu'ils se polarisent facilement, formant des axones et des dendrites distincts sur un substrat bidimensionnel à très faible densité. Cette vidéo montre une technique permettant de disséquer, cultiver et transfecter des neurones embryonnaires hippocampiques et corticaux de souris par nucléofection, méthode qui permet l'expression de protéines de fusion marquées par un fluorophore dès les premiers stades du développement, environ quatre à huit heures après le semis. L'expression des protéines marquées par un fluorophore est maintenue tout au long de la vie du neurone, pendant plus de deux mois en culture. Cela permet d'étudier la fonction des protéines durant les événements précoces du développement, tels que la croissance axonale, ainsi que lors d'événements ultérieurs comme la synaptogenèse et la plasticité synaptique.

Les premières cellules gliales sont isolées à partir des hémisphères corticaux de souriceaux postnataux âgés d'un à trois jours et mises en culture dans des flacons. Une fois la confluence atteinte entre 70 et 100 %, les cellules gliales sont ensuite resemées sur des lamelles de verre.

Ensuite, des neurones hippocampiques ou corticaux sont isolés à partir de souris E 15,5 et transfectés par nucléofection avec des plasmides codant pour des protéines de fusion fluorescentes telles que la protéine fluorescente rouge. Les neurones transfectés sont ensuite mis en culture dans des chambres d'imagerie pour des études à court terme. Pour les cultures à long terme, des cellules gliales sur des lamelles de verre sont inversées au-dessus des cultures hippocampiques ou corticales afin d'assurer un soutien trophique ; des neurones individuels peuvent alors être observés afin de montrer la localisation dynamique des protéines de fusion dans les axones ou les dendrites des neurones.

Bonjour, je suis Eric Dent, professeur adjoint d'anatomie à l'Université du Wisconsin à Madison. Aujourd'hui, trois de mes étudiants de premier cycle, Chris Wezelman, Jason Bwe et Derek Lombard, vont démontrer une procédure permettant d'isoler, de semer et de maintenir en culture des neurones corticaux et hippocampiques pour des cultures à court et à long terme. Ces cultures peuvent être utilisées pour étudier la dynamique de protéines de fusion fluorescentes tout au long du développement neuronal, depuis la sortie initiale des neurites jusqu'au développement des axones et des dendrites, ainsi que la synaptogenèse.

Pour préparer les chambres d'imagerie destinées aux neurones embryonnaires de la région hippocampique et corticale de la souris, commencez par des boîtes de Pétri de 35 millimètres munies d'un trou de 15 millimètres percé dans le fond, tous les rebords étant soigneusement éliminés. Faites fondre un mélange de paraffine et de vaseline dans un rapport de trois à un dans un tube conique en le plaçant dans un bain d'eau bouillante.

Ensuite, utilisez un petit pinceau pour enduire la face inférieure de la boîte autour du trou. Veillez à bien remuer le mélange de paraffine et de gelée de pétrole entre les chambres, car il a tendance à se séparer. Placez la lame couvre-objet au-dessus du trou.

Une fois que tous les plats ont été préparés, placez-les dans un four à 80 degrés Celsius jusqu'à ce que le mélange de paraffine soit fondu. Cela devrait prendre environ 10 minutes. Ensuite, retirez les plats sur une surface plane et laissez le mélange de paraffine durcir pendant au moins une minute.

Retournez les boîtes et placez-les sous une hotte. Allumez la lumière UV pendant 30 minutes afin de stériliser l'intérieur des couvercles ainsi que le fond des chambres. Ensuite, appliquez un revêtement.

Incubez les lamelles recouvertes avec du poly-D-lycine pendant une heure. Rincez ensuite soigneusement les lamelles recouvertes de trois à cinq fois avec de l'eau déionisée stérile filtrée afin d'éliminer toute trace de tampon borique. Après le dernier rinçage, utilisez un vide pour sécher les chambres. Celles-ci peuvent être utilisées immédiatement ou conservées dans une chambre de culture tissulaire pour une utilisation ultérieure.

Les chambres revêtues doivent être utilisées dans la semaine suivant leur préparation si l'on prévoit des cultures à long terme. Les couches de cellules gliales corticales servant de support devront être mises en place deux à trois semaines avant de poursuivre les dissections corticales ou hippocampiques. Placer les cerveaux de quatre souriceaux âgés de P1 à P3 dans une boîte contenant un milieu de dissection froid et la placer sous la loupe stéréoscopique.

Retirer les bulbes olfactifs, les deux hémisphères cérébraux et les méninges. Transférer les hémisphères dans un nouveau plat ne contenant aucun milieu. À l’aide d’une lame de rasoir stérile propre, hacher les corticaux le plus finement possible.

Ensuite, à l’aide d’une pipette en plastique, transférer le tissu haché dans un tube conique de 50 millilitres contenant 12 millilitres de milieu de dissection froid. Ajouter la trypsine et l’ADN à des concentrations finales respectives de 0,25 % et 0,1 %. Incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avec des rotations intermittentes.

Après l'incubation, retirez le tube du bain-marie et nettoyez-le soigneusement avec de l'éthanol à 70 % avant de l'introduire dans la hotte de culture de tissus. Pipetez le tissu cortical plusieurs fois vers le haut et vers le bas.

Avec une pipette de 10 millilitres, aspirez et expulsez environ 10 à 15 fois ou jusqu’à ce que la plupart des morceaux disparaissent, puis remettez le tube au bain-marie pendant encore 10 minutes avec des rotations intermittentes. Nettoyez soigneusement le tube avec de l’éthanol à 70 % et ramenez-le sous la hotte de culture cellulaire.

Pipetez le tissu cortical de haut en bas. Cette fois, comme précédemment, à l’aide d’une pipette de cinq millilitres, ajoutez 15 millilitres de milieu glial chaud et centrifugez à 1000 tr/min pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules en culot dans 20 millilitres de milieu glial frais.

Utilisez un cytomètre à hématies pour compter les cellules. Ensuite, ensemencez cinq à 7,5 millions de cellules dans 15 millilitres de milieu glial par flacon de 75 centimètres carrés. Placez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius ; après un jour, puis tous les deux à trois jours suivants en culture, détachez les cellules libres en tapant le flacon contre la surface de la hotte.

Retirer le milieu ainsi que les cellules éventuellement détachées, puis le remplacer par 15 millilitres de milieu glial frais. Les cellules gliales peuvent être récoltées après une à deux semaines de croissance dans les flacons, lorsqu'elles sont sur le point d'atteindre une confluence d'environ 100 %. Pour préparer des lamelles individuelles recouvertes de cellules gliales, commencer par placer six lamelles nettoyées à l'acide nitrique et stérilisées.

Des lamelles rondes de 25 millimètres dans une boîte de 10 centimètres et, à l’aide d’un petit pinceau, déposez trois points de mélange de vaseline paraffinée et de pétrole dans un rapport trois pour un. Sur chaque lamelle, disposez-les en motif triangulaire. Placez deux points sur les bords de la lamelle afin de l’ancrer à la boîte.

Traitez les boîtes ouvertes avec de la lumière UV pendant 30 minutes. Recouvrez les lamelles de poly-D-lysine pendant une heure. Ensuite, lavez-les abondamment trois à cinq fois avec de l'eau déionisée stérile filtrée et laissez-les sécher. Retirez les cellules gliales de l'incubateur.

Jetez le milieu et lavez avec cinq millilitres de trypsine préchauffée. Ajoutez trois millilitres de trypsine dans le flacon et incubez une minute à 37 degrés Celsius. Une fois les cellules détachées, ajoutez cinq millilitres de milieu glial pour arrêter la trypsine.

Retirez le GL du flacon en pipettant de haut en bas de 10 à 15 fois. Ensuite, transférez le milieu dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 1000 tr/min pendant huit minutes. Après la centrifugation, resuspendez les cellules dans 10 millilitres de milieu glial.

Ensuite, après avoir compté les cellules, plaquez cinq fois dix puissance cinq cellules dans 12,5 millilitres de milieu glial par boîte de 10 centimètres contenant les lamelles. Remplacez le milieu par du milieu glial frais préchauffé tous les deux à trois jours, la veille de la dissection des neurones. Retirez le milieu glial et remplacez-le par un milieu sans sérum.

Utilisez ultérieurement ce milieu sans sérum conditionné par les cellules gliales. Lors de l'ajout sur des cultures corticales ou hippocampiques, un C est ajouté à une concentration finale de cinq micromolaire. Afin d'empêcher la prolifération gliale, ajoutez les réactifs de nucléofection selon les instructions du fabricant, puis réchauffez la solution à la température ambiante.

Placer une boîte contenant des cerveaux de souris E 15,5 dans un milieu de dissection froid. Sous microscope de dissection, utiliser une aiguille courbée en tungstène pour retirer les deux néocortices. Puis, à l’aide de micro-forceps, enlever les méninges et placer les corticaux dans une nouvelle boîte contenant du milieu de dissection froid.

Le hippocampe et le cortex sont visibles le long du côté médial de l'hémisphère cérébral à l'aide de petites ciseaux à iris. Retirez soigneusement l'hippocampe. Ensuite, retirez le cortex restant.

Répétez la dissection sur les cerveaux de toute la portée. Placez les corticales de l’hippocampe dans des microtubes séparés de 1,5 millilitre contenant un millilitre de milieu de dissection froid. Placez les tubes sur de la glace après avoir disséqué toutes les corticales des hippocampes.

Ajouter 110 microlitres de trypsine à 2,5 % dans les tubes microfuge contenant le tissu, puis placer les tubes dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. À l’aide d’une pipette P1000, retirer autant de liquide que possible du tube. Ensuite, ajouter un millilitre de milieu de culture dans chaque tube et laver le tissu en inversant doucement le tube microfuge.

Répétez le lavage deux fois. Après le dernier lavage, ajoutez un millilitre de milieu de culture. Utilisez une pipette P1000 pour trier les fragments 15 fois. Transférez ensuite le surnageant et les cellules dans un nouveau tube conique de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu de culture, en laissant les éventuels fragments restants dans un tube microfuge.

Faire tourner le tube de 15 millilitres à 350 tr/min pendant sept minutes avec arrêt sans frein après la centrifugation, jeter le surnageant et ajouter 100 microlitres de solution de nucléofection pré-mélangée à température ambiante. Pour chaque transfection, pipeter cinq fois de haut en bas pour bien mélanger, puis transférer 100 microlitres de la solution de nucléofection et du mélange cellulaire dans chaque nouveau tube microfuge contenant une quantité appropriée d'ADN (un à deux microgrammes d'ADN par transfection). Pour les cultures à long terme, cela marquera moins de 10 % des neurones présents dans la culture.

Bien que cinq à dix microgrammes d'ADN par transfection permettent d'obtenir une efficacité de transfection plus élevée pour la culture, ajoutez le mélange de suspension cellulaire et d'ADN dans une cuvette d'électroporation. Puis placez la cuvette dans l'électroporateur. Pour les neurones du SNC de la souris, réglez le programme du nucléofecteur sur oh 0 0 5 ; travaillez rapidement, ajoutez 500 microlitres du milieu de mise en culture préalablement réchauffé et équilibré dans la cuvette et transférez la solution cellulaire dans un nouveau tube microfuge de 1,5 millilitre.

Ajouter suffisamment de milieu de culture pour amener le volume de chaque transfection à un millilitre. Après avoir dénombré les cellules, ensemencer trois à cinq fois 10³ cellules par centimètre carré pour les cultures jeunes, ou cinq à dix fois 10³ cellules par pour cent de mètre carré pour les cultures à long terme, généralement cinq fois 10⁵ ou une fois 10⁶. Les cellules sont utilisées par transfection pour préparer des cultures à court terme.

Une heure après le semis, inonder les boîtes de culture de 35 millimètres avec deux millilitres de milieu sans sérum, préchauffé et équilibré au dioxyde de carbone. Les chambres d'observation présentent une teneur très faible en sérum, inférieure à 0,5 %. Les cultures à court terme n'ont pas besoin d'être cultivées avec une couche de cellules gliales nourricières et ne doivent pas être resemées. Pour préparer des cultures à long terme, ajouter un millilitre de milieu conditionné par les cellules gliales au milieu sans sérum.

Retirez une lamelle recouverte d’un film de vaseline paraffinée composé de trois points et retournez-la au-dessus du trou de 15 millimètres dans la boîte de 35 mm. Ensuite, ajoutez un autre millilitre de milieu pour nourrir les cultures à long terme. Remplacez un tiers du milieu sans sérum tous les deux à trois jours.

Après cinq à sept jours en culture, de la cytosine arabinoside (Ara-IDE) ou de l'AEE est ajoutée à une concentration finale de cinq micromoles afin d'empêcher la prolifération gliale. Les images appariées suivantes de neurones hippocampiques vivants représentatifs montrent à la fois une image en contraste interférentiel différentiel et une micrographie fluorescente correspondante. Chacune de ces cellules a été transfectée avec l'EGFP, la tubuline et le DS red deux dans des vecteurs PA.

Au cours de la phase un, les neurones s'attachent initialement et, sur une période d'environ un jour, émettent des lamellipodes en forme de feuillet et des filopodes en forme de doigts autour de la périphérie du corps cellulaire. Au cours de la phase deux, les protrusions initiales se différencient en plusieurs neurites émanant du corps cellulaire, restant généralement d'une longueur d'environ 30 à 50 micromètres. Au cours de la phase trois, de manière stochastique, l'un des neurites commence à s'allonger rapidement pour devenir l'axone.

Les autres neurites restent courtes et sont appelées processus mineurs. La plupart des neurones hippocampiques et corticaux passent au stade trois entre deux et trois jours en culture. Pendant le stade quatre, qui se déroule au cours de la semaine ou des deux semaines suivantes, les processus mineurs s'épaississent, s'allongent et se ramifient pour devenir les dendrites ; ceux-ci sont représentés en vert ici. Pendant ce temps, l'axone s'amincit tout en continuant à croître et à se ramifier entre deux et trois semaines.

En culture, les dendrites se différencient en formant des épines dendritiques, de petites protubérances le long des dendrites. Les neurones au stade cinq varieront selon leur forme et leur taille, mais la plupart devraient suivre cette série d'étapes de développement. Les neurones transfectés peuvent ne pas progresser à travers ces stades si la surexpression de protéines perturbe le développement neuronal.

De plus, les neurones peuvent ne pas progresser à travers toutes les étapes du développement. Si les lamelles ne sont pas correctement nettoyées ou si le polylysine n'adhère pas correctement, les cellules gliales peuvent également se multiplier abondamment, surtout si un C n'est pas utilisé. Il s'agit d'une image en contraste de phase d'une culture âgée de deux semaines dans laquelle les cellules gliales ont envahi la culture dans les cultures à long terme.

Changer le milieu trop fréquemment ou pas assez souvent peut également compromettre la viabilité des neurones. Il s'agit d'une image en contraste de phase d'une culture dans laquelle la majorité des neurones sont morts et les neurones restants présentent des corps cellulaires rétractés et des prolongements en chapelet. À titre de comparaison, voici une image en contraste de phase de neurones hippocampiques sains après deux semaines en culture. Remarquez les corps cellulaires plus volumineux et l'absence de bourrelets dans les prolongements.

À ce stade, les processus dendritiques se sont épaissis et un réseau dense de prolongements axonaux est visible. Une fois maîtrisées, les étapes d'isolement embryonnaire, de dissection corticale, de transfection et de mise en culture de la portée entière de fœtus peuvent être réalisées en deux heures si elles sont effectuées correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de garder à l'esprit que les neurones hippocampiques et corticaux sont très sensibles aux perturbations mécaniques.

En outre, il est important de maintenir les solutions aussi froides que possible pendant l'isolement des neurones afin de réduire l'activité métabolique au minimum. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'imagerie de cellules vivantes et l'enregistrement physiologique de l'activité peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la manière dont les protéines de fusion fluorescentes d'intérêt se répartissent dans différentes régions du neurone. Si la localisation des protéines est associée à des changements de l'activité synaptique, ou comment les fonctions de ces protéines sont affectées par différents traitements pharmacologiques.