Name: Pseudomonas aeruginosa et le biofilm Saccharomyces cerevisiae en cellules à flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 30 s
Description: Découvrez la mise en place d'un système de cellules à flux pour l'analyse de biofilms microbien par microscopie confocale. Cette méthode permet une visualisation haute résolution des communautés de Pseudomonas aeruginosa et Saccharomyces cerevisiae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Assemblée du système de pile de débit avec tous les composants Le système d'écoulement assemblés comprend: tube autoclavable, pièges à bulles, à moyen / déchets de bouteilles et de cellules d'écoulement comme le montre la figure 1. Toutes ces pièces peuvent être réutilisées entre les expériences. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. La configuration du système de flux de cellules (des composantes essentielles de la configuration). Le système de pile de débit se compose de plusieurs éléments: une bouteille moyenne, une pompe péristaltique, pièges à bulles, la cellule d'écoulement, une bouteille de déchets, et diverses sections de tubes interconnectés par différents connecteurs. Figure aimablement fournies par Rune Lyngklip. 2. Assemblée de la cellule de flux <ol><li> La cellule d'écoulement (figure 2a) est traitée avec des voies mince de colle silicone, à l'aide d'une seringue (figure 3). </li><li> Placer une lamelle sur le dessus des lignes de silicone (figure 3). Lamelles de verre sont utilisées comme substrat pour P. aeruginosa alors lamelles en PVC sont appliquées pour S. biofilm cerevisiae. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma de la cellule de flux et 2 piège à bulles. Description détaillée des dimensions utilisées pour la production d'un piège) écoulement à bulles cellules B), DTU biologie des systèmes. Reproduit avec la permission de John Wiley &amp; Sons, Inc (Systèmes DTU biologie était autrefois intitulée BioCentrum, comme illustré dans la figure) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Illustration des lignes de silicone à l'application de la colle pour la fixation du substrat de verre. Le couvercle en verre indiqué est placé sur la colle silicone pour l'attacher à la cellule d'écoulement. <ol start="3"><li> Tournez la cellule de flux et placez sur une surface plane avec le côté lamelle vers le bas. Appuyez doucement sur le dos de la cellule de flux de pousser la lamelle sur la base de la cellule de flux. Tournez la cellule de flux plus et inspecter des zones qui ne sont pas scellées par du silicone. La poignée (piston) partie d'une seringue peut être utilisée comme un outil pour appuyer légèrement sur la cellule de verre et coulent ensemble. </li></ol> 3. Bouteille Medium <ol><li> Placer un tube de silicone d'alimentation (2 mm de diamètre interne) dans une bouteille de moyen et insérer un connecteur direct à l'autre bout. </li><li> Ajouter à moyen et à la bouteille (pour le contenu moyen voir "médias" du paragraphe) Couverture connecteur et une bouteille avec une feuille de métal et autoclaver le milieu. Assurez-vous que l'extrémité du tube d'alimentation est fixé au-dessus du niveau de liquide dans la bouteille à moyen ou un effet de siphon peut vider la bouteille milieu lorsque l'autoclave. </li></ol> 4. Raccordement du piège à bulles flux de cellules, et la pompe Assemblez tous les tubes selon le schéma de la figure 1. Utilisez tube en silicone, sauf pour la partie qui passe par la pompe péristaltique, où tube Marprene est appliquée. <ol><li> Afin de connecter le tube de la bouteille à moyen et à toutes les chambres d'écoulement individuelles, diviser un tube dans le nombre requis d'entrées appliqués à l'expérience. Utilisez des connecteurs en T pour faire le nombre souhaitable de tubes de raccordement du tube d'alimentation dans les tubes Marprene dans la pompe (voir la Figure 1, T-connecteur). Il est généralement une bonne idée de garder la même séquence afin de tubes et de cellules d'écoulement à travers le système, afin de faciliter l'identification des composants en cas de défauts dans le système. </li><li> Connectez chaque tube d'alimentation individuelles (2 mm de diamètre) pour Marprène tubes de la pompe à l'aide de connecteurs droits. Branchez le tube Marprene à un piège à bulles (Figure 2b) via un tube de silicone intermédiaires (1 mm de diamètre). Assurez-vous que la pompe est reliée à l'admission à la partie la plus haute du piège à bulles. </li><li> Connectez le tube de sortie résultant de l'pièges à bulles à l'entrée de la cellule de flux (1 mm de diamètre), assurez-vous que la longueur de ces tubes permet à la cellule de flux pour être déplacé à l'étape du microscope confocal (typiquement de 1 m). </li><li> Placer 5 ml seringues sur le dessus du piège à bulles. Fermer les sommets avec des bouchons adaptés. </li><li> A la sortie de cellule de flux de connecter un court, d'environ 40 mm de pièces (1 mm de diamètre), des tubes et utiliser une «réduction» connecteur droit d'attacher un tube de déchets (2 mm de diamètre) de la longueur nécessaire. Placer les tubes des déchets dans le conteneur à déchets. </li><li> Fait important, le conteneur à déchets doit toujours être placé au même niveau que les cellules d'écoulement, jamais en dessous du débit-Level Cell. Aussi, assurez-vous que l'extrémité de la tubulure de déchets est fixée au-dessus du niveau attendu de déchets liquides pour éviter ras-retour en raison d'un effet de siphon lors de la manipulation des cellules de flux. </li></ol> 5. STERILISATION ET LAVAGE le système d'écoulement <ol><li> Retirer les bouchons piège à bulles et les placer dans de l'éthanol à 70% pour les garder stériles. </li><li> Exécuter à plus grande vitesse de la pompe pour remplir le système avec 0,5% (v / v) d'hypochlorite de sodium dans l'eau. &lt;/ Li&gt; </li><li> Placer le piège à bulles bouchons de retour sur le moment où les pièges à bulles sont complètement remplis. </li><li> Appuyez sur le flux de cellules pour éliminer les bulles dans la chambre d'écoulement. Prenez soin de ne pas endommager le couvercle en verre fragiles. </li><li> Permettre au système de stérilisation pour les 3-4 h à un débit de 3 mL / h / canal (taux de 0,2 mm / s de débit linéaire). </li><li> Laver le système 2-3 fois pour laver tous les hypochlorite. Remplir et vider le système avec de l'eau stérile. Bubble pièges doivent être vidés complètement entre chaque lavage. Cela peut être fait par pompage à l'air jusqu'à pièges à bulles ont été vidés. Après la vidange, enlever les bouchons des pièges à bulles avant de remplir le système. Remplacer bouchons après la bulle de pièges ont été complètement remplis de liquide. Répéter au besoin. </li><li> Faites couler l'eau stérile à travers le système à un débit faible (1-3 ml / h / voie) pendant la nuit ou de procéder à l'étape suivante. </li><li> Connecter la bouteille moyenne à l'entrée et à rincer le système avec des moyennes pendant la nuit à faible débit (3 ml / h / voie) à la température où l'expérience sera réalisée. Remarque: pièges à bulles doit être vidé de l'eau avant que le système est rempli de milieu. </li></ol> 6. INOCULATION DE LA CELLULE DES FLUX <ol><li> De une culture de nuit faire une dilution à une densité optique désirée (par exemple pour P. aeruginosa 0,001 OD 600nm et 600nm pour les 0,1 DO S. cerevisiae). </li><li> Utiliser une seringue de 0,5 ml avec une aiguille 27G à charge d'inoculum assez pour remplir la chambre. 250 uL est suffisante pour les chambres de débit ayant les dimensions spécifiées dans ce travail (figure 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm). </li><li> Arrêter la pompe péristaltique. </li><li> Pince hors du tube en silicone menant à la cellule d'écoulement pour éviter le refoulement dans le système. </li><li> Stériliser le site d'inoculation sur le tube de silicone en l'essuyant avec de l'éthanol à 70%. </li><li> Insérez l'aiguille dans le tube de silicone et d'introduire l'embout dans l'entrée de la cellule d'écoulement. Injecter lentement l'inoculum dans la chambre (attention de ne pas injecter de bulles d'air). </li><li> Retirez l'aiguille et essuyez le site de l'injection d'éthanol à 70%, suivi par scellement immédiat du trou avec de la colle silicone sur le site d'injection. </li><li> Tournez sur la cellule de flux et laissez-les micro-organismes adhèrent au substrat pendant 1 heure sans écoulement à travers la cellule d'écoulement. </li><li> Tourner la cellule d'écoulement, démarrer la pompe moyen (3 mL / h / voie) et prendre la pince hors du tube de silicone. </li><li> Le système est placé en incubation à 37 ° C dans le cas de P. aeruginosa et 30 ° C dans le cas de S. cerevisiae. </li><li> Biofilm dans les chambres d'écoulement peuvent maintenant être visualisés par CLSM. </li></ol> 7. Coloration des BIOFILM POUR MICROSCOPIE <ol><li> Faire une dilution de la coloration appropriée (par exemple 1:1000 Syto 9 vivons taches pour S. cerevisiae) </li><li> Arrêter la pompe péristaltique. </li><li> Pince de tube en silicone menant à la cellule d'écoulement. </li><li> Stériliser site d'inoculation sur le tube de silicone en l'essuyant avec de l'éthanol à 70%. </li><li> Utiliser une seringue de 0,5 ml avec une aiguille 27G pour charger solution de coloration assez pour remplir la chambre. 250 uL est suffisante pour les chambres de flux utilisée ici. </li><li> Insérez l'aiguille dans le tube de silicone et d'introduire l'embout dans l'entrée de la cellule d'écoulement. Injecter lentement la solution de coloration dans la chambre (attention de ne pas injecter des bulles). </li><li> Retirez l'aiguille et essuyez le site de l'injection d'éthanol à 70%, suivi par d'étanchéité immédiate du site d'injection. </li><li> Laisser la cellule de flux sans écoulement pendant 15 minutes. </li><li> Enlever la pince et démarrer le flux (3 ml / h / voie) </li><li> Acquérir des données avec le CLSM </li></ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li>
<li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li>
<li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li>
<li>Haagensen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+distribution+of+colistin-+and+sodium+dodecyl+sulfate-tolerant+cells+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).</li>
<li>Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+bacterial+migration+in+the+development+of+complex+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).</li>
<li>Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells%2C+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li>
<li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li>
<li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+type+IV+pili%2C+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li>
<li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li>
<li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li>
<li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li>
<li>COMSTAT2, a semi-automated java-based quantification program for the analysis of microbial biofilms [Internet]. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.comstat.dk/">http://www.comstat.dk/</a> (2010).</li>
<li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalmer%2C+RJ+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Palmer, J. B. , Springer. 882-900 (2006).</li>
<li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaagensen%2C+JA+%22High+Resolution+Microbial+Single+Cell+Analytics+Advances+in+Biochemical+Engineering+and+Biotechnology%22">High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology</a>. Müller, S., Bley, T. , Springer. (2010).</li>
</ol>

Nous avons démontré un système de cellules d'écoulement qui représente un outil puissant dans les enquêtes de biofilm. Combiné avec l'imagerie 3D par microscopie confocale, le système a une gamme d'avantages en comparaison à d'autres méthodes d'analyse des biofilms microbiens par des moyens plus traditionnels des techniques microscopiques. Ce système permet la visualisation 3D de la vie des communautés microbiennes du biofilm sans perturbation de la communauté. La microscopie optique ne sera pas fournir des informations détaillées sur des niches du biofilm et tandis que la microscopie électronique offre une résolution nanométrique du biofilm, il ne permet pas l'imagerie de cellules vivantes. En utilisant le système d'écoulement décrite canal, nous avons déjà élucidé la distribution spatiale des cellules bactériennes sensibles à plusieurs antibiotiques 5-8 (figure 4a), la distribution des composés extracellulaires, par exemple, l'ADN 9-11 et la distribution des cellules mobiles et non mobiles des la même espèce au sein d'une communauté bactérienne 4,6,9 (figure 4C). Nous prévoyons que le système de la cellule à flux peuvent être utilisées pour étudier les aspects de biofilms levure. Cela peut être la distribution spatio temporelle du biofilm levure en réponse à des facteurs environnementaux tels que les fongicides ainsi que l'identification de gènes impliqués dans le développement du biofilm levure. Bien que la levure n'est pas connue pour se différencier en cellules mobiles et non mobiles, d'autres aspects de la diversification de biofilm peut être des études telles que le changement morphologique des cellules de la levure à pseudohyphal et le passage de cellules diploïdes d'haploïdes. Nous avons montré un système qui se conformer à plusieurs espèces microbiennes et travaillera avec plusieurs techniques de coloration. Une variété de sondes coloration différente et des protéines fluorescentes, comme la GFP, à permettre des enquêtes créneau spécifique dans le biofilm en développement et est un outil efficace dans l'analyse de l'effet des agents antimicrobiens ou d'autres facteurs environnementaux. Les informations qui peuvent être acquises est très détaillé (figure 4) et des fonctionnalités dans le biofilm peut être quantifié avec des programmes informatiques tels que COMSTAT 12,13. Globalement, l'aspect le plus critique de ce protocole est le fait qu'il est un processus fastidieux. Il est aussi une limitation que les cellules doivent être capables de croître sur un non-fluorescents, surface transparente. . Depuis le biofilm formé est analysé à l'aide d'un microscope confocal, la profondeur qui peut être étudié est limité à quelques centaines de micromètres 14 Il ya encore des limitations techniques inhérentes à la conception: le système n'est pas adapté pour le criblage haut débit, comme un chercheur expérimenté peut traiter au maximum d'environ 15 canaux par expérience, ce qui peut prendre plusieurs jours pour se préparer. Toutefois, les antibiotiques ou des mutants qui sont jugées pertinentes pour des études biofilm peut être initialement projeté de masse avec d'autres méthodes telles que la coloration au cristal violet, avant les candidats les plus intéressants sont transférées vers le système cellule d'écoulement. Les feuilles de verre de couverture sont très minces et cassants, et les soins devraient être prises lors de la manipulation des systèmes. En outre, le tube doit être examinée par jour pendant l'exécution d'une expérience; aussi considérable "retour à la croissance» dans les tubes d'entrée juste en amont du flux de cellules peuvent se produire. Une telle contamination peut être résolu en supprimant plusieurs centimètres de tube en silicone du côté entrée des cellules d'écoulement, en utilisant une technique stérile. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 a) 4 jours PAO1 anciens -. Biofilm GFP traitées pendant 24h avec la colistine et l'iodure de propidium pour la coloration de morts (tache rouge) b) présentation en 3D d'une journée de trois anciens P. aeruginosa PAO1 (type P. aeruginosa sauvage) - GFP biofilm 6 c) la présentation d'une image 3D PAO1 - PCP pilA mutant (bleu) avec une PAO1 type sauvage YFP (jaune) d) cinq jours anciens PAO1 - GFP biofilm présenté comme un 3D e photo) 26 h S. cerevisiae (ptr3 mutantes dans CEN.PK fond) biofilms colorés avec Syto-9 15.

<ul><li> Pièges à bulles, le polyéthylène (DTU Systems Biology, Université technique du Danemark, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Setup.aspx%% 20Center/Resources/Biofilm) </li><li> Effacer connecteurs en plastique polypropylène et connecteurs en T (Cole Parmer, 1 / 8 po (3,175 mm) et 1 / 16 po (1,588 mm)) </li><li> Pinces </li><li> Microscope confocal (Zeiss, Meta LSM510) </li><li> Lamelles de verre (Knittel Gläser) 50 x 24 mm </li><li> Lamelles PVC lamelles (Rinzl) 50 x 24 mm </li><li> Des cellules d&#39;écoulement, le polyéthylène (DTU Systems Biology, Université technique du Danemark, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Setup.aspx%% 20Center/Resources/Biofilm </li><li> Bouteilles moyennes (Schott) </li><li> Pompe péristaltique (Watson-Marlow, 205S) </li><li> Rouler panier pour les systèmes de flux et de pompes </li><li> Colle silicone (3M Super scellant au silicone clair) </li><li> Seringue 5 ml (Terumo) </li><li> Syto 9 (Molecular Probes) </li><li> 0,5 ml Seringues avec aiguilles (27G, Terumo LU-100) </li><li> Conteneur à déchets </li></ul> Tuyau: <ul><li> Silicone, 3 mm de diamètre extérieur, 1 mm de diamètre interne (Ole Dich) </li><li> Silicone, 4 mm de diamètre extérieur de 2 mm de diamètre intérieur (Ole Dich) </li><li> Marprène, 3 mm de diamètre extérieur, 1 mm de diamètre interne (Watson-Marlow) </li></ul> Médias <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Moyennes P. aeruginosa </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> FB </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> 1 mL 1 M CaCl 2 </td><td> 0,01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 Les métaux traces ul / L (pour P. aeruginosa-biofilms) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Mélanger A10 et FB dans un rapport de 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter une source de carbone à une concentration souhaitée. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae de synthèse complet (SC) moyenne </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> Sulfate de Adénine </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-tryptophane </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-histidine-HCL </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-arginine HCL </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-méthionine </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-tyrosine </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-leucine </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-isoleucine </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> L-lysine-HCL </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-phénylalanine </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Acide L-aspartique </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-glutamique </td><td> 0,10 </td></tr><tr><td> L-valine </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> L-thréonine </td><td> 0,20 </td></tr><tr><td> L-sérine </td><td> 0,40 </td></tr><tr><td> Levure NitRogen de base w / o des acides aminés et d&#39;ammonium (Bacto) </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> Le sulfate d&#39;ammonium </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6,0 </td></tr><tr><td> L&#39;acide succinique </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> Glucose (autoclave séparément) </td><td> 0,20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa et le biofilm saccharomyces cerevisiae en cellules à flux

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Beaucoup de cellules microbiennes ont la capacité de former des communautés microbiennes sessiles défini comme les biofilms qui ont modifié les propriétés physiologiques et pathologiques par rapport aux micro-organismes vivant en liberté. Les biofilms dans la nature sont souvent difficiles à étudier et résider sous peu les conditions définies 1. En utilisant un substrat transparent, il est possible d&#39;appareil un système où les biofilms simples peuvent être examinées de manière non destructive en temps réel: ici nous montrer le montage et le fonctionnement d&#39;un système modèle de flux de cellules, pour des études in vitro en 3D des biofilms microbiens générant une grande reproductibilité dans des conditions bien définies 2,3. Le système se compose d&#39;une cellule d&#39;écoulement qui sert de chambre de croissance pour le biofilm. La cellule de débit est fourni avec les nutriments et l&#39;oxygène à partir d&#39;un flacon de support via une pompe péristaltique et moyennes passé est recueillie dans un conteneur à déchets. Cette construction du système d&#39;écoulement permet un approvisionnement continu de nutriments et de l&#39;administration d&#39;antibiotiques par exemple avec une perturbation minimale des cellules cultivées dans la chambre d&#39;écoulement. Par ailleurs, les conditions d&#39;écoulement dans la cellule de flux permettent d&#39;études du biofilm exposées à un stress de cisaillement. Une bulle de bulles d&#39;air dispositif de confine de la tubulure qui, autrement, pourrait perturber la structure du biofilm dans la cellule d&#39;écoulement. Le système de pile est compatible avec les flux de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et peut ainsi offrir des informations très détaillées en 3D sur le développement des biofilms microbiens. Les cellules dans le biofilm peut être étiquetée avec des sondes fluorescentes ou des protéines compatibles avec l&#39;analyse CLSM. Cela permet la visualisation en ligne et permet l&#39;étude des niches dans le biofilm en développement. Interrelation microbiens, enquête sur les agents antimicrobiens ou l&#39;expression de gènes spécifiques, sont des configurations de nombreuses expériences qui peuvent être étudiés dans le système de cellule d&#39;écoulement.

Protocole décrivant l&#39;application d&#39;un système de cellule à circulation pour la croissance et l&#39;analyse des biofilms microbiens pour la microscopie confocale à balayage laser (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa et le biofilm Saccharomyces cerevisiae en cellules à flux

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Bonjour, je suis Matt Ma Niton de l’Université technique du Danemark. Bonjour, et je suis Reba de l’Université de Copenhague. Nous travaillons sur les biofilms de levures et de bactéries dans les systèmes de cellules à flux Et dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment mettre en place un système de cellules à flux et visualiser le biofilm par micro convertible.Devrions-nous le faire maintenant ? Oui, bien sûr. Allons-y.Collage des cellules d’écoulement. Les cellules d’écoulement sont situées entre le piège à bulles et la bouteille à déchets. Nous allons maintenant vous montrer comment l’attacher.Il s’agit de la strate de la cellule d’écoulement. Cela se fait par les différents composants que vous voyez sur la table. Un embout de 200 microlitres est coupé en deux morceaux.La partie mince est maintenant insérée dans une seringue, qui deviendra l’outil parfait pour appliquer de fines lignes de silicium. Afin de coller le verre de stratum à la cellule d’écoulement, poussez l’embout fin hors de la seringue. Maintenant, afin de faciliter l’application du silicium à la base de la cellule d’écoulement, coupez la partie la plus externe de l’embout, retirez le piston et appliquez une quantité appropriée de silicium dans la seringue.Remettez le piston dans la seringue et poussez un peu de silicone afin de vous assurer que toutes les bulles ont disparu. Commencez maintenant à appliquer de fines lignes de silicium sur la cellule d’écoulement. Essayez de faire des lignes de silicium lisses et ininterrompues vers la cellule d’écoulement.Cela garantira que le silicium se fixera uniformément au substrat lors de l’application de silicone dans la direction opposée. Assurez-vous de ne pas rayer les lignes déjà faites, mais essayez de soulever doucement la pointe au fur et à mesure, et de cette façon, vous vous assurerez qu’aucune ouverture dans les lignes de silicium n’entraînera de fuites entre les chambres ou de la cellule d’écoulement. Prenez un verre de protection et placez-le doucement sur les lignes de silicium de la cellule d’écoulement.Comme on le voit ici, le verre de protection collera facilement à la colle silicone. Retournez la cellule d’écoulement et appuyez doucement sur l’arrière de la cellule d’écoulement avec vos doigts. Cela garantira que le verre de couverture se fixera de manière plane en fonction de la surface plane de la table.Maintenant, pour faire une étanchéité parfaite ou pour essayer de corriger les zones de descellement, appuyez doucement avec un instrument comme un piston d’une seringue. Faites-le très soigneusement. En tant que couverture, le verre peut facilement se briser.En faisant cela, vous serez en mesure de faire une étanchéité encore meilleure et vous serez probablement en mesure de corriger éventuellement les zones gênantes pour éviter les fuites lors de l’inspection des cellules d’écoulement. Afin de réussir l’expérience, il est important d’inspecter vos cellules d’écoulement une fois que le silicium s’est solidifié. Ici, nous montrons une cellule d’écoulement avec une étanchéité imparfaite, ce qui entraînera sans aucun doute des fuites, l’assemblage des pièges à bulles et la fixation des tubes.Les pièges à bulles sont situés entre la pompe et les cellules d’écoulement. Nous montrons ici les différents composants pour l’utilisation des pièges à bulles bio DTU. Ils sont fabriqués de manière à ce que les bulles soient piégées dans le système et que seuls les fluides sans bulles pénètrent dans les cellules d’écoulement.Des seringues de cinq millilitres sont placées au-dessus de chacune des buses spéciales. Sur le piège à bulles, une étanchéité est assurée par les anciens anneaux. Sur chaque buse, placez un capuchon sur chacune des seringues.Maintenant, comme il s’agira de la connexion pour les cellules d’écoulement, assurez-vous de fixer les longs tubes pour que la cellule d’écoulement puisse atteindre un microscope confocal. Ces tubes doivent être fixés aux pièges à bulles où le rebord inférieur de la buse a sa sortie. Comme le rebord d’entrée dans le piège à bulles est plus haut que le rebord de sortie, les bulles ne peuvent pas sortir de la seringue et pénétrer dans la fixation de la cellule d’écoulement des cellules d’écoulement aux pièges à bulles.Les cellules d’écoulement sont situées entre les pièges à bulles et la bouteille à déchets. Ici, il est nécessaire d’avoir de longs tubes pour que la cellule d’écoulement atteigne le microscope confocal. Encore une fois, assurez-vous de connecter le flowal du bon côté du piège à bulles. Ici.Remarquez les longs tubes menant à l’écoulement du piège à bulles. Cela peut bien sûr varier en fonction de la construction d’une configuration. Fixez maintenant fermement tous les tubes à la cellule d’écoulement Ensemble du système Pièges à bulles à la pompe et aux connecteurs en T.Pour les tubes d’alimentation en média. Pour la pompe péristaltique, nous utilisons les tubes RIN. Ce type spécifique de tubes est capable de résister à la pression mécanique de la pompe.Installez un tube pour chacune des chambres de vos cellules d’écoulement. Ici, nous allons maintenant montrer comment les tubes allant de la bouteille de média à la pompe sont assemblés. Coupez le tube en silicone en morceaux de taille appropriée et connectez-les avec les connecteurs en T.Assemblez les tubes de manière à ce qu’il y ait un raccord pour chacun des tubes de cerveau de la pompe. Assurez-vous de faire un tube pour chacune des chambres de la cellule d’écoulement. Essayez de rendre vos tubes aussi courts que possible pour avoir une vue d’ensemble plus facile de vos connexions.Maintenant, à partir du tube d’alimentation central fixé sur les connecteurs en T, des tubes courts peuvent être fixés aux tubes ING de la pompe. Assurez-vous que les tubes en silicone sont bien fixés aux connecteurs. Maintenant, avec les tubes d’alimentation en média sur le côté gauche de la pompe, nous allons maintenant fixer le reste du système à la pompe.Voici les tubes allant aux plateaux à bulles qui sont fixés aux tubes de rine sur la pompe. Encore une fois, ici, vous allez alléger la vue d’ensemble de votre expérience. Si vous savez quels tubes vont à quel raccord dans la pompe, la longueur de ces tubes n’est pas aussi cruciale que les tubes de l’autre côté du piège à bulles.En conduisant les médias aux cellules d’écoulement, nous vous avons maintenant montré comment assembler avec succès un système avec un piège à bulles et une cellule d’écoulement sur le point de sortie de la cellule d’écoulement. Nous avons des tubes connectés qui sont assez longs pour aller dans un conteneur à déchets stérilisation du système afin de stériliser le système, faire une solution 0,5 de chlorhydrate de sodium. Placez les tubes d’alimentation de la pompe dans la solution de chlorhydrate.À ce stade, il est extrêmement important de remplir l’ensemble du système avec la solution de chlorhydrate. Permet aux seringues des pièges à bulles de se remplir totalement de chlorhydrate lorsqu’elles sont remplies, remettez les bouchons, qui entre-temps auraient dû être placés dans de l’éthanol. Une étape importante dans la stérilisation du système est l’élimination des bulles des cellules d’écoulement.De telles bulles peuvent facilement être observées dans les cellules d’écoulement illustrées ici, mais le grand succès de l’élimination des bulles fait tourner la pompe à ses plus hauts tours par minute. Cela conduira à un débit de liquide plus élevé dans les cellules d’écoulement, ce qui, avec le temps, aidera à se débarrasser des bulles, à soulever la cellule d’écoulement et à soulever les tubes menant à la cellule d’écoulement et à tapoter fermement la cellule d’écoulement sur la table pour desserrer les bulles afin de les évacuer. Avec l’écoulement du liquide, cette procédure prendra parfois beaucoup de temps, mais vous pourrez ainsi vous débarrasser des bulles.Si vous êtes un patient, laissez les cellules d’écoulement stérilisées pendant trois à quatre heures à un débit d’environ 0,2 millimètre par seconde. Laver le système d’abord dans le système en permettant à l’air de pousser le chlorhydrate hors de l’ensemble du système. Comme le système a maintenant été vidé du chlorhydrate, placez le tube d’alimentation central dans une bouteille d’eau stérile et couvrez le haut.Le système doit maintenant être lavé deux à trois fois en remplissant un vide dans le système avec de l’eau stérile, en connectant le fluide et en saturant les tubes pendant la nuit. Lors du raccordement de la bulle de média au système, le système doit être vidé de l’eau. Comme pour l’hypochlorate, remplissez la poubelle à bulles avec un média avant de remettre les bouchons.Lors de la connexion du support, faites très attention à ce que tout reste stérile. Ayez de l’éthanol prêt sur le côté au point de connexion. Placez les deux tubes dans l’éthanol juste avant de connecter les tubes.Maintenant que le milieu est fixé au système, il est prêt pour la saturation ou l’inoculation pendant la nuit. En fonction du choix du média inoculant la cellule d’écoulement. Dans les cellules DTU bio flow, vous disposez de trois sites d’inoculation pour les trois chambres de croissance individuelles.La première chose à faire est de stériliser le site d’inoculation à partir d’une culture de nuit. Faites allusion pour atteindre la densité optique souhaitée. Utilisez une seringue de 500 microlitres avec une aiguille de 27 G pour inoculer l’échantillon.Un inoculum de 250 microlitres est suffisant pour les cellules DTU bio flow. Maintenant, le site d’inoculation est essuyé avec le balayage net d’éthanol et le côté d’inoculation est fermé avec de la colle de silicone. Retournez maintenant la cellule d’écoulement et laissez-la dans cette position pendant une heure sans aucun flux de fluide.Une fois que la cellule d’écoulement a été renversée pendant une heure, retirez la palourde et démarrez l’écoulement du fluide et placez à nouveau une cellule d’écoulement en position retournée. Démarrez maintenant l’incubation du système. Le temps d’incubation et le choix de la température varient selon les choix, les souches et les configurations expérimentales, la coloration d’un biofilm de levure et la visualisation par microscopie confocale à balayage laser.Afin de visualiser le biofilm de levure avec un microscope confocal, nous le colorons avec la coloration d’acide nucléique fluorescente verte CY nine. Ici, nous utilisons une dilution de un à mille. Tout d’abord, les tubes menant aux pièges à bulles à partir des cellules d’écoulement sont retirés.Cela empêchera le reflux de l’écoulement pendant la procédure de coloration. Arrêtez maintenant le flux de fluide vers le piège à bulles. Utilisez une seringue de 500 microlitres pour l’inoculation afin d’injecter le colorant cyto nine dans la chambre d’écoulement.Encore une fois, utilisez une lingette à l’éthanol pour stériliser le site d’inoculation. Injectez 250 microlitres dans la chambre ici. Soyez très prudent et doux.Lors de l’inoculation, la vitesse d’inoculation doit être très faible afin de ne pas perturber le biofilm. Fermez le trou d’inoculation avec de la colle silicone. Laissez la coloration se déposer pendant 15 minutes sans couler.Retirez la pince et redémarrez le flux. Vous êtes maintenant prêt pour l’analyse du biofilm coloré. Avec la microscopie confocale à balayage laser, les cellules d’écoulement sont dotées de rebords spéciaux qui permettent de les placer dans les supports sur la platine du microscope.Lorsque la cellule d’écoulement est placée dans la platine du microscope, une goutte d’huile est placée sur le verre de la strate. Pour utiliser l’objectif à immersion dans l’huile, allumez la lumière blanche et abaissez l’objectif pour qu’il entre en contact avec l’huile et localise les cellules dans la chambre. Soyez prudent si vous utilisez un verre de stratum car il peut facilement se casser.Ici, nous montrons un biofilm de levure vu avec la lumière blanche au microscope. Lorsque la lumière fluorescente est allumée, on peut facilement voir la coloration cyto nine des cellules. La coloration cyto nine permettra désormais de scanner le biofilm avec un microscope confocal.Pour une analyse plus approfondie avec le logiciel Amer, localisez la position d’intérêt dans la chambre d’écoulement à l’aide du microscope. N’oubliez pas de prendre en compte les différents environnements qui se génèrent au fil du temps au sein de la chambre d’écoulement. Lorsque vous choisissez un emplacement, basculez maintenant le microscope de la visualisation oculaire à la visualisation laser à balayage.Avec le logiciel LM, commencez maintenant à appliquer les paramètres de décision pour la numérisation de vos échantillons. Un balayage rapide de vos échantillons vous donnera une indication de la composition structurelle du biofilm dans les chambres de croissance. Avant de commencer le balayage haute résolution qui prend plus de temps, nous avons dit : quelle est la première et quelle est la dernière position du balayage, et donc quelle sera la taille de la pile.Nous sommes en mesure de balayer les différentes fréquences grâce aux différents lasers installés dans le microscope. Cela permettra d’étudier de nombreuses sous-populations différentes. Ici, nous voyons le biofilm de levure à neuf taches vertes présenté dans la fenêtre à partir des longueurs d’onde spécifiques utilisées.Chacune des piles de balayage peut désormais être analysée dans les logiciels comme des erreurs.

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce document décrit les différentes méthodes de plus en...

Co-culture des modèles Pseudomonas aeruginosa Les biofilms Cultivé sur le Live cellules des voies respiratoires de l&#39;homme

Le test décrit un moyen rapide pour mesurer la formation de biofilm au début de bactéries et de champignons. Cette méthode utilise une plaque de microtitration comme substrat pour la formation de biofilms microbiens et le biofilm est visualisée en utilisant la souche de cristal violet. Le test fournit soit un test qualitatif ou quantitatif pour la formation de biofilm tôt.

Plaque de microtitrage biofilm essai de formation

Les biofilms ont des interactions complexes avec leur environnement. Pour étudier de manière exhaustive les interactions biofilm-environnement, nous présentons ici une série de méthodes permettant de créer un environnement chimique hétérogène pour le développement de biofilms, de quantifier la vitesse d’écoulement locale et d’analyser le transport de masse dans et autour des colonies de biofilms.

Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

La microrhéologie de suivi des particules étudie la viscoélasticité des matériaux. Ici, la technique est utilisée pour déterminer la viscoélasticité, la conformité au fluage et les rôles de réticulation efficaces de différents composants matriciels d’un biofilm bactérien. La matrice est constituée de substances polymères sécrétées par les bactéries et ses composants déterminent la structure du biofilm et les propriétés mécaniques.

En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

Ce protocole décrit l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisées personnalisables pour visualiser la formation de biofilms de Candida albicans dans des conditions physiologiques hôte.

Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Nous décrivons le montage, exploitation, et le nettoyage d’un appareil à débit conçu pour la formation de biofilms fongiques d’image en temps réel sous flux. Nous également fournissons et discuter des algorithmes quantitatifs pour être utilisé sur les images acquises.

Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases

Nous décrivons ici l’utilisation d’un bioréacteur de microfluidique un débit plus élevé couplé avec un microscope à fluorescence pour l’analyse des effets de la contrainte de cisaillement sur les biofilms de Pseudomonas aeruginosa exprimant des protéines fluorescentes vertes, y compris les instruments mettre en place, la détermination des propriétés morphologiques, taux de croissance et couverture de biofilm.

Cellule analyse de contrainte de cisaillement en direct sur Pseudomonas aeruginosa en utilisant un système automatisé de microfluidique de débit supérieur

Ce protocole présente une méthodologie pour effectuer des mesures de la croissance du biofilm et de la biomasse à l’aide de dispositifs de plaque de PCR de puits profonds auto-assemblés pour le criblage statique de biofilm à couvercle fixe à 96 puits à haut débit.

Génération d’une plus grande biomasse de biofilm bactérien à l’aide de dispositifs de microplaques de puits profonds à plaques PCR

Cette méthodologie permet d’établir un modèle de biofilm polymicrobien dans la mucoviscidose pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens dans les laboratoires de recherche et cliniques. Ce modèle fournit des résultats précis et fiables sur une gamme de sorties.

Développement d’un modèle de biofilm de colonie polymicrobienne pour tester les antimicrobiens dans la mucoviscidose

Cette étude décrit un cadre pour l’élaboration d’un modèle de biofilm polymicrobien agrégé et l’optimisation d’un protocole d’extraction d’ARN afin d’évaluer l’expression du gène Pseudomonas aeruginosa reflétant l’environnement pulmonaire de la fibrose kystique. Les applications comprennent l’évaluation des effets antimicrobiens et l’étude d’alternatives antibiotiques dans des conditions pertinentes pour la fibrose kystique.

Modèle de biofilm agrégé de fibrose kystique pour étudier l’expression génique liée à l’infection

Découvrez la mise en place d'un système de cellules à flux pour l'analyse de biofilms microbien par microscopie confocale. Cette méthode permet une visualisation haute résolution des communautés de Pseudomonas aeruginosa et Saccharomyces cerevisiae.

Pseudomonas aeruginosa et le biofilm Saccharomyces cerevisiae en cellules à flux

Explorer plus de vidéos